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文档简介
1、研究生创新基金资助项目申请书项目类别:优秀博士学位论文培育 创业种子项目名称 叶酸缺乏导致心血管系统发育异常的机制研究申请人姓名 孙淑娜 所在院系 复旦大学儿科医院 填表日期 2004年4月23日 复旦大学研究生院一、基本情况姓名孙淑娜学号041107210院系复旦大学儿科医院专业儿科学专业层次博士导师桂永浩电话(办)54237092电话(家子信箱041107210题目叶酸缺乏导致心血管系统发育异常的机制研究申请资助金额(元)3万元预计完成时间2007年 2 月 31 日二、近期已取得的与本项目有关的主要研究成果(含论文、专著、专利等)1Shuna Sun, Yuex
2、iang Wang, Tao Zhong, Houyan Song, Yonghao Gui. Malformation of Zebrafish Cardiovascular System Caused by Inhibiting the Function of Folic Acid. 投稿于2006 .6于美国举行的“The 7th International meeting on Zebrafish Development & Genetics”,并已被大会接收。 此文章近日投稿SCI收录期刊:Development Dynamics2孙淑娜,桂永浩 叶酸拮抗剂MTX干扰斑马鱼胚
3、胎发育及外源性FTHFA的拮抗作用 药学学报(已投稿)3孙淑娜,桂永浩 叶酸生物学活性受抑制后下调斑马鱼MEF2A、MEF2C的表达 (已完成)4“叶酸拮抗剂MTX对斑马鱼心血管系统发育影响的实验研究” 第二届江浙沪儿科学会议优秀论文奖5“叶酸缺乏对斑马鱼心血管系统发育影响的实验研究”2005年度复旦大学儿科医院论文比赛一等奖三、项目论证1.对项目的论证:基本内容、重点和难点、国内外研究现状分析、本项目的理论意义和实践意义,并附列主要参考文献及出处;2.对项目实施和完成条件的论证:研究生的研究水平和时间保证、资料设备、科研手段;3.研究方案的论证;4.对市场产业化前景的论证(仅对“创业种子资助
4、项目”)。1. 对项目的论证:基本内容和重点:本研究从叶酸缺乏导致先天性心脏病的机制探讨入手,用化学遗传学和基因阻抑两种手段构建叶酸缺乏斑马鱼生物模型,观察叶酸缺乏导致斑马鱼心血管发育异常的表型,并以此为平台,开展后续叶酸缺乏对斑马鱼心脏发育相关基因表达影响的研究。同时对儿童体内叶酸生物学作用发挥的关键酶基因(DHFR基因)突变与先天性心脏病发病之间的关系进行了初步探讨。从实验室研究和临床研究两方面入手探寻叶酸缺乏导致先心病的机理。国内外研究现状分析:先天性心脏病(CHD)是严重危害儿童生命和健康的疾病,发病率为810活产婴儿。在其致病的诸多因素中,环境因素中维生素的缺乏不容忽视。近年来,人群
5、中大量的流行病学调查结果显示人类叶酸缺乏可导致许多先天性异常的发生率明显上升,如:先天性心脏病、神经管发育缺陷、颌面部畸形等异常1。且母亲孕期适当补充叶酸可以有效的预防这些先天性畸形的发生2。以这些调查研究的结果为依据,利用模式生物开展叶酸缺乏导致先天性心脏病发病机制的研究目前已成为国内外热点。目前大鼠中构建的叶酸缺乏模型主要有两种方法,一是将与叶酸生物学作用发挥有关的基因剔除,造成叶酸缺乏的模式34,二是利用公认的叶酸拮抗剂阻断叶酸生物学作用的发挥。叶酸在进入体内后发挥生物学作用时,有赖于其向细胞内运输或代谢中许多因子的共同作用,如叶酸受体(FR)、还原叶酸载体(RFC)、二氢叶酸还原酶(D
6、HFR)5,10 -亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)等。目前在人群中开展的基因多态性研究及利用动物模型实验都已发现上述一些因子相关基因的功能紊乱可导致叶酸正常生物学作用的发挥受抑制,继而发生先心病等先天性发育异常34。但目前对其确切的机理仍不明确。人类的HAND2基因定位于5q33染色体,对于心脏、咽弓和肢体发育有重要作用,其对于心肌前体细胞的分化和心肌分化时细胞的定位十分关键5。在人类心肌病中发现有HAND2基因的表达下调5 6。HAND2对人类UFD1L基因的表达有调节作用,UFD1L基因又与人类22q11缺失综合征有很大关系7。另外,HAND2与人类DGS的发病也相关8。HAND2还通
7、过和其他心脏特异性转录因子,如 GATA4、NKX2.5、MEF2A、MEF2C、TBX5、TBX1、END-1、TBX20、PHOX2A等的相互作用来调节心脏的发育9。在斑马鱼中,HAND2突变可导致心脏发育明显缺陷10。叶酸缺乏是否干扰了上述心脏发育关键因子的功能而导致先天性心脏病的发生尚未有明确的结论。斑马鱼是今年来新兴的一种模式生物,其心血管系统透明、便于观察,且繁殖量大、发育周期短,是心脏发育生物学研究的理想动物模型。在国内外其它利用叶酸缺乏动物模型进行的研究中,叶酸缺乏小鼠11和叶酸生物学活性受阻小鼠12、13有胚胎多系统的发育障碍,胚胎未发育至成熟即死亡;而斑马鱼的胚胎在发育严重
8、异常时仍能依赖周围水环境中的氧气存活一段时间,这就避免了由于胚胎死亡而导致的实验观察的终止,我们利用斑马鱼这一特点,开展叶酸缺乏研究。 本研究的理论意义和现实意义:在近年国内外流行病学调查研究中发现人群中各种原因导致的叶酸缺乏与先心病发生率升高有关。国外学者有报道,母亲长期或在孕期服用DHFR抑制剂(氨甲蝶呤、乙胺嘧啶、氨苯蝶啶及甲氧苄啶)可以导致后代发生先天性心脏病等异常14。本研究以此为切入点,通过阻断DHFR的功能构建斑马鱼叶酸缺乏模型,并探讨叶酸缺乏后对心脏发育相关基因功能上的影响,以探寻叶酸缺乏导致先心病的机制,有重要的理论和现实意义。2. 对项目实施和完成条件的论证:本课题组申请人
9、所在单位是复旦大学儿科医院,我院配有国内领先水平的实验仪器和较高的实验技术。本课题将与复旦大学分子医学教育部重点实验室协作完成,该实验室有符合国际标准的斑马鱼实验室,并有成熟的实验技术和配备齐全的实验设备,可以保证本课题的顺利完成。在本课题已进行的6个月时间内,我们已熟悉了斑马鱼的饲养和繁殖技术、斑马鱼的发育规律,并对基因探针的制备、原位杂交的操作等关键技术有较完全的掌握,有利于开展后续的研究。3.研究方案的论证: 本课题挑选目前备受关注的先心病致病环境因素为研究点之一,应用新兴模式生物斑马鱼开展叶酸缺乏导致先心病的基因水平机理研究,有完整的理论基础和周密的实验设计。显微注射吗啡啉修饰的反义核
10、苷酸是一种新兴的能够特异下调基因表达的技术15,在斑马鱼中此技术操作相对简便,有利于开展基因水平的研究;且斑马鱼是化学遗传学研究的理想研究生物模型16。在构建斑马鱼叶酸缺乏模型时,针对DHFR分别采用化学遗传学方法和基因阻抑方法阻断叶酸生物学活性的发挥,在探讨叶酸缺乏后对心血管发育相关基因功能的干扰时,同时采用原位杂交和Realtime PCR 的方法论证。在前阶段实验中,我们已用化学遗传学方法在近2.5万枚胚胎中成功筛选出心血管发育异常表型,探寻到观察心血管系统发育干扰的MTX最适宜处理时段和浓度;并发现叶酸生物学活性受抑制后心血管发育相关基因HAND2、MEF2A、MEF2C、FLK-1的
11、表达不同程度下调。以此我们选择围绕HAND2进行后续实验,在阐明HAND2表达阻抑和过表达时对MEF2A、MEF2C、TBX1、TBX5、PHOX2A、GATA4、TWIST1等心脏发育相关因子表达的基因网络调控后,我们加入叶酸干扰因素,探讨上述因子表达的差异,从而初步探索叶酸导致先心病发生的机理。在临床部分研究中,仍以DHFR为切入点,探讨其基因突变与先心病的关联性;有利于指导临床诊断,有十分重要的临床意义,并为前部分的实验研究提供更充足的理论依据。(详见下表)(参考文献)1.McDonald SD, Ferguson S, Tam L,et al. The prevention of co
12、ngenital anomalies with periconceptional folic acid supplementation. J Obstet Gynaecol Can. 2003 Feb;25(2):115-21.2.Botto LD, Mulinare J, Erickson JD. Do multivitamin or folic acid supplements reduce the risk for congenital heart defects? Evidence and gaps. Am J Med Genet A. 2003 Aug 30;121(2):95-10
13、1.3.Pei LJ, Ren AG, Hao L,et al. Study on the association between reduced folate carrier gene polymorphism and congenital heart defects and cleft lip with or without cleft palate. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2004 Dec;25(12):1063-7.4.Li D, Pickell L, Liu Y,et al. Maternal methylenetetrahydrofo
14、late reductase deficiency and low dietary folate lead to adverse reproductive outcomes and congenital heart defects in mice. Am J Clin Nutr. 2005 Jul;82(1):188-95.5. Hand2 regulates epithelial formation during myocardial diferentiation.Trinh le A, Yelon D, Stainier DY Curr Biol. 2005 Mar 8;15(
15、5):441-6.6. HAND1 and HAND2 are expressed in the adult-rodent heart and are modulated during cardiac hypertrophy.Thattaliyath BD, Livi CB, Steinhelper ME, Toney GM, Firulli AB.Biochem Biophys Res Commun. 2002 Oct 4;297(4):870-5.7. Absence of mutations in human ubiquitin fusion-degradation protein ge
16、ne in tetralogy of Fallot.Chung MY, Lu JH, Weng YY, Hwang B J Mol Med. 2001 Jun;79(5-6):338-42.8.The zebrafish van gogh mutation disrupts tbx1, which is involved in the DiGeorge deletion syndrome in humans.Piotrowski T, Ahn DG, Schilling TF Development. 2003 Oct;130(20):5043-52.9. Cooperative activa
17、tion of atrial naturetic peptide promoter by dHAND and MEF2C.Zang MX, Li Y, Xue LX, J Cell Biochem. 2004 Dec 15;93(6):1255-66.10. The bHLH transcription factor hand2 plays parallel roles in zebrafish heart and pectoral fin development.Yelon D, Ticho B, Halpern ME, Development. 2000 Jun;127(12):2573-
18、82.11. Kimmel C B,Ballard W W,Kimmel S R,et al.Stages of embryonic development of the zebrafish.Dev Dyn,1995,203:253-31012Maternal methylenetetrahydrofolate reductase deficiency and low dietary folate lead to adverse reproductive outcomes and congenital heart defects in mice. Li D. Pickell L. Liu Y.
19、 Wu Q. Cohn JS. Rozen R.American Journal of Clinical Nutrition. 82(1):188-95, 2005 Jul.13 . Mice lacking the folic acid-binding protein Folbp1are defective in early embryonic development. Jorge A. Piedrahita, Betty Oetama, Gregory D.1999 Nature America Inc.14. Hernandez-Diaz S, Werler MM, Walker AM,
20、et al. Folic acid antagonists during pregnancy and the risk of birth defects. N Engl J Med. 2000 Nov 30;343(22):1608-14.15. Nasevicius A, Ekker SC.Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 2000 Oct;26(2):216-2016Zebrafish as a novel experimental model for developmental tox
21、icology.Congenit Anom (Kyoto). Teraoka H, Dong W, Hiraga T.2003 Jun;43(2):123-32. (附表:实验设计方案)一、实验研究部分斑马鱼叶酸缺乏模式的构建采用DHFR基因表达阻抑方法,在胚胎受精后单细胞期显微注射吗啡啉修饰的反义RNA采用化学遗传学方法,在胚胎受精后610h用叶酸拮抗剂MTX(抑制叶酸发挥生物学活性通路中关键酶DHFR的活性)处理胚胎观察心脏发育异常表型,并通过原位杂交和Real-time PCR的方法检测胚胎整体及心脏中心血管发育相关基因HAND2、MEF2A、MEF2C、TBX1及HAS2整体表达水平的
22、差异前期实验结果已表明叶酸生物学活性受抑制后,对斑马鱼心血管发育产生干扰,且HAND2、MEF2A、MEF2C、FLK-1的表达不同程度的下调挑选HAND2基因进行深入探讨叶酸缺乏对HAND2及其靶基因表达的影响:阐明HAND2基因表达阻抑和使其过表达后,部分心脏发育相关基因在时相和空间上的表达变化探讨HAND2基因过表达的同时阻抑DHFR表达与只HAND2基因过表达这两种情况下,心脏发育的表型变化及心血管发育相关基因在时相和空间上的表达变化探讨HAND2基因表达阻抑并给予叶酸与只HAND2基因表达阻抑这两种情况下,心脏发育的表型变化及心血管发育相关基因在时相和空间上的表达变化二、临床研究部分
23、采集临床先心病患儿血标本,并按先心病种类分组采集与先心病患儿匹配的正常对照组患儿血标本抽提DNA,经PCR扩增DHFR基因全长序列后进行对比寻找先心病患儿及正常对照组患儿DHFR基因序列上的差异,并探讨此差异与先心病发生的关系,从临床角度提供DHFR基因异常而导致的叶酸生物学活性受抑与先天性心脏病的发生有关,进一步为上述的实验室研究部分提供理论依据四、预期研究成果研究阶段(起止时间)阶段成果名称成果形式2005.92005.10通过化学遗传学的方法观察叶酸拮抗剂MTX对斑马鱼心血管发育的影响及外源性FTHFA的拮抗作用,筛选出适合后续分子生物学实验的合适处理时段及浓度权威期刊文章2篇2005.112006.5探讨HAND2、MEF2A、MEF2C、TBX1、HAS2及 FLK-1等心血管发育相关基因在正常斑马鱼中的时空表达规律及应用叶酸拮抗剂后其基因表达水平的变化1200662006.8明确用下调DHFR基因的方法阻断叶酸生物学活性发挥后, HAND2、MEF2A、MEF2C、TBX1、HAS2及 FLK-1等心血管发育相关基因表达水平的变化SCI文章1篇200692006.11阐明下调HAND2基因和使其过表达后,部分心脏发育相关基因在时相和空间上的表达变化权威期刊1篇2006.12-2007.1探讨在下调HAND2基因并给予
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