黄曲霉毒素的检测及防控

1、Analysis and Control of Aflatoxinsl黄曲霉毒素的概述l黄曲霉毒素的国际限量要求l黄曲霉毒素的检测l黄曲霉毒素污染的预防和控制l山东局技术中心黄曲霉毒素实验室l输欧花生黄曲霉毒素实验室检测l黄曲霉毒素的研究历史l黄曲霉毒素的毒理作用l黄曲霉毒素的产生l黄曲霉毒素的分布l黄曲霉毒素的化学性质l1960年, 英国10万只火鸡死亡事件揭开了人们对于黄曲霉毒素的认识与研究。l火鸡的死亡与饲料中含有较高浓度的黄曲霉毒素有关。l用这种饲料（花生粉）对动物进行急性毒理实验后，证明具有强毒性。对大白鼠进行长期的慢性中毒实验后，成功地诱发了肝癌。l对毒饲料进行提取，得到了黄曲霉毒

2、素。l在随后的几十年中，黄曲霉毒素得到了科学界的高度重视。 黄曲霉毒素是潜在的肝脏毒素。当大剂量摄入这些毒素时可能是致命的。亚致死剂量会导致慢性中毒，而低剂量的长期接触则会致癌，特别是导致肝癌。通常，动物幼仔比成年动物更加容易遭受黄曲霉毒素的毒害。 黄曲霉毒素引起了人们对健康最强烈的关注，是因为其广泛分布于一些食物诸如花生、坚果、牛奶、玉米中，同时也是人类潜在的致癌原。l黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生曲霉等在代谢过程中产生。l黄曲霉毒素产生的条件：菌株的产毒能力、适宜的湿度（80%-90%相对湿度和基质的含水量）、温度（24-30度）、氧气（1%以上）、培养时间、机械损伤、昆虫损害等。l黄曲霉毒

3、素B1、B2、G1、G2大多分布在农产品中，常见的有花生、玉米、棉籽、芝麻、杏仁、辣椒等。l黄曲霉毒素M1分布在牛奶及奶制品中。l在哺乳动物的肝脏与尿中发现了黄曲霉毒素P1和Q1。l黄曲霉毒素是结果相近的一群衍生物。化学结构式为二呋喃环和香豆素。在紫外线下，黄曲霉毒素B1、B2发兰色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光。l黄曲霉毒素的分解温度为237-299度，一般加热不能破坏其毒性。l在有氧条件下，紫外线照射可去毒。l难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中较稳定，在强碱溶液下易分解黄曲霉黄曲霉毒素毒素 B B1 1同肝细胞同肝细胞

4、DNADNA的鸟嘌的鸟嘌呤碱基结合，使得控制细胞呤碱基结合，使得控制细胞生长的基因代码发生错误，从而使生长的基因代码发生错误，从而使细胞生长失控，成为癌性肿瘤细胞生长失控，成为癌性肿瘤。花生(未加工): 黄曲霉毒素总量 15ppb牛奶: 黄曲霉毒素M1 0.5ppb黄曲霉毒素B1/总量花生、坚果、干果： 2/4ppb花生（进一步挑选等）：8/15ppb坚果、干果（进一步挑选）：5/10ppb谷物及加工产品：2/4ppb各种调味品：5/10ppbl黄曲霉毒素总量：花生：15ppbl所有食品： 黄曲霉毒素总量 20ppbl玉米、花生、花生油、坚果等 B1不得超过20ppb。l大米、其他食用油等B1

5、不得超过10ppb。l其它粮食（麦类、面粉、薯干）、发酵食品（酱油、醋等）、淀粉类制品（糕点、饼干、面包等） B1不得超过5ppb。l牛奶及其制品中M1不得超过0.5ppb。 黄曲霉毒素的检测，从广义上，包括：采样、制样和检测三个过程。l黄曲霉毒素的检测一直是困扰世界各国的难题。原因：不均匀分布；ppb水平采采 样样样品制备样品制备/ /分样分样分析检测分析检测目的：得到一个有代表性的样品困难：1）分布不均匀 2）ppb水平办法：尽量加大采样点和采样量，使货物的每个部位都有同等的机会被抽到。均匀分布（如蛋白质） 不均匀分布（黄曲霉毒素） 所谓“ppb” 1，000，000，000中的1分子 3

6、2年中的1秒 地球至月球总距离中的40cm 22公斤沙子中的1粒 3.5车厢中的1粒玉米 集装箱样品小样检测100%总误差88%采样误差10%制样误差2%检测误差Whitaker Dicken，1974针对卡车或拖车装载玉米的取样方式针对卡车或拖车装载玉米的取样方式:第一次取样的位点标记为第一次取样的位点标记为 “O”. 如果需要更多的样品，应在标记为如果需要更多的样品，应在标记为 “X”的位点再次取样的位点再次取样从卡车中的取样量从卡车中的取样量由于分布不均匀由于分布不均匀可能检测到的结果范围可能检测到的结果范围4.50 kg2.25 kg1.00 kg0.45 kg11.6 - 28.4

7、ppb 8.1 - 31.9 ppb 3.2 - 38.8 ppb 0 - 46.9 ppb* 95% confidence range一卡车玉米中有一卡车玉米中有20ppb黄曲霉毒素的污染黄曲霉毒素的污染目的：将样品充分粉碎、均质化，为下一步检测做准备办法：使用高效粉碎机，粉碎最终直径小于2mm制样误差约占总误差的10%提取extraction净化purification分析analysis分析程序 - 提取 使用甲醇使用甲醇/ /水或乙腈水或乙腈/ /水混合液萃取研磨样品水混合液萃取研磨样品使用搅拌机使用搅拌机(2-5 Minutes)(2-5 Minutes)或震荡仪或震荡仪(30-18

8、0 Minutes)(30-180 Minutes)震荡萃取液震荡萃取液. .样品液数量与溶剂数量存在最样品液数量与溶剂数量存在最 佳比例。佳比例。注意所使用的有毒溶剂对健康注意所使用的有毒溶剂对健康的损害及污染的损害及污染l净化是指去除提取液中的杂质（如脂肪、蛋白质、色素等），以避免对黄曲霉毒素的检测造成干扰。免疫亲和柱 (IAC)净化固相萃取柱（SPE）净化液-液萃取其他快速筛选法： 荧光光度计法 ELISA法确证方法： HPLC-FLD法l原理：紫外线照射后，黄曲霉毒素能发射特征荧光l优点：l1、操作简便、安全l2、检测限小于2ppbl缺点：有假阳性的存在l原理：利用抗原抗体反应并由酶催

9、化底物产生颜色进行定量的分析方法l优点：l1、操作简便、成本较低 2、有些商品化的试剂盒检测限能达到1ppb 缺点：有假阳性的存在l经过筛选方法检测的样品，可以继续通过基准方法进一步确证黄曲霉毒素的存在，并进行更加准确的定量检测。min01234567LU 323436384042444648 FLD1 A, Ex=365, Em=440 (ROME3.12SAMPLE11.D) AFTG2 AFTG1 AFTB2 AFTB1l预防 preventionl采样 sampling l样品制备 sample preparationl样品提取 extractionl测试需求评价 evaluation

10、 of testing requirementsl检测 testingl结果确证 result validationl文本化 documentationl供货方介入 supplier involvementl去毒 removal 1. A professional Mycotoxin laboratory. 一个专业化的官方实验室一个专业化的官方实验室 2. A long history to detect Aflatoxin. 检测黄曲霉毒素历史悠久检测黄曲霉毒素历史悠久& Introduction1.Use biology method since 1970s.2.Use TLC

11、method since 1980s.3.Use HPLC method since 1990sHPLC-MS/MSCerealsMulti-mycotoxinBio-method / ELISASea foodsDSP/PSPHPLC-FLD/ELISACerealsT-2 toxinHPLC-FLDCorn, cerealsZearalenoneHPLC-UVCereals DeoxynivalenolHPLC-UVApple juicePatulinHPLC-FLDMilk, milk powderAflatoxin M1IAC/PCD/HPLC-FLDPeanut, corn, cer

12、ealsAflatoxinMethodCommodity Parameter & 生物毒素检测业务生物毒素检测业务STCIQ is accredited by China national accreditation service for Conformity Assessment (CNAS) and operated in accordance with ISO/IEC 17025:2005 (E) General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.时间Date轮次号FA

13、PAS Series and RoundAFB1 z-scoreTotal AF z-score2001.11Series 4 Round 39-0.5-0.22002.10Series 4 Round 470.70.72003.7Series 4 Round 56-0.7-0.52004.9Series 4 Round 67-0.4-0.42005.8FAPAS 04790.80.92006.4FAPAS 04880.80.8l时间时间 : 2002年年lAnalyse: 花生酱中的黄花生酱中的黄曲霉毒素曲霉毒素l组织者组织者: CCIBLAC l轮次轮次 : 国认实函国认实函200117号

14、号l参加实验室数参加实验室数 : 63 l时间时间 : 2005lAnalyse: 花生酱中的黄花生酱中的黄曲霉毒素曲霉毒素l组织者组织者: 国家食品安全国家食品安全局局lRound: 质检食函质检食函2005082号号l参加实验室数参加实验室数 : 15 l日期日期: 2005lAnalyse: Aflatoxin Analysis in Peanut pastel组织者组织者: 山东局山东局lRound: 鲁检便食字第鲁检便食字第077号号lAttended Laboratory Number : 52lDate: 2006(on going)lAnalyse: Aflatoxin Ana

15、lysis in Peanut pastelSponsor: CNASlRound: CANS T0339lAttended Laboratory Number : 74lDate: 2006lAnalyse: Aflatoxin Analysis in Peanut pastelSponsor: 山东局山东局lRound:lAttended Laboratory Number : 89l 接样接样 Sample receive l 样品登记样品登记 Sample registerl 样品制备样品制备 Sample preparationl 净化净化 Sample clean upl 测定测定

16、 Sample HPLC determinationl 报告报告 Reportl 留样、记录留样、记录 Reserve samples and recordsIs it sealed ?Is it clearly labelled ?Is it weigh about 30kg ?Sample receive (2)样品登记样品登记Samples must be Thoroughly mixed before divided into three Sub-samples1、样品制备过程： 定期进行样品均匀性核查2、实验室检测过程： 日常检测采用加标回收和质控样品 加标回收 质控样品3、每年参加

17、国际间实验室能力验证活动1、 方法的检出限（方法的检出限（LOD）2、方法的检测限（、方法的检测限（LOQ）3、 回收率（回收率（Recovery）4、 不确定度（不确定度（ Uncertainty）l针对GB/T 18979-2003方法l检出限是0.3ppb，检测限是1.0ppb 报告的三种情况： 未检出： 低于检出限 1.0 ppb ：检出了，但不能准确定量 实际值： 能准确定量 l检测结果与真实值Recovery（100%）= 检测结果 / 真实值如何得到真实值？1）购买有证样品（质控样品）2）空白添加已知浓度的标样 （质控样品）将待测样品与质控样品同批检测，计算回收率。l样品1与质控样品（样品A）同批检测，样品A的实际值为2.0ppb。l结果：样品1的检