BT基因工程概论学习课程

1、1概 论第1页/共77页第一页，编辑于星期五：十二点 二十五分。2 要要 求求 1 1、掌握掌握基因工程的概念基因工程的概念 2 2、掌握掌握基因工程的基本过程基因工程的基本过程 3 3、熟悉熟悉工具酶和载体类型及应用工具酶和载体类型及应用 4 4、熟悉熟悉原核、真核细胞转染、表原核、真核细胞转染、表 达的基本方法和类型。达的基本方法和类型。 5 5、熟悉熟悉基因工程产生的基础和过程基因工程产生的基础和过程 ( (科研思维与方法）。科研思维与方法）。6. 6. 设计一个基因克隆的程序设计一个基因克隆的程序。第2页/共77页第二页，编辑于星期五：十二点 二十五分。3参考书参考书 楚雍烈，楚雍烈，

2、 现代生物技术（西安交通大学讲义）现代生物技术（西安交通大学讲义） Gene cloning, T.A. Brown.Gene cloning, T.A. Brown. 基因工程原理，吴乃虎编著，科学出版社基因工程原理，吴乃虎编著，科学出版社 基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社 分子克隆实验指南，分子克隆实验指南，J. Sambtook, EF Frish, T J. Sambtook, EF Frish, T Maniatis, Maniatis, 金冬雁，黎孟枫等译，科学出版社。金冬雁，黎孟枫等译，科学出版社。第3页/共77页第三页，编

3、辑于星期五：十二点 二十五分。4 生物技术的核心内容生物技术的核心内容 基因工程基因工程 （Gene engineering） DNA重组（recombinant DNA technology） 基因操作（gene manipulation） 基因克隆（gene cloning） 分子克隆（molecular cloning） DNA克隆（DNA cloning） 基因修饰（gene modification） 第4页/共77页第四页，编辑于星期五：十二点 二十五分。5基因工程的概念基因工程的概念基因工程的意义基因工程的意义基因工程的发展史基因工程的发展史理论上的六大发现理论上的六大发现技术上

4、的六大进展技术上的六大进展发展过程中的重大事件发展过程中的重大事件基本步骤基本步骤: :两个水平，六个阶段两个水平，六个阶段 内容提要内容提要第5页/共77页第五页，编辑于星期五：十二点 二十五分。6 一、基因工程的概念一、基因工程的概念 定义：定义： 人们按照人们按照预定设计预定设计，在，在体外体外对对不同来源不同来源DNADNA分子分子进行人工切割、连接、插入载体进行人工切割、连接、插入载体DNADNA分子，使遗传分子，使遗传物质物质重新组合、改造重新组合、改造，经经转移转移、导入到原先不含有导入到原先不含有重组体的重组体的受体细胞受体细胞，使之持续稳定繁殖、目的基使之持续稳定繁殖、目的基

5、因扩增、表达，获得人类所需的因扩增、表达，获得人类所需的产品产品的工程。的工程。第6页/共77页第六页，编辑于星期五：十二点 二十五分。7With Restriction enzymesWith Restriction enzymeswith DNA ligase enzyme(Genetic transformation)第7页/共77页第七页，编辑于星期五：十二点 二十五分。8基因工程的基本内涵基因工程的基本内涵 基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，

6、使之按照人们的意愿稳定遗传并体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的表达出新产物或新性状的DNADNA体外操作程序，也称为体外操作程序，也称为分子克隆技术。分子克隆技术。 因此，因此，供体、受体、载体供体、受体、载体是重组是重组DNADNA技术的三大技术的三大基本元件。基本元件。体外重建、基因转移体外重建、基因转移和和外源表达外源表达是重组是重组DNADNA技术的三大环节。技术的三大环节。第8页/共77页第八页，编辑于星期五：十二点 二十五分。9 基因工程的基本特征基因工程的基本特征 基因工程有两个重要的特征：基因工程有两个重要的特征： 一是可把来自一是可把来自任何任何

7、生物的生物的基因基因重组重组和和转移转移到与其毫无关系的到与其毫无关系的任何任何其他受体细其他受体细胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状；胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状； 二是某一段二是某一段DNADNA可在受体细胞内进行可在受体细胞内进行基因复制基因复制和和表达表达，为准备大量纯化的为准备大量纯化的DNADNA片片段提供了可能，拓宽了分子生物学的研究领域。段提供了可能，拓宽了分子生物学的研究领域。第9页/共77页第九页，编辑于星期五：十二点 二十五分。10 基因工程的目的基因工程的目的 （1 1）获得目的基因，）获

8、得目的基因，DNADNA的提取、纯化和的提取、纯化和 DNADNA分子的克隆，分子的克隆，建立文库建立文库。 （2 2）制备活性多肽产品：激素、细胞因）制备活性多肽产品：激素、细胞因 子、多肽药物疫苗等，子、多肽药物疫苗等，诊断和防治诊断和防治 疾病疾病。 （3 3）研究）研究基因结构、功能基因结构、功能等等第10页/共77页第十页，编辑于星期五：十二点 二十五分。11二、基因工程的重大意义二、基因工程的重大意义（1 1）重组）重组DNADNA技术填平了生物种属间技术填平了生物种属间 不可逾越的鸿沟。不可逾越的鸿沟。 跨越天然物种屏障，将原核和真核生跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、植物和动

9、物，造福人类，在过去人们物、植物和动物，造福人类，在过去人们难以置信的事情，现在已成为现实。难以置信的事情，现在已成为现实。第11页/共77页第十一页，编辑于星期五：十二点 二十五分。12 （2 2）重组）重组DNADNA技术缩短了进化时间。技术缩短了进化时间。 遗传和变异是一对矛盾，遗传赋予生遗传和变异是一对矛盾，遗传赋予生物种的稳定，变异赋予生物种的进化。在物种的稳定，变异赋予生物种的进化。在漫漫历史长河中，自然变异的进化时间是漫漫历史长河中，自然变异的进化时间是千万年，常规育种亦要几年；而重组千万年，常规育种亦要几年；而重组DNADNA技术将进化时间大大缩短至几年。基因操作技术将进化时间

10、大大缩短至几年。基因操作用于育种，将缩短进化时间，在解决全世界用于育种，将缩短进化时间，在解决全世界人民温饱问题上将发挥重要作用。人民温饱问题上将发挥重要作用。第12页/共77页第十二页，编辑于星期五：十二点 二十五分。13（3 3）重组）重组DNADNA技术使人类能对生物技术使人类能对生物 进行定向改造进行定向改造 重组重组DNADNA技术标志着人类控制和改造生物的技术标志着人类控制和改造生物的历史已进入一个新纪元。以重组历史已进入一个新纪元。以重组DNADNA技术培育技术培育出抗真菌蔬菜为例，几丁质是真菌细胞的组出抗真菌蔬菜为例，几丁质是真菌细胞的组分之一，几丁质酶能水解几丁质，美国科学分

11、之一，几丁质酶能水解几丁质，美国科学家将几丁质酶基因导入西红柿、土豆、莴苣家将几丁质酶基因导入西红柿、土豆、莴苣和甜菜中，正准备大田试验，这一技术将对和甜菜中，正准备大田试验，这一技术将对蔬菜抗真菌感染具有重要意义。蔬菜抗真菌感染具有重要意义。第13页/共77页第十三页，编辑于星期五：十二点 二十五分。14（4 4）利用重组）利用重组DNADNA技术可以在体外大技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制，从而拓究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域。宽了分子生物学的研究领域。 第14页/共77页第十四页，编辑于星期

12、五：十二点 二十五分。15（5 5）医学上应用更为广泛，涉及各领域）医学上应用更为广泛，涉及各领域 正常人类生命活动的分子机制；正常人类生命活动的分子机制； 人类各种疾病发生的分子机理；人类各种疾病发生的分子机理； 人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、 肥胖、心血管疾病、传染病等病因肥胖、心血管疾病、传染病等病因 的查明、诊断、治疗和预防。的查明、诊断、治疗和预防。 药物的研发和生产；药物的研发和生产； 疾病模型的建立；疾病模型的建立； 人类的营养、健康、长寿和保健人类的营养、健康、长寿和保健（亚健康）（亚健康）第15页/共77页第十五页，编辑于星期五：十二点 二十

13、五分。16第16页/共77页第十六页，编辑于星期五：十二点 二十五分。17 本课程的地位：本课程的地位：现代科技革命现代科技革命高新技术高新技术生物技术生物技术基因工程基因工程基因克隆基因克隆第17页/共77页第十七页，编辑于星期五：十二点 二十五分。18基因工程不是发现，而是创造。基因工程不是发现，而是创造。第18页/共77页第十八页，编辑于星期五：十二点 二十五分。19改变传统农业概念 让植物生产人体蛋白质 生产促性腺绒毛激素的矮牵牛第19页/共77页第十九页，编辑于星期五：十二点 二十五分。发光的水稻第20页/共77页第二十页，编辑于星期五：十二点 二十五分。21 只只 有有 想想 不不

14、 到到 的的 没没 有有 办办 不不 到到 的的基因重组基因重组第21页/共77页第二十一页，编辑于星期五：十二点 二十五分。22 第一节第一节 基因工程的基因工程的发生与发展发生与发展第22页/共77页第二十二页，编辑于星期五：十二点 二十五分。23 一、基因工程诞生的理论基础一、基因工程诞生的理论基础 2020世纪中期分子遗传学理论的重大进展世纪中期分子遗传学理论的重大进展 六大发现六大发现： 1 1确定了生物确定了生物遗传的物质基础遗传的物质基础是是DNADNA 肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化试验肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化试验 噬菌体噬菌体DNADNA转化实验转化实验 第23页/共7

15、7页第二十三页，编辑于星期五：十二点 二十五分。24 19441944年，美年，美国微生物学家国微生物学家AveryAvery证明基证明基因就是因就是DNADNA分子，分子，提出提出 DNADNA是遗是遗传信息的载体。传信息的载体。第24页/共77页第二十四页，编辑于星期五：十二点 二十五分。252 2DNADNA分子分子双螺旋结构双螺旋结构模型模型和和半保留复制半保留复制 DNADNA碱基配对规律和碱基配对规律和X X衍射衍射研究研究 DNADNA双螺旋结构模型。双螺旋结构模型。 第25页/共77页第二十五页，编辑于星期五：十二点 二十五分。第26页/共77页第二十六页，编辑于星期五：十二点

16、 二十五分。27 3 3生物遗传的生物遗传的“中心法则中心法则”解决了遗传信息的流向和遗传性状的相互关系，解决了遗传信息的流向和遗传性状的相互关系，揭示了生命遗传信息传递基本规律。揭示了生命遗传信息传递基本规律。 自我复制，遗传信息由亲代传给子代；自我复制，遗传信息由亲代传给子代； 通过转录，遗传信息传给通过转录，遗传信息传给RNARNA； 通过翻译，信息传给蛋白质和酶；通过翻译，信息传给蛋白质和酶； 基因型决定生物的表型。基因型决定生物的表型。DNA RNA protein第27页/共77页第二十七页，编辑于星期五：十二点 二十五分。ReplicationReplication Transc

17、riptionReverse Transcription Translation中心法则（the central dogma）DNARNAProtein第28页/共77页第二十八页，编辑于星期五：十二点 二十五分。第29页/共77页第二十九页，编辑于星期五：十二点 二十五分。30 4 4“操纵子操纵子”学说揭示了基因表学说揭示了基因表达达 和调控的概念。和调控的概念。 基因组结构基因组结构 基因分布基因分布 基因表达基因表达 基因调控的原理基因调控的原理 酶诱导的本质酶诱导的本质 第30页/共77页第三十页，编辑于星期五：十二点 二十五分。31 5 5破译了全部生物破译了全部生物遗传密码遗传密

18、码， 确定了它在生物界的通用确定了它在生物界的通用 性，人类更加具体地了解性，人类更加具体地了解 遗传信息表达规律。遗传信息表达规律。第31页/共77页第三十一页，编辑于星期五：十二点 二十五分。32遗传密码表目 录第32页/共77页第三十二页，编辑于星期五：十二点 二十五分。33mRNA分子上从5 至3 的方向,每3个核苷酸构建一个密码子，编码某一特定氨基酸或作为蛋白质合成的起始、终止信号，称为三联体密码(triplet codon)，也称遗传密码子(genetic codon)。解决了信息语言的对应关系。第33页/共77页第三十三页，编辑于星期五：十二点 二十五分。34 终止密码 ： 翻译

19、终止的密码，不代表任何氨基酸。有翻译终止的密码，不代表任何氨基酸。有3 3个：个：UAAUAA、UAGUAG、UGAUGA 代表氨基酸的密码：64 64 3 = 3 = 6161 起始密码： AUGAUG 在在mRNAmRNA起始部位时为起始密码。否，为起始部位时为起始密码。否，为MetMet密码。密码。密码: 43 = 64 第34页/共77页第三十四页，编辑于星期五：十二点 二十五分。35 1) 通用性 遗传密码具有的特点 从原核生物到人类都使用同一套遗传密码。从原核生物到人类都使用同一套遗传密码。 已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体

20、。物细胞的叶绿体。2) 方向性方向性第35页/共77页第三十五页，编辑于星期五：十二点 二十五分。363) 连续性第36页/共77页第三十六页，编辑于星期五：十二点 二十五分。374) 简并性目 录第37页/共77页第三十七页，编辑于星期五：十二点 二十五分。385) 摆动性第38页/共77页第三十八页，编辑于星期五：十二点 二十五分。39 6 6、生物进化，基因突变、生物进化，基因突变、 获得的性状可以获得的性状可以遗传到遗传到 后代。后代。第39页/共77页第三十九页，编辑于星期五：十二点 二十五分。40 分子遗传学理论上的六大进展解决了分子遗传学理论上的六大进展解决了 生命现象的遗传物质

21、基础（均是核酸）生命现象的遗传物质基础（均是核酸） 结构模型（同类构件、双螺旋）结构模型（同类构件、双螺旋） 复制方式（相似的机制）复制方式（相似的机制） 遗传信息流动方向（共同的中心法则）遗传信息流动方向（共同的中心法则） 遗传密码（共用一套相同的密码）遗传密码（共用一套相同的密码） 表达和调控的机理（类同的方法）表达和调控的机理（类同的方法） 基因突变机理、意义（变异与进化）基因突变机理、意义（变异与进化） 为基因工程技术的诞生典定了理论基础为基因工程技术的诞生典定了理论基础。 理论上的可行性。理论上的可行性。 第40页/共77页第四十页，编辑于星期五：十二点 二十五分。41二、分子遗传学

22、新方法是基因工程二、分子遗传学新方法是基因工程的的 技术基础技术基础（六大技术六大技术） 首当其冲的是要解决：首当其冲的是要解决： 如何自如地得到目的基因；如何自如地得到目的基因； 如何在体外改造基因，得到重组体；如何在体外改造基因，得到重组体； 如何在体外转移重组基因；如何在体外转移重组基因； 直到直到2020世纪世纪7070年代中期，相继出现了年代中期，相继出现了 几项关键性技术，梦想成真。几项关键性技术，梦想成真。第41页/共77页第四十一页，编辑于星期五：十二点 二十五分。421 1工具酶的发现工具酶的发现： DNADNA分子的切割和连接技术分子的切割和连接技术 19701970年年S

23、mithSmith发现了第一个发现了第一个型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，RE) Hinf对对DNADNA分分 子有特异地切割作用。子有特异地切割作用。 （手术刀剪）（手术刀剪） 同年同年KhoranaKhorana又发现了又发现了T4DNAT4DNA连接酶（连接酶（LigaseLigase），）， 能将能将DNADNA片段连接在一起。片段连接在一起。（缝纫机、浆糊）（缝纫机、浆糊） DNADNA、RNARNA聚合酶和反转录酶等合成酶聚合酶和反转录酶等合成酶。（复印机）（复印机） 构成了一个研究DNA、 RNA分子的工具酶箱。第42页/

24、共77页第四十二页，编辑于星期五：十二点 二十五分。43 2 2、DNADNA片段片段载体系统载体系统的构建的构建 目的基因、目的基因、DNADNA片段不能复制，也易破坏。必须连到具有复制能力的片段不能复制，也易破坏。必须连到具有复制能力的DNADNA分子上。分子上。 载体（载体（vector)vector) 是能携带外源是能携带外源DNADNA、能自我复制的小、能自我复制的小DNADNA分子。分子。 最早发现的是：质粒、噬菌体和病毒。最早发现的是：质粒、噬菌体和病毒。第43页/共77页第四十三页，编辑于星期五：十二点 二十五分。443 3、大肠杆菌、大肠杆菌受体细胞系统受体细胞系统建建立立

25、体外获得的含目的基因或体外获得的含目的基因或DNADNA片段的重组体，虽具有自我复制的片段的重组体，虽具有自我复制的本能，但没有原料、酶系统和生命活力。必须将其安全转移到宿主细胞才能本能，但没有原料、酶系统和生命活力。必须将其安全转移到宿主细胞才能进行增殖，赋予其进行增殖，赋予其“生命生命”。第44页/共77页第四十四页，编辑于星期五：十二点 二十五分。454 4、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA转化体系转化体系建立建立 19701970年发现氯化钙处理过的细胞易于吸收接纳外源年发现氯化钙处理过的细胞易于吸收接纳外源DNADNA； 19721972年年Cohen CCohen C报道，质粒报道，

26、质粒DNADNA也能被大肠杆菌吸收。也能被大肠杆菌吸收。 而后发现经过改造的质粒、噬菌体和病毒都可以携带目的而后发现经过改造的质粒、噬菌体和病毒都可以携带目的DNADNA片段和片段和基因，经过转化大肠杆菌，建立该基因的无性繁殖系。基因，经过转化大肠杆菌，建立该基因的无性繁殖系。第45页/共77页第四十五页，编辑于星期五：十二点 二十五分。46 5、 DNA分析、鉴定技术 酶切分析技术（核酸酶切分析技术（核酸分辨分辨仪）仪） 核酸分子杂交技术（核酸核酸分子杂交技术（核酸探测探测仪）仪） 序列分析（密码序列分析（密码复读复读机）机） 生物信息学（生物信息学（密码破译机） 第46页/共77页第四十六

27、页，编辑于星期五：十二点 二十五分。47 6 6、DNADNA分离、纯化及鉴定分离、纯化及鉴定技术技术 凝胶电泳：凝胶电泳：Agarose, PAGE gelAgarose, PAGE gel 离心技术离心技术 层析技术层析技术 印迹技术印迹技术: Southern blot: Southern blot . 第47页/共77页第四十七页，编辑于星期五：十二点 二十五分。48 技术上的技术上的可行性可行性 六大技术方法的建立六大技术方法的建立 实际上的实际上的可操作性可操作性 材料、实验条件、时空条件、材料、实验条件、时空条件、 经济条件和政策。经济条件和政策。 基础方面的基本条件（基础方面的

28、基本条件（可能性可能性+ +可行性可行性+ + 可操作性可操作性）具备，尚需人的科学）具备，尚需人的科学创新思维创新思维+ + 艰苦的实践艰苦的实践。才能得到创新的发明、发现才能得到创新的发明、发现 和成果。和成果。第48页/共77页第四十八页，编辑于星期五：十二点 二十五分。49 19701970年，年， MIT MIT 的科学家率先提出在的科学家率先提出在体外把不同来源的遗传物质进行重组的设体外把不同来源的遗传物质进行重组的设想，但遭到反对，不予支持。没能进行试想，但遭到反对，不予支持。没能进行试验。验。 19721972年，年， BoyerBoyer等在发现限制性核酸等在发现限制性核酸内

29、切酶内切酶EcoR I EcoR I 的基础上，开始了实验。的基础上，开始了实验。第49页/共77页第四十九页，编辑于星期五：十二点 二十五分。50 1972 1972年年BergBerg等人使用等人使用EcoRIEcoRI在体外在体外对对猴病毒猴病毒SV40SV40的的DNADNA和和噬菌体噬菌体的的DNADNA分分别酶消化，再用别酶消化，再用T T4 4DNADNA连接酶将两种片段连接酶将两种片段连接起来，得到连接起来，得到SV40SV40和和 DNA DNA的重组杂的重组杂种种DNADNA分子分子，率先完成了世界上第一次率先完成了世界上第一次成功的成功的DNADNA体外体外不同物种之间不

30、同物种之间的的DNADNA重组重组实验（片段重组）。实验（片段重组）。基因工程的大胆尝试第50页/共77页第五十页，编辑于星期五：十二点 二十五分。51基因工程的诞生1980年年Nobel化学奖化学奖19721972年斯坦福大学的年斯坦福大学的Paul BergPaul Berg小组完成了小组完成了首次体外重组实验。首次体外重组实验。 Berg的开创性实验的开创性实验第51页/共77页第五十一页，编辑于星期五：十二点 二十五分。52 1973 1973 年年 Cohen Cohen 成功地进行了另一个体外成功地进行了另一个体外DNADNA重组实验。重组实验。 分别把编码卡那霉素和四环素抗性基因

31、的两种分别把编码卡那霉素和四环素抗性基因的两种质粒酶切、连接，再将这种重组的质粒酶切、连接，再将这种重组的DNADNA分子转化分子转化大肠杆菌，某些转化菌落具有既抗卡那霉素又大肠杆菌，某些转化菌落具有既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗体特性。抗四环素的双重抗体特性。 他的工作是世界上第一次成功的他的工作是世界上第一次成功的基因克隆基因克隆实验，实验，并有基因表达及新的表型并有基因表达及新的表型。标志着基因工程的诞标志着基因工程的诞生。生。第52页/共77页第五十二页，编辑于星期五：十二点 二十五分。53pSC101第53页/共77页第五十三页，编辑于星期五：十二点 二十五分。54第54页/共77页

32、第五十四页，编辑于星期五：十二点 二十五分。55 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片段同后来又把非洲爪蟾核糖体基因片段同pSC101pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的并在菌体内成功转录出相应的mRNAmRNA。这是第一次成功的基因表达实验。这是第一次成功的基因表达实验。第55页/共77页第五十五页，编辑于星期五：十二点 二十五分。56 19741974年，年，首次实现异源间基因重组。首次实现异源间基因重组。 把小鼠的生长激素抑素基因在把小鼠的生长激素抑素基因在大肠杆菌中表达。大肠杆菌中表达。第56页/共77页第五十六页，编辑于星期五：十二点 二十五

33、分。57 1976年，世界上第一个基因公司在美国成立，世界上第一个基因公司在美国成立，“GenetechGenetech”注册登记，意注册登记，意味着基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。味着基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。 生物工程从此进入产业生物工程从此进入产业化。化。第57页/共77页第五十七页，编辑于星期五：十二点 二十五分。58 1978 1978年年，人类的第一个基因被克隆。人类的第一个基因被克隆。人生长激素抑素基因被重组到大肠杆人生长激素抑素基因被重组到大肠杆菌的质粒菌的质粒DNADNA中中 。 1978-19791978-1979胰岛素基因在大肠杆菌中胰岛素基因在大肠

34、杆菌中表达。表达。第58页/共77页第五十八页，编辑于星期五：十二点 二十五分。59 1982 1982年年 1 1、把大白鼠的生长激素基因克隆、转移、把大白鼠的生长激素基因克隆、转移到小鼠的受精卵内，到小鼠的受精卵内， 第一个转基因超级鼠诞生。第一个转基因超级鼠诞生。 2 2、人胰岛素基因的、人胰岛素基因的cDNA cDNA 被克隆、成功被克隆、成功表达和开始成为商品上市。表达和开始成为商品上市。 基因产品有效益、开始新兴产业。基因产品有效益、开始新兴产业。 第59页/共77页第五十九页，编辑于星期五：十二点 二十五分。60三、基因工程的基本步骤三、基因工程的基本步骤 两个水平，六个阶段两个

35、水平，六个阶段第60页/共77页第六十页，编辑于星期五：十二点 二十五分。61基因工程包括分子和细胞两个水平操作基因工程包括分子和细胞两个水平操作 分子水平操作指的是基因重组、克隆和表达的设计与重组体构建（即重组分子水平操作指的是基因重组、克隆和表达的设计与重组体构建（即重组DNADNA技术）；技术）； 细胞水平操作则指转化、筛选和培养工程菌或细胞以及表达产物的分离纯细胞水平操作则指转化、筛选和培养工程菌或细胞以及表达产物的分离纯化过程。化过程。第61页/共77页第六十一页，编辑于星期五：十二点 二十五分。62 1 1分子水平操作阶段：分子水平操作阶段： 获得含目的基因的重组体分子（亦称重组子

36、）。获得含目的基因的重组体分子（亦称重组子）。 本阶段的操作有三个主要环节：本阶段的操作有三个主要环节： （1 1）分分离：提取、分离含目的基因的离：提取、分离含目的基因的DNADNA分子分子和载体和载体DNADNA分子，在分离提取过程中，注意质、分子，在分离提取过程中，注意质、量，减少损伤。量，减少损伤。 （2 2）切切割：选择合适的割：选择合适的RERE工具酶，分别对外源工具酶，分别对外源目的目的DNADNA分子和载体分子和载体DNADNA分子进行酶解切割。分子进行酶解切割。 （3 3）连连接：用接：用DNADNA连接酶，将目的基因与载体连接酶，将目的基因与载体在体外连接为一个重组在体外连

37、接为一个重组DNADNA分子，并进行鉴定。分子，并进行鉴定。第62页/共77页第六十二页，编辑于星期五：十二点 二十五分。63第63页/共77页第六十三页，编辑于星期五：十二点 二十五分。64第64页/共77页第六十四页，编辑于星期五：十二点 二十五分。65切割：切割：连接酶连接酶连接：连接：第65页/共77页第六十五页，编辑于星期五：十二点 二十五分。66 2.2.细胞水平操作阶段：细胞水平操作阶段： 把含目的基因的重组体导入受体细菌或受体把含目的基因的重组体导入受体细菌或受体细细 胞，赋予其胞，赋予其“生命生命”让其表达，获得产品。让其表达，获得产品。 本阶段的操作也有三个主要环节。本阶段

38、的操作也有三个主要环节。 （1 1）转转移：利用移：利用DNADNA转移技术，把构建的重组体导转移技术，把构建的重组体导入到受体菌或受体细胞中，获得工程菌或工程细胞入到受体菌或受体细胞中，获得工程菌或工程细胞。 （2 2）筛筛选：利用核酸杂交，酶切分析、选：利用核酸杂交，酶切分析、PCRPCR和表型和表型特征等技术，筛选出已克隆化的工程菌特征等技术，筛选出已克隆化的工程菌/ /细胞。细胞。 （3 3）表表达：大量培养含重组体的工程菌达：大量培养含重组体的工程菌/ /细胞，诱细胞，诱导其表达，并对表达产物进行鉴定，提取和纯化。导其表达，并对表达产物进行鉴定，提取和纯化。第66页/共77页第六十六页，编辑于星期五：十二点 二十五分。67转移：转移：第67页/共77页第六十七页，编辑于星期五：十二点 二十五分。68筛选：筛选：第68页/共77页第六十八页，编辑于星期五：十二点 二十五分。69表达：表达：第69页/共77页第六十九页，编辑于星期五：十二点 二十五分。 重组重组DNADNA操作一般步骤操作一般步骤：（1 1）分分离离：提取和获得目的基因