论文硝苯地平心脏缺血再灌注损伤的预防作用2

1、机能学自行实验设计论文课题题目：硝苯地平对大鼠心脏缺血再灌注损伤的预防作用目录1摘要21 弓i言42. 材料与方法42. 1实验动物和材料42. 2实验用液体的配置52.3实验方法53结果与分析73. 1正常大鼠心脏灌流模型的建立73.2缺血再灌注损伤大鼠心脏模型的建立93.3硝苯地平对缺血再灌注损伤具有一定的预防作用114展望14参考文献15【摘要儿心肌缺血再灌注损伤是临床心肌血重运建技术应用时产牛的一大难 题。心肌缺血再灌注损伤的主要机制是钙超载。硝苯地平是一类钙通道阻滞剂。 本实验建立了离体大鼠心肌缺血再灌注及提前5分钟给药的模型，证明了硝苯地 平对心肌缺血再灌注具有积极的预防作用，为临

2、床的预防及治疗心肌缺血再灌注 提供了新思路。【关键词】硝苯地平；心脏缺血一再灌注；离体灌流abstractmiocardial ischemia-reperfusion injury (miri) is an important problem of clinical therapeutics of myocardial infarction(mi).and calcium overload is a cardinol mechanism.and nifedipine is a kind of calcium channel blockers.we built the model of mio

3、cardial ischemiareperfusion injury in vitro of rats and adminster nifedipine 5min in advance.we drew the conclusion that nifedipine can prevent miri which provide new idea for clinical therapeutics of miri.key word!nifedipine;miocardial ischemia-reperfusion injury;perfusion or cardio in vitro1引言缺血再灌

4、注损伤是指在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发牛 不可逆损伤的现象。心肌缺血-再灌注损伤发生机制尚未彻底阐明，但目前认为 自由基作用、细胞内钙超载和白细胞的激活是缺血-再灌注损伤的重要发病学环 节。而其中很重要的一个原因就是细胞内钙超载的作用。钙超载系指各种原因引 起的细胞内钙含量界常增多并导致细胞结构损伤和功能代谢界常的现象。细胞内 钙超载引起在关注损伤的机制冃前尚未完全阐明，可能与以下因素相关。一是钙 超载引起的细胞膜损伤。细胞内c/增加可激活磷脂酶类，促使膜磷脂降解，造 成细胞膜结构受损。由于膜磷脂降解产物花生四烯酸、溶血酯酶增多，可加重细 胞功能紊乱。二是钙超载引起的线粒体膜

5、损伤。聚集于胞质内的c屮被线粒体摄 取时可消耗大量atp,同吋进入线粒体的c/与含磷酸根的化合物结合，形成不 溶性磷酸钙，既干扰线粒体的氧化磷酸化，使atp生成减少，乂损伤线粒体膜从 而加重细胞能量代谢障碍。三是钙超载引起的蛋白酶激活。细胞内cf增多增强 钙依赖性蛋白酶活性，从而促使黄瞟吟脱氢酶转变为黄瞟吟氧化酶，使氧自由基 生成增多。如激活蛋白酶，促进细胞膜和结构蛋白的分解；激活核酶，引起染色 体的损伤。四是钙超载引起细胞内酸中毒加重。细胞内c浓度升高可激活某些 atp酶，导致细胞高能磷酸盐水解，释放出犬量h；加重细胞内酸中毒。此外， 在心肌缺血-再灌注期间，细胞内钙超载尚可引起心肌纤维过度

6、收缩；并通过心 肌动作电位后延迟后除极的形成引发再灌注性心律失常，共同促使心肌缺血-再 灌注损伤的发生。而硝苯地平是一类钙通道阻滞药，它作用于细胞膜l型钙通道, 通过抑制钙离子从细胞外进入细胞内，而使细胞内钙离子浓度降低。木实验旨在 探究的是硝苯地平对于大鼠的心肌缺血一再灌注损伤的模型的作用效果，为临床 防治心肌缺血一再灌注损伤提供一个新的思路和条件。2材料与方法2.1实验动物和材料sd大鼠（厦门大学医学院动物实验室提供），体重1.8-2. 5 kglangendorff灌流装置（厦门大学医学院提供）rm6240b型多道牛物信号采集处理系统（成都仪器厂）硝苯地平缓释剂(厦门同民医院提供)手术器

7、械一套(直剪、弯剪、眼科剪各一，银子，止血钳，手术线，纱布， 注射器若干等)大量筒1个，三通管，压力传感器，水囊，心电引导电极，动脉夹，超级恒 温水浴锅，氧气瓶等2.2实验用液体的配置改良kh液(g/l)配方药品用量nacl9.009g,kc10.417g,cacb0.2442gnahco3015g,glucose2.15g,2. 3实验方法2. 3. 1实验系统连接和仪器参数设置(1) 将灌流系统用胶管连接，灌流液贮瓶灌满灌流液。(2) 混合气瓶的减压阀出口用软胶连接至灌流管内的充气管，调节气瓶上 的减压阀，使灌流液中的气泡连续而且细小均匀。(3) 调节超级恒温水槽，使心脏插管内的灌流液温度

8、恒定在37度。(4) rm6240b型多道牛物信号采集处理系统参数设置。心电引导电极连接。 2. 3. 2实验模型建立(1) 摘取心脏 取大鼠，提前15min注射肝素防治凝血，10%的水合氯醛 麻醉后后仰置于操作台上台上。迅速沿胸前壁正中剪开皮肤，打开胸腔，轻轻提 起心脏，小心剪断腔静脉、主动脉以及心脏周围组织，迅速将心脏连同一段主动 脉取出。心脏取出后立刻置于预先备好的充氧的冷kh液中，用手指轻压心室 以利于其中剩余的血排出，防止凝血块形成。用注射器向主动脉根部徐徐注入充 氧的冷kh液。(2) 灌流心脏 将主动脉插管插进主动脉，用棉线将主动脉和心脏插管结 扎在一起并固定到langendorf

9、f灌流仪上。(3) 在左心房做一小切口，插入带水囊的导管至左心室，导管连压力换能 器。调整水囊中的注液量，记录压力。连接心电装置，分别在右心房、心尖、主 动脉处安置三个心电引导电极。(4) 待心脏恢复稳定后，记录心电。(5) 自左心耳下方2-3mm入针,以prolene： 6-0线在冠状动脉左前降支下 缝过，缝扎的中点在左心耳和肺动脉圆锥的交界和心尖连线上，在肺动脉圆锥旁 出针，结扎时用一细硬膜外麻醉管于结扎线之间，结扎冠状动脉。缺血30mino(6) 30min后解开结扎线，恢复再灌注lh,观察心电变化。2. 3. 3实验分组sd大鼠10只，雌雄不限，体重相近，分为3组。分组数量/只处理对照

10、组3用k-h液连续灌流心 脏至心脏稳定，不结扎缺 血。缺血再灌注组3用kh液连续灌流心 脏至心脏稳定后,结扎冠 状动脉左前降支30 min, 再灌注lh o提前给药组4提前5min灌胃给药(硝苯 地平)，k-h液灌流心脏 至稳定后,再结扎冠状动 脉左前降支30 min，再灌 注lho2. 3. 4数据记录及统计学处理实验中分别在缺血前，再灌注各个时间段的心电图及相应的t波、r波、s 波。对所得数据进行统计学处理。再灌注结束后，取下心脏，进行oct胶包埋, 液氮速冻，进行冰冻切片，做he染色。3.结果与分析3.1正常大鼠心脏灌流模型的建立对照组系列110002000300010005000600

11、0对照组灌流27分钟后iaf1、a.n、/jf j、/对照组灌流57分钟后c1j、r.-j-一1对照组灌流1小时38分钟后1111v-a11"v11 一波幅测量p 波（mv）27min0.4257min0.2lh38min0.65q 波（mv）r 波（mv）0.921.950.61.451.251.8对照组（40倍镜）对照组（400倍镜）figi:正常大鼠心脏灌流模型建立。a图:对照组心脏经灌流心率逐渐趋于稳定z后，侮隔5 分钟记录一次心率，共记录20次（具体心率数据未展现出來，见原始数据）。b图及c图: 灌流后心脏心率渐渐稳定，在此之后选収3个时间点进行心电图观测。d图：心脏灌流结

12、朿 后，取下心脏切取左心室进行冰冻切片及h.e.染色后在光学显微镜下观察。首先，我们提前给大鼠注射了肝素以防止在取下心脏z后，血液凝固在心脏 之中影响灌流。为了起到良好的对照效果，我们选取了心率以及波形基本稳定之后的时间点 进行心电图的记录。此次实验中在心脏灌流20分钟以后心率以及波形就已基本 稳定，我们从那以后每隔5分钟便记录一次心率，结果是正常组的心率一直都保 持相对稳定状态（figi a）。除此之外，我们还选取了灌注之后27分钟后，57 分钟后，1小时38分钟后3个时间点进行心电图观测，三个心电图基本上是一 致的，心电图上见p波相对较小而圆钝，虽然三次记录的p波略有偏差，但误 差相对较小

13、，在可接受的范围内，q波和r波前后相对较为一致。pr间期极短, 几乎不可见，此应与大鼠心率较人为快，以及房室传导时间较短有关，qrs波 群与t波连贯，u波不可见，这些应主要与大鼠心率较快关系较大（figi band c） o所以，综合上述可知，该组实验大鼠的心率是较为整齐以及心电图相对正 常，从这两点看，其节律与传导这两项重耍的指标是符合作为对照组的标准的。当然，从心率和心电中只能得出其功能相对正常这样的结论，但是还未排除 其是器质性病变的代偿阶段。因此，我们小组将灌流结束的心脏进行冰冻切片以 及h.e.染色，以确定其没有形态学上的改变（figi d）,大体上排除了其器质 性病变，为确认将其作

14、为对照组补上重要的一笔。综合上述，我们成功构建了止常大鼠的心脏灌流模型，为接下来的实验打下了坚实的基础。3.2缺血再灌注损伤大鼠心脏模型的建立缺血再灌注组t/(s)缺血再灌注组 心率稳定并灌流2分钟后缺血再灌注组 结扎冠脉15分钟后波幅测量p 波(mv)q 波(mv)r 波(mv)灌流2min0.21.02.3结扎冠脉15min0.40.461.6再灌注lh （心率不齐）0.123.2再灌注lh （心率不齐）081.42.0缺血再灌注组（40倍镜）缺血再灌注组（400倍镜）fig2:缺血再灌注损伤大鼠心脏模型建立。a图：缺血再灌注组大鼠心脏经灌流心率逐 渐趋于稳定之后，每隔5分钟记录一次心率，

15、共记录26次（具体心率数据未展现出来，见 原始数据）。b图及c图：灌流后心脏心率渐渐稳定，在此之后选取3个吋i'可点进行心电 图观测。d图：心脏灌流结束后，取下心脏切取左心室进行冰冻切片及h.e.染色后在光学 显微镜下观察。在心脏冠状动脉的左前降支被结扎之前的操作与对照组大鼠是一致的，在结 扎前记录到的数据也与对照组差别较小。z后我们选取心率较稳定的一个时间点 进行冠状动脉左前降支的结扎手术，从记录到的心率来看结扎之后心率在一过性 上升之后，便处于趋于持续下降的状态，缺血时间共持续了约30分钟，之后解 开结扎，使冠状动脉左前降支恢复灌流，由记录到的心率中可见到再灌注z后开 始出现明显的

16、心率不齐（fig2 a）o上述心率不齐应是由于再灌注后心肌之间动 作电位时程不均一，增强心肌兴奋折返，以及再灌注钙超载与自由基增多等有重 大关系。这样的结果初步支持了缺血再灌注模型的成功建立。为了增加说服力，我们截取了心率平稳后2分钟，冠状动脉结扎后15分钟, 以及再灌注1小时后的心电图进行分析（fig2 b and c）来反映不同阶段的心脏 功能的变化，以进一步确定缺血再灌注模型成功建立。从截取的心电图可以看出 在心率稳定后的两分钟，该组小鼠的心电图与对照组基本无二。在结扎冠状动脉 15分钟后，心电图并无显著变化（此时或为其代偿阶段），但可以看到p波略微 升高，而q波与r波，尤其是q波呈现出

17、较为明显的下降，表明此时的心室去 极化过程受到一定的影响，冠状动脉结扎术是较为成功的。而在解开结扎之后， 心电图显示岀明显的改变，p波，q波和r波都显示出较大的起伏，进一步佐证 了上述折线图所反映出来的心率不齐。至此，缺血再灌注损伤模型成功建立的说 法已经较具有说服力了。然而，对于是否这些功能上的改变涉及了实质性的心肌细胞损伤述是需要证 明了，于是我们同样在灌流结束z后取下左心室组织进行冰冻切片以及h.e.染 色。结果较为明显，在40倍光学显微镜下可观察到心脏肿胀，心腔面积缩小， 心室壁增厚等心脏结构变化;在400倍光学显微镜下可看到心肌细胞水肿变形， 肌原纤维结构破坏，出现严重收缩带等缺血再

18、灌注较为特征性的损伤，有力地佐 证了缺血再灌注损伤模型成功建立。综合上述，我们得出大鼠心脏缺血再灌注损伤模型成功建立，为进一步的探 究铺平了道路。3. 3硝苯地平对缺血再灌注损伤具有一定的预防作用术前5分钟硝苯地平灌胃4003002001000100020003000400050006000t(s)+系列1硝苯地平提前灌胃5min组心率基本稳定并灌流5分钟后硝苯地平提前灌胃5min组结扎冠脉10分钟后硝苯地平提前灌胃5min组 再灌注30分钟后f4aft1x12112-2波幅测量硝苯地平预防组（40倍镜）硝苯地平预防组（400倍镜）p 波（mv）q 波（mv）r 波（mv）灌流5min0.40

19、.651.9结扎冠脉lomin0.20.61.43再灌注30min0.581.351.75fig3:硝苯地平对缺血再灌注损伤的预防作用。a图：缺血再灌注组大鼠心脏经灌流心率 逐渐趋于稳定之后，每隔5分钟记录一次心率，共记录20次（具体心率数据未展现出来， 见原始数据）。b图及c图：灌流后心脏心率渐渐稳定，在此之后选取3个时间点进行心 电图观测。d图：心脏灌流结束后，取下心脏切取左心室进行冰冻切片及h.e.染色后在光 学显微镜下观察。（注：实验组共三组，因结果一致，故只取一组数据展示）众所周知，硝苯地平是典型的钙通道阻滞药之一,而缺血再灌注损伤的核心环 节z便是该超载，所以很白然得可以联想到是否

20、两者z间存在预防与被预防或 者治疗与被治疗之间的关系，我们的想法亦与此类同故该组大鼠是木次实验的实 验组，在止常大鼠与缺血再灌注损伤大鼠模型成功建立的基础上探究硝苯地平对 缺血再灌注损伤。我们在对大鼠进行手术，取出心脏前5分钟进行硝苯地平灌胃，以确保其被 充分吸收，之后的操作与缺血再灌注损伤模型组相同。我们在心率基本稳定之后 同样给予大鼠心脏冠状动脉左前降支以结扎处理，观察到其也存在一短暂的心率 上升，之后缓慢下降，这与之前缺血再灌注模型组的情况是一致的，在一定程度 上说明结扎术是比较成功的，但与缺血再灌注损伤模型组不同的是，实验组再灌 注之后没有出现像缺血再灌注损伤模型组那样的明显的心率波动

21、，它的心率还是 保持在相对稳定的水平(fig3 a)o由此，我们可以联想到是否是硝苯地平的钙 通道阻滞效应发挥它的作用。为了进一步验证上述的想法，我们同时还进行了心电图的分析，我们选取了 心率稳定并灌流5分钟，结扎冠状动脉10分钟及再灌注30分钟后三个时间点进 行观测(fig3bandc)。从心电图上可以看到心率稳定并灌流5分钟以后的心电 图与之前的两个模型组的基本一致，所以是有参照意义的。而结扎冠状动脉10 分钟后，与缺血再灌注损伤模型组类似，其p波略微降低，而q波和r波尤其 是r波均有降低，表明其心室去极化受到影响，一定程度上证实了结扎的成功 性，其与心率一起共同有力证明了结扎的成功性。结

22、扎共持续了 30分钟，我们 解开结扎并再灌注30分钟以后乂进行心电图的观测，发现其并未向先前的缺血 再灌注损伤模型组那样出现严重的心率不齐，相反，其p波，q波，r波都存在 一定程度的冋升，且保持相对稳定，表明其心房心室的传导都有都得到一定程度 的恢复，缺血再灌注损伤并未发生，心肌或得到了保护。以上分析已经让硝苯地 平对心肌缺血再灌注损伤的预防作用呼之欲岀了。但是，心肌的功能得到的维持是否是一短暂的过性的功能恢复，而心肌已经 发生实质性损伤了呢。为此，我们对灌流之后的左心房进行冰冻切片以及h.e. 染色并在光学显微镜下观察心肌形态以确认其是否损伤。可对比看到，在40倍 镜下，实验组心脏与对照组形

23、态无其差别，心室壁略微增厚；在400倍镜下，心 肌细胞形态结构未发生明显改变，见肌原纤维仍然保留。所以，心肌细胞未遭受 严重的损伤，表明其确实受到了保护作用，这为硝苯地平的保护作用提供了更为 直观的证明。综合上述，结合与对照组及缺血再灌注损伤模型组的比较，硝苯地平对心肌 缺血再灌注损伤的预防作用已经得到了较为有力的证明。5展望经过实验我们可以初步证明硝苯地平对心肌缺血再灌注损伤有的一定的预 防作用，为临床上有心肌梗死患病危险的病人带来了福音。也为解决临床工作者 在心肌血重运建技术不得不面对难题-一心肌缺血-再灌注损伤及如何对心肌 miri有效地防治提出了新的思路。但木实验各组的实验动物数量较少

24、，如果加大各实验组的实验动物数量，得 出的结论会更为精确和可靠。另外，本实验建立的模型是立体心脏灌流模型，与机体的内环境不能严格的 一致，如果能进行在体的实验模型建立，会更贴近临床的缺血再灌注损伤模型， 对实验结果的证明将是具有说服力的。本实验只通过心电变化和iie染色镜下观察进行心肌梗死的判断，如果能测定 血清中肌酹激酶同工酶(creatine kinase-mb)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)的含量，并对心脏组织进行特染心肌梗死的ttc染色，对心肌梗 死的判断将更加全面和客观。本实验仅做了大鼠离体心脏的灌流，观察其心电的变化，并对相应的心脏标 木进行了冰冻切片、

25、he染色。但是对于硝苯地平可以起到一定预防作用的机理 和机制，我们没有做进一步的研究。利用分子生物学的实验技术与方法，筛选相 应靶基因，提取心脏组织蛋a, western blot检测相应蛋白质的表达量，提取 rna,做逆转录和real time pcr检测相应rna的表达量，对硝苯地平药物的分 子作用机制进行深一步的探讨，可以更深入探讨我们得岀的结论。参考文献：1- imroving and evalua ting the met hod of est abolishing rat models of acute myocardial ischemia reperfusion -xiaogang an2. n-acetylcysteine and allopurinol synergistically enhance cardiac adiponectin con