脓汁和粪便标本中病原菌的检测

1、脓汁和粪便标本中病原微生物的检测 摘要 通过革兰氏染色并在油镜下观察细菌形态结构、细菌的生化反应和细菌的血清学反应等手段区别和鉴定脓汁标本中和粪便标本中细菌， 检测病原微生物， 并进行细菌药物敏感性试验。 关键词 脓汁标本、粪便标本、分离培养、革兰氏染色、细菌生化反应鉴定、细菌动力学试验、细菌血清学试验、细菌药物敏感性试验前言医学微生物学检查的目的是通过病原体的分离鉴定及检测病人的免疫应答等，以达到对传染性疾病做出病原学诊断， 并根据实验室检查结果进行合理的药物治疗与防护。临床的标本常含有很多杂菌， 必须进行分离和纯化。常见的化脓性病原菌有葡萄球菌，链球菌脑膜炎球菌等。 脓汁标本在做细菌分离培

2、养的同时，均需直接涂片检查， 观察是否有典型形态的菌体、芽孢有无， 为临床提供最初诊断。粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基， 尽可能抑制杂菌， 以利于病原体的检出。通过革兰氏染色并在油镜下观察细菌形态结构、 细菌的生化反应和细菌的血清学反应等手段可以区别和鉴定细菌的种类。细菌药物敏感性实验可以防止细菌产生耐药性和确保治疗效果，同时也为细菌种类的鉴别提供了佐证。1. 材料与方法1.1培养基制备1.11材料天平、称量纸、药勺、干粉培养基、酒精灯、三角烧瓶、量筒、试管、试管架、5ml 吸管、吸头、棉塞、标签纸、牛皮纸、皮筋1.12 方法称取一定量的肉汤培养基，至于三角烧瓶中

3、，加入适量的蒸馏水，煮沸一次，趁热分装；称取一定量的营养琼脂培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸三次（煮至刚刚冒泡，立刻置于台面，半分钟后再煮） ，使完全溶解，趁热分装。 （平板培养基：以无菌操作，倾注平皿 10ml，琼脂完全凝固后，平板倒放， 4冰箱保存备用。斜面培养基：培养基趁热斜放，培基不超过试管长度的 2/3 ，琼脂凝固以后， 4冰箱保存备用。 ）贴上标签后灭菌使用。1.2 细菌分离培养材料脓汁标本、粪便标本、普通营养琼脂培平板、伊红美蓝琼脂平板、接种环、酒精灯方法接种前，接种环烧灼灭菌。取标本在平板表面上方密集涂布5 10 mm2。烧掉接种环上多余的标本。冷却后，应用分区划

4、线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2 份），粪便标本接种于伊红美蓝平板（2 份）。接种完毕后，接种环烧灼灭菌。将平板倒置37培养 1824h, 观察结果。1.3 细菌的群体生长特性观察和纯化培养材料接种环、酒精灯、细菌分离培养物、斜面培养基方法观察细菌分离培养物中菌落特征，并记录。选取平板上相同的菌落数多的，典型的，容易挑取的单菌落。通过无菌操作轻刮取菌，接种于斜面培养基中。接种完毕，灼烧接种环，斜面培养基置于37培养过夜。1.4 细菌的个体形态特征的观察材料斜面培养物、营养肉汤、生理盐水2 支、镜油瓶、拭镜纸一套，吸水纸1 本，载玻片、结晶紫染液（第 1 液）、芦戈氏碘液（第 2 液）

5、，95%酒精（第 3 液），稀释石碳酸复红（第 4 液）、染色架方法斜面培养物的观察革兰氏染色： 取洁净载玻片， 用灭菌操作后的接种环取生理盐水1-2 环于玻片上， 挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀。待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回2-3 回合，使标本固定，进行染色。结晶紫染液初染1 分钟后水洗，芦戈氏碘液媒染一分钟后水洗，95%酒精脱色 20-30s ，水洗，稀释复红复染一分钟后水洗。待标本凉干后滴加香柏油，油镜下观察。通过无菌操作， 分别在斜面培养物中挑取菌苔少许， 立即移入肉汤培养基管中， 在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤调和，使菌液混合语培养基中，混匀。接种完毕，试管口通

6、过火焰 2-3 次灭菌，塞好棉塞。接种环灼烧后放下。1.5. 细菌的糖发酵实验材料粪便标本分离菌、接种针、小砂轮、葡萄糖发酵微量管、乳糖发酵微量管方法通过无菌操作， 用灭菌接种针刮取新鲜细菌培养物少许，分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内。将微量管平放在平皿内，37培养过夜后观察结果。1.6 血浆凝固酶实验材料脓汁标本分离菌、兔血浆、生理盐水、载玻片方法取干净玻片一张，用记号笔一分为二，其中一格加兔血浆1-2 滴，另一格加生理盐水1 滴。将接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌冷却后，取细菌新鲜培养物少许，在生理盐水中研磨混匀成细菌悬液。 用灭菌接种环取细菌悬液1 环，或挑取细菌培养物少许，在

7、兔血浆中轻轻抹匀。稍等片刻，观察结果。1.7 血清学实验材料福氏志贺菌诊断血清、载玻片、粪便标本分离菌方法取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul 。远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul ，用接种环分别取粉红色菌苔，约2 个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内， 混合均匀。 载玻片来回倾侧，让菌液充分混匀，凝集速度更快、 结果更清楚。1.8 半固体穿刺培养材料半固体培养基、接种针、酒精灯、粪便标本分离菌方法接种针灭菌处理后挑取菌苔少许，垂直刺入半固体培养基中心，可刺达近底管处，但不要到达管底，然后沿原路退出。接种完毕，试管口迅速通过火焰2-3 次灭菌，塞好棉塞。接种

8、针灼烧后放下。 37培养过夜。1.9 细菌药物敏感性试验材料脓汁标本肉汤培养物、粪便标本肉汤培养物。 MH 琼脂平板、青霉素、链霉素、庆大霉素药物纸片，尺子方法接种环取菌液3 5ul × 2 次 , 在平板培养基表面，拉出2 条细菌接种线， 使呈 “十字形”。平板密集划线接种细菌。设计三点，呈等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，镊子火焰灭菌。 37 18 24 小时培养，观察结果。2 结果脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落，菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。粪便

9、标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明。淡粉红色菌落半透明，直径1 2mm。粪便标本平板脓汁标本平板用伊红美蓝平板 , 从粪便标本分离、 获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。 显微镜下，均为 G-杆菌，散在排列。用普通平板，从脓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状。G+球菌G-杆菌粪便标本分离菌糖发酵试验中，紫黑色菌落菌种的葡萄糖和乳糖微量发酵管都为黄色，有气体产生；粉红色菌落菌种的葡萄糖微量发酵管为黄色，不产气，乳糖微量发酵管无明显变化。脓汁标本分离菌血浆凝固酶实验中，黄色菌种菌液出

10、现明显凝块，实验结果为阳性；白色菌种未出现明显凝块实验结果为阴性。玻片凝集试验中，粉红色菌落菌种出现片状凝集现象，实验结果为阳性；紫黑色菌落菌种实验结果为阴性。半固体培养基中， 紫黑色菌落菌种扩散生长， 培养基呈扩散云雾混沌状态； 粉红色菌落菌种沿穿刺线生长，穿刺线边缘整齐，周围培养基清澈透明。脓汁和粪便标本细菌检测结果血浆凝固葡萄糖发乳糖发酵半固体培标本菌落形态血清学实酶试验酵试验试验养基动力验学试验黄色G+球+脓汁标本白色G+球紫黑色G杆粪便标本粉红色G杆+黄色菌落菌种的抑菌圈直径大小分别为：青霉素40mm,庆大霉素20mm，链霉素 20mm。白色菌落菌种的抑菌圈直径大小分别为：青霉素40

11、mm,庆大霉素22mm，链霉素24mm。粉红色菌落菌种的抑菌圈直径大小分别为：青霉素无作用, 庆大霉素20mm，链霉素 12mm。紫黑色菌落菌种的抑菌圈直径大小分别为：青霉素无作用, 庆大霉素30mm，链霉素24mm。各种菌落抑菌圈直径一览表青霉素庆大霉素链霉素黄色菌种40mm20mm20mm白色菌种40mm22mm24mm紫黑色菌种无作用20mm12mm粉红色菌种无作用30mm24mm3 讨论3.1 实验结果分析用普通平板， 从脓汁标本中分离得到黄色、 白色两种菌落， 这两株细菌， 显微镜油镜下均为 G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌分别是金黄色

12、葡萄球菌和白色葡萄球菌。致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白, 附着于菌体表面, 形成凝块。通过血浆凝固酶实验，金黄色葡萄球菌实验结果阳性，为致病菌。用伊红美蓝平板，从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌落。紫黑色金属光泽的产生是因为乳糖被分解产酸，酸使伊红美和蓝紫结合，产生紫黑金属光泽菌落。黑色菌落是能分解乳糖的大肠埃希菌。致病菌不能分解乳糖，菌落呈现伊红的颜色。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，它们都是G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。经糖发酵试验（紫黑色菌落菌种分解葡萄糖和乳糖，产酸产气；粉红色菌落菌种只能分解葡

13、萄糖，产酸不产气） 半固体动力试验 （紫黑色菌落菌种半固体动力试验结果阳性，有鞭毛；粉红色菌落菌种半固体动力试验结果阴性，无鞭毛）。对照常见肠道感染细菌主要生化反应特征，判定它们分别是大肠埃希菌和福氏志贺菌。通过血清学实验，粉红色菌落菌种与福氏志贺菌诊断血清发生凝集反应，进一步确定其为福氏志贺菌。肠道杆菌科各菌属生化反应鉴别表葡萄糖乳糖麦芽糖甘露醇蔗糖半固体埃希菌属+志贺菌属+/-/+-沙门菌属/+-+霍乱弧菌+-+变形杆菌-+属注： +产酸或阳性， 产酸产气， -阴性， +/-多数阳性，-/+多数阴性 不确定。常见肠道感染细菌主要生化反应特征葡萄糖乳糖半固体大肠埃希菌+福氏志贺菌+伤寒沙门菌

14、+霍乱弧菌+幽门螺杆菌不分解糖类+变形杆菌+对照常用药敏试验纸片判断标准，金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌对青霉素、素、链霉素均敏感。大肠埃希菌对青霉素耐药，庆大霉素、链霉素敏感，福氏志贺菌对青霉素耐药，对庆大霉素、链霉素敏感。可得结论G+球菌对青霉素和链霉素敏感。G-霉素耐药，对链霉素敏感。G+球菌和 G-杆菌对广谱抗菌素庆大霉素都敏感。庆大霉杆菌对青常用药敏试验纸片判断标准抑菌圈直径 (mm)抗菌药物纸片含药量耐药中度敏感敏感青霉素 G(葡萄10 单位 28 29球菌 )链霉素10 微克 1112 14 15庆大霉素10 微克 1213 14 15四环素30 微克 1415 18 19氯霉素30 微克 1213 17 18磺胺300 微克 1213 16 17综上所述， 脓汁标本中分离得金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌，致病菌为金黄色葡萄球菌；粪便标本中分离得大肠埃希菌和福氏志贺菌，致病菌为福氏志贺菌。3.2 人为操作失误与结果分析实验的各个环节都要严格进行无菌操作。 如果无菌操作不严格， 会产生杂菌影响实验结果。在进行细菌分离培养时，如果培