铜绿山抗铜固氮微生物的筛选与鉴定

1、湖北理工学院毕业论文目 录摘 要1ABSTRACT11 前 言21.1 固氮的主要形式21.1.1人工固氮21.1.2 天然固氮（高能固氮）31.1.3 生物固氮41.2 氮循环51.3 生物固氮的应用及发展前景61.3.1 生物肥料61.3.2 农业应用81.3.2 研究前景91.4 本课题研究的目的、意义102 材料和方法112.1 材料112.1.1 土样及菌种112.1.2 培养基112.2 方法112.2.1 土壤稀释分离112.2.2 培养基制备122.2.3 涂布平板122.2.4 筛选菌种122.2.5 分离方法122.2.6 微生物纯化122.2.7 固氮能力的检测122.2

2、.8 固氮菌抗铜性能研究132.2.9 PCR菌种鉴定143 实验结果与分析163.1 菌种分离纯化结果16湖北理工学院毕业论文3.2 菌种抗铜性能检测213.2.1 菌种选择213.2.2 接种223.4 16srDNA检测243.4.1 PCR测序244 结论与讨论25参 考 文 献26摘 要 实验分别从青葙根际土、蓖麻根际土、杨树非根际土、白牙根际土、杂草根下土、高铜土等18个土壤样品中分离筛选得到7个能在无氮培养基上良好生长的菌株，从中挑出12株菌落形态特殊的菌株作为实验菌株。抗铜实验中有2株菌种表现出了优良的抗铜能力。最终实验对6株菌进行了16srDNA测序，得出*关键词：固氮微生物

3、；固氮；抗铜ABSTRACT Experiments get seven strains to cultivate in non-nitrogen grow well on the substrate, which were isolated from 18 soil samples in seeds rhizosphere soil, rhizosphere soil ricin, non-rhizosphere soil of poplar, white root rhizosphere soil, weed root soil, high copper soil and other, a

4、nd picked 12 strains with special colony morphology as the experimental strains. Anti-copper experiment has two strains exhibited excellent resistance to copper capacity. Finally experiment were sequenced with 16srDNA on six strains, The result is thatKeywords: Nitrogen fixing microorganisms; nitrog

5、en fixation; Copper resistance1 前 言氮素是组成生命物质最重要的元素之一，大气中的氮，必须经过以生物固氮为主的固氮作用，才可能被植物吸收利用。在自然界中只有某些微生物能直接地将大气中的氮气通过固氮酶的作用还原成氨。它们所进行的生物固氮作用是土壤中氮素的最主要来源，也是固氮微生物参与自然界中氮素循环过程的主要环节，固氮菌主要包括自生固氮菌、共生固氮菌和联合固氮菌。目前固氮菌应用的主要方式是固氮菌肥料的施用。固氮肥料是利用固氮微生物将大气中的分子态氮气转化为农作物能利用的氨，进而为其提供合成蛋白质所必需的氮素营养。固氮菌肥料也是如今最理想、最具发展前途的肥料之一。一

6、方面，固氮菌能为植物充分提供氮素营养，一定程度上抑制了病虫害，从而减少了化肥和农药的使用，减少了他们对自然环境的污染。另一方面，研究表明在重金属污染较严重的土壤里，有较多种类的根瘤菌可以生长。这方面的研究很多，但对根瘤菌抗重金属的研究还不是很成熟，仍然有待选出一批抗重金属强的固氮细菌及其共生体系，此外也可以利用分子生物学的手段构建一种抗重金属的工程根瘤菌，也就可以为生物修复重金属污染而提供更多的途径了。铜绿山是我国古矿冶遗址，土壤中高含量的铜影响着该地带固氮微生物的生物固氮反应，同时也使它们拥有了能在含铜量高的环境下生存的能力。对该处固氮微生物的研究将有利于我们进一步了解固氮微生物在金属含量较

7、高的环境下的固氮过程。本课题也会对土壤中抗铜固氮微生物的多样性以及固氮能力进行检测，进一步提高微生物的固氮能力。1.1 固氮的主要形式 将空气中的游离氮转化为化合态氮的过程被称为固氮（nitrogen fixation)。 通过微生物的作用把分子氮转化为氨的过程则称为微生物固氮。1.1.1人工固氮人工固氮主要是针对生物固氮而言，通过化学方法，制备出类似生物“固氮菌”的物质，使空气中的氮气在常温常压下与水及二氧化碳等反应，转化为氨态氮或铵态氮，进而实现人工合成大量的蛋白质等，最终实现工厂化生产蛋白质食品。 工业上通常用H2和N2在催化剂、高温、高压下合成氨化学方程式：N2 + 3H2=(高温高压

8、催化剂）2NH3本世纪初以来全球农作物单位面积产量不断增长，在一定程度上依赖于氮素化肥的施用量不断增加。农作物依赖于施用氮素化肥所获得的增产实际上是以消耗能源和污染环境为代价所取得的。在大气中氮气含量接近80%，但这种氮气并不能直接为高等植物吸收利用。人类自从发现豆科植物与根瘤菌共生结瘤固氮现象以来对生物固氮研究已有112年之久，我国对生物的共生固氮现象也进行了长达62年的探索性研究。然而，关于生物固氮，特别是非豆科农作物的生物固氮，还有许多问题有待于进一步研究。目前，生物固氮研究已经被列为“国际生物学计划”中的重点研究内容，各国政府都将其视为重点科技攻关项目。通过适当方式将生物固氮机制引入到

9、非豆科农作物中，进而建立起非豆科农作物固氮新体系，这是农业科学研究中一项富有挑战性的研究课题。这不仅引起了农业科学家的极大兴趣，而且也受到了全社会各阶层有识之士的广泛关注。1.1.2 天然固氮（高能固氮） 闪电能使空气里的氮气转化为一氧化氮，一次闪电能生成801500kg的一氧化氮。这也是一种自然固氮。自然固氮远远满足不了农业生产的需求。自然固氮方程式N2 + O2 = 2NO2NO + O2 = 2NO23NO2 + H2O = 2HNO3 + NO豆科植物中寄生有根瘤菌，它含有氮酶，能使空气里的氮气转化为氨，再进一步转化为氮的化合物。固氮酶的作用可以简述如下：除豆科植物的根瘤菌外，还有牧草

10、和其他禾科作物根部的固氮螺旋杆菌、一些原核低等植物固氮蓝藻、自生固氮菌体内都含有固氮酶，这些酶有固氮作用。这一类属自然固氮的生物固氮。人工固氮长期以来，人们期望着农田中粮食作物能像豆科植物一样有固氮能力，以减少对化肥的依赖。70年代首先实现了细菌之间的固氮，目前主要在合成氨中实现人工固氮。所有的含氮化学肥料也主要是由氨加工制成的。人称这种合成氨方法为"哈伯博施法"，这是具有世界意义的人工固氮技术的重大成就。是化工生产实现高温、高压、催化反应的第一个里程碑。合成氨的原料来自空气、煤和水，因此是最经济的人工固氮法，从而结束了人类完全依靠天然氮肥的历史。1.1.3 生物固氮 生物

11、固氮是指固氮微生物将大气中的氮还原成氨的过程。固氮微生物固定的氮的含量远非人工固氮和高能固氮所比，可以说，自然界中固定氮主要是靠生物固氮。生物固氮在自然界的氮循环中有着十分重要的意义。1.1.3.1 共生固氮 在与植物共生的情况下才能固氮或才能有效地固氮，固氮产物氨可直接为共生体提供氮源。主要有根瘤菌属的细菌与豆科植物共生形成的根瘤共生体，弗式菌属与非豆科植物共生形成的根瘤共生体；某些蓝细菌与植物共生形成的共生体，如念珠藻或鱼腥藻与裸子植物苏铁共生形成苏铁共生体，红萍与鱼腥藻形成的红萍共生体等。根瘤菌生活在土壤中，以动植物残体为养料，过着“腐生生活”。当土壤中有相应的豆科植物生长时，根瘤菌迅速

12、向它根部靠拢，从根毛弯曲处进入根部。豆科植物根部在根瘤菌的刺激下迅速分裂膨大，形成“瘤子”，为根瘤菌提供了理想的活动场所，还供应了丰富的养料，让根瘤菌生长繁殖。根瘤菌又会卖力的从空气中吸收氮气，为豆科植物制作氮素。这样，根瘤菌与豆科植物形成了共生关系，因此根瘤菌也被称为共生固氮菌。根瘤菌生产出来的氮肥不仅满足豆科植物的需要，还可以跟周边的植物共享，也会储备下来。1.1.3.2 自生固氮有一些固氮菌，它们不依托在植物体内，能自己从空气中吸收氮气，繁殖后代，死后会遗留大量的氮素给周围的植物，让植物得到大量的氮肥。自生固氮微生物在土壤或培养基中生活时，可以自行固定空气中的分子态氮，对植物没有依存关系

13、。常见的自生固氮微生物包括以圆褐固氮菌为代表的好氧性自生固氮菌、以梭菌为代表的厌氧性自生固氮菌，以及以鱼腥藻、念珠藻和颤藻为代表的具有异形胞的固氮蓝藻。1.1.3.3 联合固氮有些固氮微生物如固氮螺菌、雀稗固氮菌等，能够生活在玉米、雀稗、水稻和甘蔗等植物根内的皮层细胞之间。这些固氮微生物和共生的植物之间具有一定的专一性，但的不形成根瘤那样的特殊结构。这些微生物还能够自行固氮，它们的固氮特点介于自生固氮和共生固氮之间。1.1.3.4 微生物在自然界中，有很多原核微生物，包括细菌和放线菌，它们可以在特定条件下把氮气还原为氨，因而被称为固氮微生物。固氮微生物的固氮过程完全是生物和微生物自发进行的，无

14、须提供任何能源和设备，因而它减少了能源的消耗。由于全部固氮过程都是生物活动，无污染物排放，有利于保护生态环境。同时，由于减少和免除了化学氮素的投入，使农产品中硝酸和亚硝酸物质大幅度降低，提高了农产品的品质，减少致癌物质对人类的危害。1.1.3.5 固氮菌原核微生物，属于自生固氮菌，其代谢类型是异养需氧型。利用的是土壤中的腐殖质，故在生态系统中的成分是分解者。自生固氮微生物是指在土壤中能够独立进行固氮的微生物，其中，多数是一类叫做自生固氮菌的细菌。自生固氮菌大多是杆菌或短杆菌，单生或对生。经过两天的培养，成对的菌体呈“8”字形排列，并且外面有一层厚厚的荚膜。自生固氮菌中，人们应用得最多的是圆褐固

15、氮菌。圆褐固氮菌具有较强的固氮能力，并且能够分泌生长素，促进植株的生长和果实的发育，因此，将圆褐固氮菌制成菌剂，施用到土壤中，可以提高作物的产量。1.1.3.5 根瘤菌根瘤菌是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根瘤细胞，继续繁殖，根瘤中含有根瘤菌的细胞群构成含菌组织。1.2 氮循环氮素在自然界中有多种存在形式，其中，数量最多的是大气中的氮气，总量约3.9×10t。除了

16、少数原核生物以外，其他所有的生物都不能直接利用氮气。目前，陆地上生物体内储存的有机氮的总量达1.1×101.4×10t。这部分氮素的数量尽管不算多，但是能够迅速地再循环，从而可以反复地供植物吸收利用。存在于土壤中的有机氮总量约为3.0×10t，这部分氮素可以逐年分解成无机态氮供植物吸收利用。海洋中的有机氮约为5.0×10t，这部分氮素可以被海洋生物循环利用。构成氮循环的主要环节是：生物体内有机氮的合成、氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固氮作用。植物吸收土壤中的铵盐和硝酸盐，进而将这些无机氮同化成植物体内的蛋白质等有机氮。动物直接或间接以植物为食物，将植物

17、体内的有机氮同化成动物体内的有机氮。这一过程叫做生物体内有机氮的合成。动植物的遗体、排出物和残落物中的有机氮被微生物分解后形成氨，这一过程叫做氨化作用。在有氧的条件下，土壤中的氨或铵盐在硝化细菌的作用下最终氧化成硝酸盐，这一过程叫做硝化作用。氨化作用和硝化作用产生的无机氮，都能被植物吸收利用。在氧气不足的条件下，土壤中的硝酸盐被反硝化细菌等多种微生物还原成亚硝酸盐，并且进一步还原成分子态氮，分子态氮则返回到大气中，这一过程叫做反硝化作用。大气中的分子态氮被还原成氨，这一过程叫做固氮作用。没有固氮作用，大气中的分子态氮就不能被植物吸收利用。地球上固氮作用的途径有三种：生物固氮、工业固氮和高能固氮

18、。据科学家估算，每年生物固氮的总量占地球上固氮总量的90%左右，可见，生物固氮在地球的氮循环中具有十分重要的作用。1.3 生物固氮的应用及发展前景生物固氮在农业生产中具有十分重要的作用。氮素是农作物从土壤中吸收的一种大量元素，土壤每年因此要失去大量的氮素。如果土壤每年得不到足够的氮素以弥补损失，土壤的含氮量就会下降。土壤可以通过两条途径获得氮素：一条是含氮肥料（包括氮素化肥和各种农家肥料）的施用；另一条是生物固氮。科学家在20世纪80年代推算过，全世界每年施用的氮素化肥中的氮素大约有8×10t，而自然界每年通过生物固氮所提供的氮素，则高达4×10t。1.3.1 生物肥料在形

19、形色色的固氮菌中，最突出的要数根瘤菌了。根瘤菌平常生活在土壤中，以动植物残体为养料，过着自给自足的生活。当土壤中有相应的豆科植物生长时，根瘤菌便迅速向它的根部靠拢，并从根毛弯曲处进入根部。豆科植物的根部细胞在根瘤菌的刺激下加速分裂、膨大，形成大大小小的“瘤子”，为根瘤菌提供了理想的活动场所，同时还供应丰富的养料，让根瘤菌生长繁殖。根瘤菌也会卖力地从空气中吸收氮气，为豆科植物提供生长必须的氮素。还有一些固氮菌则不住在植物体内，能自己从空气中吸收氮气，繁殖后代，死后也会为植物提供大量的氮肥。1.3.1.1 固氮菌肥料目前固氮菌肥料的生产基本上采用液体发酵方法。产品可分液体菌剂和固体菌剂。从发酵罐发

20、酵结束后及时分装即成液体菌剂，发酵好的液体再用灭菌的草炭等载体吸附剂进行吸附即成为固体菌剂。固氮菌肥料是含有大量好气性自生固氮菌的微生物肥料。自生固氮菌不与高等植物共生，没有寄主选择，而是独立生存于土壤中，利用土壤中的有机质或根系分泌的有机物作碳源来固定空气中的氮素，或直接利用土壤中的无机氮化合物。固氮菌在土壤中分布很广，其分布主要受土壤中有机质含量、酸碱度、土壤湿度、土壤熟化程度及速效磷、钾、钙含量的影响。固氮菌肥对棉花、水稻、小麦、花生、油菜、玉米、高粱、马铃薯、烟草、甘蔗以及各固氮菌肥料是含有大量好气性自生固氮菌的微生物肥料。1.3.1.2 根瘤菌肥料 根瘤菌肥是这类肥料在农业生产中主要

21、品种，它是微生物肥料中使用最早，应用的国家和地区最多，应用效果最稳定的微生物制剂。   1.根瘤菌肥的应用原理将科学家经过各种手段筛选出来的固氮能力、侵染结瘤和竞争能力强的根瘤菌株制成根瘤菌肥，在豆科作物种植之前拌在种子上或接种在土壤里，以形成二者的共生固氮，达到增产和提高品质的目的。这是一条农业上事半功倍的有效途径。根瘤菌肥在我国应用的经济效益十分良好，投入和产出之比在11020以上。   2.根瘤菌肥料的生产和应用根瘤菌肥料的生产过程与一般的微生物肥料的生产基本一致。但其对于无菌条件的要求更为严格，这是因为快生根瘤菌繁殖一代的时间

22、34小时，慢生根瘤菌需810小时，这比各种杂菌来，显然要长得多。在生产中，稍有疏忽或设备上的小漏洞常常造成发酵失败。用于生产根瘤菌肥料的菌种较多，根据它们的生长繁殖速度可分为快生根瘤菌和慢生根瘤菌，它们的形态和鉴别特征简述如下。     快生根瘤菌在培养条件下为杆状，大小是1.50.9微米×1.23.0微米；在不利生长条件下或老龄时呈多形性；有26根周生鞭毛，或一根端生或侧生鞭毛，能运动；不形成芽胞；在相差显微镜下可见折光性的B-羟基丁酸盐颗粒，使细胞染色不均匀，有时呈环节状；革兰氏染色阴性；菌落为圆形，半透明，半粘稠；在通用根瘤菌培

23、养基上28培养23天，形成25毫米直径大小的菌落；利用碳源较为广泛，但不利用纤维素和淀粉；在甘露醇或其它碳水化合物培养基上生长产酸，并产生大量胞外多糖粘液；最佳生长温度为2530，最佳生长pH值为67。    慢生根瘤菌的形态和鉴别特征和上述快生根瘤菌大体相似，但菌落多为不透明，呈白色、凸起；生长速度慢，在酵母-甘露醇培养基上28培养57天，其菌落直径不超过1毫米；在甘露醇或其它碳源上生长产碱。   生产的根瘤菌肥料种类较多，不仅有用于大豆、花生、菜豆、绿豆等粮食、油料和蔬菜豆科接种剂，也有三叶草、苜蓿、紫云英等豆科牧草或绿

24、肥的接种剂。根瘤菌肥的剂型主要是液体和固体两类，固体剂型国内生产多为草炭粉剂，也有用肥土、稻壳、蛭石、褐煤、秸秆、堆肥、糖厂废料等作为吸附材料。用于吸附的载体细度须达到一定的要求，并需预先灭菌。载体灭菌的方法主要有射线灭菌、微波灭菌、湿热蒸气灭菌及瞬间干燥灭菌法等，载体的pH应在6.57.0左右。在实际生产中为了保证根瘤菌肥的功效，一些企业常采用种子球化(种子丸衣化)技术，即豆科作物的种子表面用粘着剂粘着根瘤菌剂，外面包上一些包衣材料如碳酸钙、保水剂、少量的化肥，然后播种。常用的粘着剂是羧甲基纤维素。1.3.2 农业应用生物固氮在农业生产中具有十分重要的作用。氮素是农作物从土壤中吸收的一种大量

25、元素，土壤每年因此要失去大量的氮素。如果土壤每年得不到足够的氮素以弥补损失，土壤的含氮量就会下降。土壤可以通过两条途径获得氮素：一条是含氮肥料（包括氮素化肥和各种农家肥料）的施用；另一条是生物固氮。科学家在20世纪80年代推算过，全世界每年施用的氮素化肥中的氮素大约有8×10t，而自然界每年通过生物固氮所提供的氮素，则高达4×10t。 1.3.2.1 拌种 对豆科作物进行根瘤菌拌种，是提高豆科作物产量的一项有效措施。播种前，将豆科作物的种子沾上与该种豆科作物相适应的根瘤菌，这显然有利于该种豆科作物结瘤固氮。特别是新开垦的农田和未种植过豆科作物的土壤中，根

26、瘤菌很少，并且常常不能使豆科作物结瘤固氮，更需要进行根瘤菌拌种。对比实验表明，在其他条件相同的情况下，经过根瘤菌拌种的豆科作物，可以增产10%20%。 1.3.2.2 绿肥用豆科值物做绿肥，例如将田箐、苜蓿或紫云英等的新鲜植物直接耕埋或堆沤后施用到农田中，可以明显增加土壤中氮的含量。科学家统计过，一般地说，1hm农田使用7500kg绿肥，可以增产粮食750kg。如果用新鲜的豆科植物饲养家畜，再将家畜的粪便还田，则既可以使土壤肥沃，又可以获得更多的粮食和畜产品。 总而言之，现在人类生产氮肥使用的化学方法。不仅需要高温、高压等非常苛刻的条件，而且还浪费大量原料，氮分子的有效利用

27、率很低。固氮菌每年从空气中约固定15亿吨氮肥，是全世界生产氮肥总量的几倍。所以，科学家正在认真研究固氮酶的构成。中国科学家在本世纪70年代仿制出与固氮酶功能相似、能够固氮的分子。相信在不远的将来，人类一定能学会并利用固氮菌“巧施氮肥”的本领。1.3.2 研究前景当前，我国的生物固氮研究集中在根瘤菌，生物固氮基础研究有待加强。国外生物孤单研究已进入一个新阶段，其特点是多学科交叉，基础研究和应用前景相结合，分别在分子、细胞、个体和生态等多层次水平上进行探索性研究，如：固氮基因表达的氨阻遏和氧敏感机制；共生结瘤固氮中植物与微生物相互关系的基因表达和调控；根瘤菌结瘤因子的结构和人工合成；根瘤菌及其宿主

28、植物的基因组学转录组学和蛋白质组学；固氮酶的结构和功能及其化学模拟；固氮效率的提高及其在农业和环境保护中的应用，最终把固氮基因直接导入到非豆科植物。这些研究要求生物学、农学、化学和物理学等学科的交叉结合，引入新概念和新技术，综合进行，这些任务的解决对人类社会带来巨大的益处不可估量，这也是我国生物固氮的研究方向。生物固氮是自然界生态系统中氮的主要来源，与工业固氮相比，它具有耗能低、效率高、无污染、分布广等一系列优点。在农业上，孤单细菌能增强土壤肥力，提高农作物产量和质量；同时它能减少化肥、农药使用量，从而能够净化环境、维持生态平衡、促进可持续发展。而且一些固氮细菌能在动物的消化道中生活，与动物建

29、立一定的联生关系，进行固氮。这些方面的研究都具有很好的前景，将会把生物固氮带入新的天地。固氮菌肥料是利用固氮微生物将大气中的分子态氮气转化为农作物能利用的氨，进而为其提供合成蛋白质所必需的氮素营养肥料。微生物自生或与植物共生，将大气中的分子态氮气转化为农作物可吸收的氨的过程，称为生物固氮。生物固氮是在极其温和的常温常压条件下进行的生物化学反应，不需要化肥生产中的高温、高压和催化剂，因此，生物固氮是最便宜、最干净、效率最高的施肥过程。固氮菌肥料是最理想、最有发展前途的肥料。1.4 本课题研究的目的、意义 大气中的氮，必须通过以生物固氮为主的固氮作用，才能被植物吸收利用。动物直接或间接地以植物为食

30、物。动物体内的一部分蛋白质在分解过程中产生的尿素等含氮废物，以及动植物遗体中的含氮物质，被土壤中的微生物分解后形成氨，氨经过土壤中的硝化细菌的作用，最终转化成硝酸盐，硝酸盐可以被植物吸收利用。在氧气不足的情况下，土壤中的另一些细菌可以将硝酸盐转化成亚硝酸盐并最终转化成氮气，氮气则返回到大气中。除了生物固氮以外，生产氮素化肥的工厂以及闪电等也可以固氮，但是，同生物固氮相比，它们所固定的氮素数量很少。可见，生物固氮在自然界氮循环中具有十分重要的作用。2 材料和方法2.1 材料2.1.1 土样及菌种从铜绿山植物周围采集到青葙根际土、蓖麻根际土、杨树非根际土、白牙根际土、杂草根下土、高铜土等土壤土样。

31、从中稀释分离得到23株能在无氮培养基上良好生长的固氮菌株。2.2.2 仪器设备表2-1主要仪器设备仪器及型号生产厂家PH030A型培养箱/干燥箱QYC2112恒温震荡器SWCJ2FD型双人单面净化工作台BCD539WT冰箱LDZX75KBS高温蒸汽灭菌锅AR2140电子天平MG96G PCR仪DYY6C型电泳仪TD6大容量台式离心机上海恒科技有限公司上海福玛实验设备有限公司苏州净化设备有限公司青岛海尔股份有限公司中海申安医疗器械厂梅特勒托利多仪器有限公司杭州朗基科学仪器有限公司北京市六一仪器厂长沙湘智离心机仪器有限公司2.1.2 培养基 1、NFb培养基： 苹果酸 5.0g ，磷酸氢二钾 0.

32、5g ，硫酸镁 0.2g ，氯化钠 0.1g ，氯化钙 0.02g ，Vitamin solution 1mL(生物素 10mg ，Pyridoxol-HCl 20mg，水 100mL)，Micronutrient solution 2mL(硫酸铜 40mg ，硫酸锌 0.12g ，硼酸 1.4g ，钼酸钠 1.0g ，硫酸锰 1.175g ，水 1000mL），1.64%FeEDTA 4mL ，KOH 4.5g ，水 1000mL ，pH为6.57.0 ，121灭菌20min。 2、LB培养基： 蛋白胨 10g ，酵母提取物 5g ，氯化钠 10g ，水 1000mL ，pH为6.57.0

33、，121灭菌20min。3、MB培养基： A液（稀释3倍）蛋白胨 5.0g ，柠檬酸铁 0.1g ，氯化钠 19.45g ，氯化镁 8.8g ，硫酸钠 3.24g ，氯化钙 1.8g ，氯化钾 0.55g ，碳酸氢钠 0.16g ，溴化钾 0.08g ，水 1000mL。 B液（稀释300倍）氯化锶 34.0mg ，硼酸 22.0mg ，硅酸钠 4.0mg ，氟化钠 2.4 mg ，硝酸铵 1.6mg ，磷酸氢二钠 8.0mg ，水 1000mL。121灭菌20min。 2.2 方法2.2.1 实验方案土壤稀释分离筛选菌种微生物纯化抗铜性能研究固氮能力检测16srDNA测序2.2.1 土壤稀释

34、分离 称土样0.5g，迅速倒入带玻璃球的49.5mL无菌水瓶中，震荡510min，使土样充分打散，即成为土壤悬液。用无菌移液管吸取土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为稀释液。2.2.2 培养基制备 按照NFb培养基配方配制500mL培养液，并加入7.510.0g琼脂粉，灭菌后，倒入无菌培养皿中备用。2.2.3 涂布平板 于土壤稀释液中吸取100L悬菌液注入无菌培养皿中，使用涂布器涂布均匀。置于28培养箱中培养45天，观察细菌生长状况。2.2.4 筛选菌种 待培养皿中有微生物菌落生成，观察菌落形态特征，挑选出在无氮培养基中生长状态良好且具有独特形态特征的单菌落，在培养皿背面做下标记。置

35、于4冰箱中，保藏备用。2.2.5 分离方法 制备好若干NFb固体培养基，在无菌操作台用接种环对标记好的菌落进行平板划线分离。28培养45天，观察细菌生长状况。2.2.6 微生物纯化2.2.6.1 挑菌离心 将分离至NFb固体培养基上的单菌落挑至5mL LB液体培养基中。在2830，150rpm培养箱中培养。12天，长至浑浊后立即取出，用1.5mL EP管吸取菌液1.0mL，在转速8000rpm的离心机中离心10min。离心后去除上清液。2.2.6.2 水洗 向离心后的EP管中加入0.9%氯化钠溶液，置于离心机，8000rpm离心10min，取出去除上清液。反复两次。2.2.6.3 半固体培养基

36、培养 按照培养基配方配制500mL NFb半固体培养基（加入0.2%0.5%染色剂）,灭菌后于超净台倒入试管中，保藏备用将水洗后的细菌挑至NFb半固体培养基中，然后置于28培养箱中培养45天，观察细菌生长状况。2.2.7 固氮能力的检测 将菌种培养于血清小瓶中，在2830下培养2448小时，将血清小瓶盖在无菌条件下，并换成橡胶塞，用无菌注射器抽出10%的气体，然后给每瓶注入2mLC2H2 ，再置培养箱中培养2448小时。从各养瓶中取气样10L，注入气相色谱仪(GC)中，测C2H2，C2H4的生成情况。然后从气相色谱仪显示屏的C2H4峰值中判断有无C2H4的产生，以接种但未注入C2H2的试管作为

37、对照。按下列公式计算固氮酶活性：N=(hx × C × V)/(hs × 常数 × t)式中hx为样品峰值；hs为标准C2H4峰值；C为标准C2H4浓度（nmol·mL）；V为试管体积(mL)；常数为标准C2H4在测试时的体积（mL）；t为样品培养时间（h）；N为产生的C2H4浓度。2.2.8 固氮菌抗铜性能研究2.2.8.1 抗铜浓度选择本课题选用CuCl作为铜的来源。抗铜梯度 ：0.5mg/mL 、1mg/mL 、5mg/mL 、10mg/mL 、20mg/mL 、50mg/mL 、100mg/mL 。2.2.8.2 配制培养基按照配方各配

38、制500mL NFb和MB培养基（固体培养基加入7.510.0g琼脂粉）。准备14个50mL三角瓶，分别贴上标签，注明N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7和M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7。 准备28个培养皿，贴上标签，每两个为一组，分别注明N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7和M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7。剪切若干正方形牛皮纸。将牛皮纸、培养基、三角瓶、100mL量筒放入灭菌锅灭菌，121，灭菌20min。2.2.8.3 制作平板用灭菌后的牛皮纸分别称取两份CuCl： 0.0667g 、0.1331g 、0.665g 、1.332g 、2.664g 、6.659g

39、 、13.319g 。包好后，分别标注1、2、3、4、5、6、7，放入超净台，备用。于灭菌后的超净台中，将1号牛皮纸内的CuCl分别倒入标有N1、M1的三角瓶中，依次类推，把牛皮纸内的CuCl倒入到三角瓶中。用量筒量取50mL NFb培养基倒入标有N1的三角瓶中，震荡三角瓶至CuCl完全溶解，然后将三角瓶内的培养基倒入到两个都标有N1的培养皿中。同样的方法，将NFb以及MB培养基分别倒入到相应的培养皿中，冷却，待用。待培养皿凝固后，在培养皿背面将其分区，注明区号，如图。2.2.8.4 接种在平板相同的区域内接入同一种固氮菌，做下记录。然后将接种后的培养基放入28培养箱中培养45天，观察细菌生长

40、状况。2.2.9 PCR菌种鉴定2.2.9.1 挑选单菌落挑选待测菌株单菌落，培养到NFb液体培养基中，在2830，150rpm培养箱中培养，备用。2.2.9.2 活化取NFb液体培养基中菌液1mL，加入到MB液体培养基中，在2830，150rpm培养箱中培养，备用。待菌液浑浊，有底物生成时，加入25%甘油，置于-20冰箱保藏。保藏方法是取500L MB培养基菌液于1.5mL EP管中，然后再想EP管中加入500L 50%甘油，即可。2.2.9.3 离心取待测菌种保藏EP管，置于2030水浴锅中，2min后取出。在转速为1000rpm的离心机中离心2min。2.2.9.4 沸水浴离心后，去除上

41、清液，加入50L超纯水。然后置于水浴锅中，沸水浴10min。之后，再用离心机，1000rpm，离心1min。2.2.9.5 取菌液 于2.2.9.4中EP管取上清液2L ，注入0.5mLEP管中，标记，备用。2.2.9.6 配制待测液按照以下规格配制待测液：标准液50LHO37Lbuffer缓冲液5LdNTP4LDNA(上清液）2L2TF引物1L1492R引物1LTa酶0.25L2.2.9.7 PCR扩增待测液置于PCR仪中，设置 引物=27F + 1492R ，35 cycle = 94 50s +53 50s +72 1min 10s ，退火=72 6min ，保存=4 59min按下启动

42、按钮，2h 30min后取出进行下一步操作。2.2.9.8 电泳将配制好的待测液置于电泳槽，设置 U= 99V ，I= 67mA ，T=30 。30min后取出。 3 实验结果与分析3.1 菌种分离纯化结果 表3-1-1 第一次菌种筛选 土壤编号菌种生长情况是否选用1蓖麻 非根际土1无菌是2高铜土2菌种较少是3高铜土3菌种较少是4杨树 非根际土4无菌否5杨树 根际土5菌种理想是6杂草根下土6菌种理想是7杂草根下土7菌种理想否在本次菌种筛选中：杂草 根下土两个土样菌种生长都比较理想，可以选用高铜土两个土样菌种生长不密集，选择下次继续培养杨树 非根际土无菌种生成，选择下次继续培养杨树 根际土菌种生

43、长密集，菌落形态突出，可以选用蓖麻 非根际土无菌种生成，选择下次继续培养3表3-1-2 第二次菌种筛选土壤编号菌种生长情况是否选用1蓖麻 非根际土1无菌否2杨树 非根际土2菌种较少否3鬼针草非际土3无菌否4鬼针草非根际土4无菌否5鬼针草A非根际土5无菌否6刺槐非根际土6菌种较少否7青葙非根际土7菌种较少否8青葙非根际土8菌种较少否在本次菌种筛选中：蓖麻 非根际土复选中仍然没有菌种生成，下次筛选中选用蓖麻 根际土杨树 非根际土复选中有少量菌种生成，下次筛选中选用杨树 根际土鬼针草均无菌种生成刺槐非根际土有少量菌种生成，下次继续培养，同时选用刺 槐根际土青葙非根际土有少量菌种生成，下次继续培养表3

44、-1-3 第三次菌种筛选土壤编号菌种生长情况是否选用1青葙 根际土1菌种较少是2青葙非根际土2菌种理想是3刺槐根际土3菌种理想是4刺槐非根际土4菌种较少否5蓖麻 根际土5菌种理想是6杨树 根际土6菌种理想是7白牙 根际土7菌种理想是8杂草根下土8菌种理想是在本次菌种筛选中：青葙 根际土有粉色菌落生成青葙非根际土菌种仍然较少刺槐根际土菌种理想刺槐非根际土菌种长势不理想蓖麻 根际土菌种理想杨树 根际土菌种理想白牙 根际土菌种理想杂草根下土菌种理想表3-1-4 最终选用菌种土壤菌种编号1青葙 根际土1-1、1-52刺槐根际土2-2、2-3、2-4、2-5、2-63青葙非根际土3-2、3-44蓖麻 根

45、际土4-1、4-2、4-3、4-7、4-8、4-95高铜土5-46杨树 根际土6-37白牙 根际土7-1、7-2、7-3、7-4、7-5、7-6 由表3-1-4可知，在筛选的土样中，植物根际土壤相比非根际土壤中固氮菌的固氮性能强，菌种在培养基中生长比较理想。通过进一步的筛选得到了表3-4中23株固氮能力较为显著的菌株，其中菌株1-1、1-5、2-3、4-1、4-9、7-1、7-4、7-6菌落形态上都是较小的圆形菌落，干燥，难挑起，颜色带有粉色，鉴于其与其他菌株的特异之处可以进一步检测其固氮能力。菌株2-2、2-5、2-6、3-2、3-4、5-4、6-3、7-2、7-5菌落湿润，粘稠，易挑起，表

46、面光华，比其他细菌的菌落大而厚，颜色为白色。菌株4-2、4-3菌落也均为较小的圆形，相比之前粉色菌落这些菌株的菌落呈现米黄色。菌株2-4、4-8菌落较小，干燥，菌落从中心的白点向周围发散开，菌株颜色为白色。菌株4-7菌落较小，圆润，颗粒感明显，菌株呈现米白色。菌株7-3菌落为扁平圆形，干燥多皱，不易挑起，菌株颜色呈现白色。经菌落初步判断可知，菌株1-1、1-5、2-2、2-3、2-5、2-6、3-2、3-4、4-1、4-2、4-3、4-9、5-4、6-3、7-1、7-2、7-3、7-4、7-5、7-6为细菌。菌株2-4、4-7、4-8为放线菌。3.2 菌种抗铜性能检测3.2.1 菌种选择在检测

47、固氮菌抗铜性能的实验中，菌株的选择很重要。由于实验中培养基加入了高浓度的铜，对固氮菌存活能力也有一定的要求，故选择了经过之前分离纯化后得到的固氮能力最强的几个菌株作为抗铜实验的菌株。它们分别是1-5、2-3、3-2、4-1、4-2、4-9、5-4、7-6。实验将以上8株固氮菌接种到新的培养基上，挑选出菌落形态独特的菌种，并标记下来，作为接种的菌株。表3-2-1 抗铜选择菌株菌株土壤区域编号14-1-1白牙 根际土124-9-1白牙 根际土234-9-2白牙 根际土344-1-2白牙 根际土453-2青葙 根际土564-2白牙 根际土675-4高铜土782-3蓖麻 根际土892-3-1蓖麻 根际

48、土9101-5-1杨树 根际土10117-6-1白牙 根际土11121-5-2杨树 根际土123.2.2 接种用灭菌过的牙签挑取培养皿中的单菌落，分别在7个浓度梯度的培养皿中轻轻划线接种。每个菌株接入对应的平板区域，对号入座，如菌株4-1-1接入到培养皿的1号区域。每个菌株接种两次，避免意外情况发生。NFb培养基和MB培养基相对照，查看菌株在两个不同培养基中的生长情况，进一步检测固氮菌在不同培养基上的抗铜性能。接种完成后，将培养皿放入28培养箱中培养，隔日观察菌种生长状态。 下表为抗铜实验中培养皿各区域菌种的生长情况 表3-2-2 NFb培养基 Cu浓度单位 ：mg/mL菌株浓度0.5 1 5 10 20 50100123456789101112 表3-2-3 MB培养基 Cu浓度单位 ：mg/mL菌株浓度0.5 1 5 10 20 501001234567891011