生物素-亲和素标记技术完整讲解

1、生物素-亲和素标记技术 第一组 一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景一 背景生物素：又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。 1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为“生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生素。 二 原理 20世纪60年代初发现了生物素(biontin，B)和卵白素(avidin

2、，A)，其亲和力至少比抗原-抗体结合力高百万倍，是目前发现的自然界中具有最强亲和力的物质。 每个每个 分子由分子由4个亚基组成，可以和个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂。一个抗体分子可偶联数十个生物素或亲和素分子，而亲和素或生物素分子又可与酶或荧光素结合，从而组成一个生物放大系统，显著提高检测的灵敏度。常用的有亲和素-生物素标记法(Labeled avidinbiotin，LAB)、亲和素-生物素桥法(bridged avidinbiotin, BAB)和亲

3、和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidinbiotinperoxid ase complex，ABC)。 生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。三 实验方法及步骤生物素-亲和素

4、标记技术的主要方法 ：（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法）（3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） 桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直接法和间接法，直接法是以游离的亲和素(或链霉亲和素)作为桥联剂，利用亲和素的多价性，将生物素化抗体复合物与标记生物素(如酶标生物素)联结起来，达到检测反应分子的目的。间接法则是在抗原与特异性抗体结合反应后，再用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合，从而使灵敏度进一步提高。由于生物素化抗体分子上连

5、有多个生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲和素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子。加入相应酶作用底物后，会产生强烈的酶促反应，提高检测灵敏度。Smith K A5利用间接BAB法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，其灵敏度比常规ELISA高1 000多倍。酶联免疫吸附试验（ELISA）步骤（间接法）1 包被抗原2 洗涤3 待测血清（抗体）4 洗涤5 酶标二抗6 洗涤7 显示物A、B8 加终止液 (H2SO4) 酶标板 桥-亲和素-生物素标记（BAB法）步骤间接法步骤：1包被抗原2洗涤3待测抗体4洗涤5生物素标二抗6洗涤7加亲和素8洗涤9加酶标生物素10洗涤11加底物12显色后加终止

6、液直接法步骤（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法） 即亲和素即亲和素- -生物素生物素- -过氧化物酶法过氧化物酶法(avidin-biotin complex (avidin-biotin complex technologytechnology，ABC)ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素，其原理是预先按一定比例将亲和素( (或链霉亲和或链霉亲和素素) )与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素( (或链霉亲和素或链霉亲和素)-)-生物素生物素- -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生

7、物素化一抗（直接直接法法）或生物素化二抗（）或生物素化二抗（间接法间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素）相遇时，复合物中未饱和的亲和素( (或链霉亲和素或链霉亲和素) )结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素- -生生物素物素- -过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过其生物素连接多个亲和素其生物素连接多个亲和素( (或链霉亲和素或链霉亲和素) )分子，一个亲和素分子，一个亲和素( (或链霉或链霉亲和素亲和素) )分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大分子又可桥联

8、多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABCABC法背景染色淡，法背景染色淡，方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。+ABCB-E + A ABCAb-Ag-Ab-B + ABC Ab-Ag-Ab-B-ABC 直接法：直接法： 直接法 间接法（3）标记生物素-抗生物素法 标记亲和素-生物素法(labeled avidi

9、n-biotin，LAB)直接法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接与免疫复合物中的生物素化一抗连接进行酶呈色反应，间接法是采用生物素化的二抗和抗原结合，由于加入了二抗，较直接法检测灵敏度要高，对免疫细胞中免疫球蛋白的定位具有特异性。LAB法需以生物素标记一抗，应用不如ABC法普遍，与ABC法相比，LAB法操作较简单，但灵敏度较低 四 应用 1 在免疫学中的应用 免疫荧光技术中的应用 免疫放射技术中的应用 胶体金技术中的应用 免疫酶技术中的应用 ELISA中的应用 2在分子生物学中的应用 3在组织化学中的应用 4 在分离纯化中的应用（亲和层析）4.1在免疫学中的应用4.1.1在免疫荧光技术中的应

10、用在免疫荧光技术中的应用 BAS应用于免疫荧光分析(fluorescence immunoassay，FIA)技术，可用荧光素直接标记亲和素(或链霉亲和素)或采用游离亲和素(或链霉亲和素)搭桥，两端分别连接生物素和荧光素。与常规荧光抗体法或单独的BAS标记法相比，BAS标记法结合荧光抗体技术可明显地提高检测的灵敏度和特异性。张锦明等用99Tcm替代111In标记BAS在肿瘤放免显像预定位DTPA-生物素溶液，结果测得99Tcm-DTPA-生物素的标记率大于90%。4.1.2 在免疫放射技术中的应用在免疫放射技术中的应用 BAS与免疫放射分析(immunoradiometric analysis

11、，IRMA)方法偶联，先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原(标准抗原和待测抗体)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物，再用放射性同位素标记的亲和素(或链霉亲和素)与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大。李贵平等用153Sm标记BAS，再标记抗CEA 单抗，最后在结肠癌裸鼠模型中进行显像和体内分布测定，结果肿瘤显像时间大大缩短。郝君等采用生物素-磁珠富集微卫星，与传统放射性同位素杂交法相结合，构建筛选大黄鱼的微卫星文库。 4.1.3在胶体金技术中的应用 BAS应用于胶体金技术，其原理为带正电荷的链霉亲和素标记的带负电荷的胶体金颗粒能与生物素紧密结合，使检测信号在只

12、有胶体金标记或只有BAS标记的基础上得到扩大。吕丰等应用石英晶体微天平(QCM)研究了基于BAS的葡萄糖氧化酶的固定化，结果在利用BAS固定过的葡萄糖氧化酶过程中，经过纳米金颗粒修饰的QCM基片对酶的吸附量比未经修饰的基片多。张志锋等以组装型金磁微粒和氨基末端磁性微粒为载体分别通过物理吸附和共价作用制备两种链亲和素-磁性微粒，其具有较高的游离生物素结合容量以及较高的生物素标记寡核苷酸的结合能力。 4.1.4 在免疫酶技术中的应用 BAS应用于免疫酶技术，通过生物素-亲和素将免疫复合物与辣根过氧化物酶连接起来，形成免疫酶-生物素-亲和素法。赵金富等用合成的雌三醇-生物素复合物(E3-Biotin

13、)结合辣根过氧化物酶标记的亲合素(HRP-Avidin)作为免疫分析探针测定血清中的雌三醇。结果表明，具有很高的灵敏度、稳定性、重现性和抗非特异性吸附干扰的能力。魏孔吉等建立了可用于快速、灵敏地检测双酚A的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法，样品处理简单，结果满意。宋晓荣等用酯化生物素标记N15C，辣根过氧化物酶标记N16D，检测cTnT，检测灵敏度为1.0 g/L，特异性高。 4.1.5在ELISA中的应用 用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体，然后连接亲和素-酶结合物(BA-ELISA)、或亲和素及酶标生物素(BAB-ELISA)或ABC试剂(ABC-ELISA)，从而使反应信

14、号放大，提高检测的灵敏度。王传彬等用生物素标记的纯化抗禽流感病毒H5亚型血凝素单抗和酶标亲和素检测H1、H15亚型AIV标准毒株和H5、H7、H9亚型AIV分离株，与血凝和血凝抑制试验比较，纯化后的单抗具有良好的反应活性。祝军等将BA-辣根过氧化物酶复合物系统ELISA策略，对ANEP寡核苷酸适配子的亲合力进行测定。 4.2 在分子生物学中的应用 BAS在分子生物学领域中的应用日渐增多，目前主要集中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测以及将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测等方面。自从合成了生物素化的脱氧三磷酸脲苷(dUTP)和UTP等核苷酸单抗以来

15、，以生物素化多核苷酸为探针的核酸杂交技术有了很大发展，常用于Southern、Northern和原位杂交等。试验时，标记探针先与细胞或染色体原位(或是固定在乙酸纤维素膜上)的变形核酸分子进行杂交，然后用偶联了酶或荧光物质的亲和素(或链霉亲和素)识别杂交互补片段，使其显色或产生荧光，这种技术克服了放射性核酸探针标记与检测的缺点，应用潜力很大。4.2 在分子生物学中的应用 不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针;基因组DN

16、A结构功能的研究4.2 在分子生物学中的应用 高浓度引物低浓度引物不对称PCR Southern 印迹杂交印迹杂交4.2 在分子生物学中的应用分子分子杂交的基本类型 固相杂交固相杂交 液相杂交液相杂交 原位杂交原位杂交 基因芯片基因芯片4.2 在分子生物学中的应用分子杂交的基本类型液相杂交液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、时间等）进行杂交，然后再将未、温度、时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分子。子。4.2

17、在分子生物学中的应用液相杂交液相杂交4.2 在分子生物学中的应用4.3 在组织化学中的应用 将混有亲和素和生物素的染料浓聚于靶细胞表面，能使细胞与染料更好的结合，最大优点为精确度被提高，结果简单易测，更利于靶细胞结构的观察。张志强等应用ABC法对赤链蛇消化道5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)细胞的分布密度和形态学特点进行观察，结果显示5-HT在其整个消化道中均有分布。徐卫等用SAP法对儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)和成人患者的ALL骨髓和外周血进行Ki-67抗原和Bcl-2蛋白的检测，结果发现Ki-67抗原在儿童ALL中的表达略低于成人。4 .4 在分离纯化中的应

18、用（亲和层析）1.平衡2.上样3.洗杂4.洗脱五 反应特点1. BAS具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。2.生物素易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，再和生物素衍生物结合，将信号多级放大，能保持大分子物质的原有生物活性。3.亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性，不增加非特异性干扰，也不会因反应试剂浓度高低受影响。4.酸、碱、变性剂及有机溶剂均不会影响亲和素与生物素的结合力。裴仁军等试验结果表明，链霉亲和素与生物素能够在结合表面形成均一的多层膜维系紧密的结合。5.BAS不仅能与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，还可制成亲和介质，用于分离提纯。6.BAS操作方便，反应结果可用肉眼观察，实验成本低。六 应用前景 BAS具有诸多优点，主要应用于抗原、抗体、细胞等的定位和检测，能将形态、定位研究与功能、代谢研究有机地结合在一起，此方法经不断改进日趋成熟，其相关试剂盒也逐步商品化，在各个学科的应用已占有相当高的比例，科研工作中的各种标记技术都是为了使信号不断地放大，BAS与其他标记技