15流式细胞术09

1、 第 一 部 分流式细胞术的一般介绍facscaliburbd lsrfacs vantage diva科研型（大型机）特点：多数字化适用用各类细胞分选4路分选facsaria科研型细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能激光光源单波长、高强度、高稳定性多采用氩离子激光器或氦氖激光器一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmuv激光最多检测13个荧光参数 longpass shortpass bandpass460 500 540460 500 540460 500 540光收集系统：滤光片 光收集系统：光电倍

2、增管（光收集系统：光电倍增管（pmt）液流系统：流动室、液流驱动系统液流系统：流动室、液流驱动系统液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱细胞分选系统fluorescence activated cell sorting488 nm laser+-charged platessingle cells sortedinto test tubesfals sensorfluorescence detector信号检测-散色光fsc（小角散射)光它反应细胞的相对大小和截面积的大小90度角散射光)全血细胞流式全血细胞流式fsc-ssc图图它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区

3、分自发荧光 特异荧光特异荧光能量级激发激发态发射激光能量损失单参数直方图（histogram）x轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率二维等高图和密度图pseudo 3d plot3d plot dot plot便于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式光谱交叉emission wavelength (nm) 530 580 630 680 730 780fitcpepe-trpe-cy54 colors - simultaneous collection两色以上荧光分析存在

4、光谱交叉荧光补偿荧光补偿方法方法所有补偿调为“0”调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿 样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋单细胞 悬液 标记荧光抗体检测表型测定细胞分选流式细胞术操作流程统计学 分析继续培养 细 胞 周 期 分 析上机去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用圈门去除细胞碎片，分析细胞凋亡圈门去除粘连体，分析细胞周期细胞凋亡分析 1.细胞核的改变：细胞核的改变： 由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞料对凋亡细胞dna可染性发生改变。可染性发生改变。研究表明，用各种染色

5、体荧光染料对经固定的凋亡细研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其胞进行染色，其dna可染性降低。许多学者把这种可染性降低。许多学者把这种dna可染性的降低可染性的降低认为是认为是凋亡细胞的标志之一凋亡细胞的标志之一。2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。 在流式细胞仪上，前散射光（ fsc ）与细胞的大小有关， 侧散射光（ssc）反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。 在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。 双阴：活细胞 annexin v-pe单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞 7-aadd单阳：坏死细胞人外周血淋巴细胞亚群检测人外周血淋巴细胞亚群检测 t淋巴细胞t淋巴细胞检测淋巴细胞检测淋巴细胞r1cd4+t（th)淋巴细胞检测淋巴细胞检