色谱法分离原理2PPT课件

1、18.1 18.1 概述 色谱法或层析法( (chromatography) )，是一种物理或物理化学分离分析方法。 原理：利用物质在固定相和流动相中的分配系数不同，使混合物中的各组分分离。 以前学过的分离方法有： 1.1.沉淀法 是利用物质溶解度的不同而进行分离。 2.2.蒸馏法 是利用有机物沸点的差异进行分离。 3.3.萃取法 是利用组分在水相和有机相（互不相溶）中的分配素数不同进行而分离。第1页/共76页 一一 色谱分析法简介色谱分析法简介 色谱法创始于20世纪初，1906年俄国植物学家Tsweet将碳酸钙放在竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。 Micha

2、el Tswett(1872-1919),a Russian botanist , discovered the basic principles of column chromatography. He separatedplantpigments by eluting a mixture of the pigme-nts on a column of calcium carbonate. Thevarious pigments separated into colored ba-nds; hence the name chromatography.第2页/共76页植物色素分离图示第3页/共

3、76页二 色谱法分离原理 分离原理:物质的分配系数差异。三 色谱法分类 色谱法可从不同的角度进行分类：1.按流动相与固定相的分子聚集状态分类 在色谱法中流动相可以是气体、液体和超临界流体(gas chromatography,GC、liquid chromatography,LC、supercritical fluid chromatography,SFC)。 按固定相为固体(如吸附剂)或液体，气相色谱法又可分为GSC与GLC；液相色谱法又可分为LSC及LLC。第4页/共76页2.2.按操作形式分类 柱色谱法(column chromatography)是将固定相装柱管内构成色谱柱，色谱过程在

4、色谱柱内进行。按色谱柱的粗细等，又可分为填充柱(packed column)色谱法、毛细管柱(capillary column)色谱法及微填充柱(microbore packedcolumn)色谱法等类别。 第5页/共76页3.按色谱过程的分离机制分类 可 分 为 分 配 色 谱 法 ( p a r t i t i o n chromatography)、吸附色谱法(adsorption chromatography)、离子交换色谱法(ion exchange chromatography，IEC)、空间排阻色谱法(steric exclusionchromatography，SEC)及亲合色

5、谱法(affinity chromatography)等类型。第6页/共76页色谱法简单分类如下表:色谱法气相色谱法填充柱色谱法毛细管色谱法（GC）GLCGSC液相色谱法（LC）平板色谱柱色谱法经典液相柱色谱法高效液相色谱法（HPLC）薄层色谱法（TLC）纸色谱法SECLSCLLCLLCSECLSCIECLLC高效毛细管电泳法（HPCE）超临界流体色谱法（SFC）第7页/共76页18.2 色谱法基础知识、基本概念和术语18.2.1 色谱流出曲线: 024681012024681002468101202468100246810120246810第8页/共76页 一 基线 在实验条件下，色谱柱后仅

6、有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。 使基线发生细小的波动的现象称为噪音。 基线在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。 第9页/共76页二 峰高（h h） 色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。可用mm,mV,mA表示。 h第10页/共76页 宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。区域宽度通常有三种表示方法：标准偏差 ：峰高0.607 倍处峰宽处的一半。半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。 W1/2=2.354 峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。 W= 4 三 区域宽度第11页/共76页 四 色谱峰面积A 色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰

7、面积。 对于对称的色谱峰 A=1.065hW1/2 对于非对称的色谱峰 A=1.065h(W0.15+W0.85)/2第12页/共76页 五 保留值 组分在色谱柱中停留的数值，可用时间t t 和所消耗流动相的体积来表示。固定相、流动相固定，条件一定时，组分的保留值是个定值。(1)(1)比移值 Rf=ux/u=nm/(nm+ns)(2)(2)死时间( (tM) ) 不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间。它与色谱柱的空隙体积成正比。第13页/共76页 (3)保留时间tR 试样从进样到出现峰极大值时的时间。 (4) 调整保留时间 某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中

8、的滞留时间。即 RMRtttRtMtLu 柱长死时间第14页/共76页(5) (5) 死体积VM 色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。 忽略后两项可得到：(6) (6) 保留体积VR 指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。MMcoVt F其中，Fco为柱出口的载气流速（mL/min) RRcoVtF第15页/共76页 (7) 调整保留体积 某组份的保留体积扣除死体积后的体积。 tM VM与被测组分无关，因而 更合理地反映了物质在柱中的保留情况。 (8)相对保留值r2,1 组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。MRRRcoVVVtF

9、RMcoVtFRV222,111RRRRtVrtVRVRt.RiRii sRsRstVtV第16页/共76页 r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！ 具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰 i 对标准峰的相对保留值，此时以 表示：( )( )RSt it s 1, 又称选择因子第17页/共76页 （9 9） 保留指数 规定正构烷烃保留指数为分子中碳原子个数乘以100100，如正己烷、正庚烷的保留指数分别为600600和700700。 被测物质的保留指数I IX X可采用两个相邻正构烷烃的保留

10、指数进行测定 将碳数为n n和n+1n+1的正构烷烃加到被测物质x x中进行色谱分析，测得它们的保留值第18页/共76页保留指数计算方法)lglglglg100,111RnRnRnRxxRnRxRnRxRnRnttttnIxtttttt（的保留指数被测物质，且和利用上式求出未知物的保留指数与文献值对照利用上式求出未知物的保留指数与文献值对照n ）tR(n+1)第19页/共76页 六 分配系数和分配比 在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡叫分配平衡，组分在两相中的分配行为常采用分配系数K和分配比k来表示。1 1 分配系数(K)： 它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分

11、配达平衡时的浓度之比值，即smccK 溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度第20页/共76页 K与，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。 实验条件固定时，K主要取决于固定相性质。 某组分的K = 0时，表明组分不被保留即惰性组分第21页/共76页 2. 2. 分配比： 在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，称为分配比。它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。也叫容量因子或容量比。 smmmssmmcVkc V组分在固定相中的质量组分在流动相中的质量k也等于组分的校正保留时间与死时间的比值RMtkt第22页/共76页 3.3. K 与与 k 的关

12、系：的关系： 称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的 参 数 。 对 填 充 柱 ， = 6 3 5； 对 毛 细 管 柱 ，=60600。 注意：注意：K K 或或 k k 反映的是某一组分在两相反映的是某一组分在两相间的分配；而间的分配；而 是反映两组分间的分离情况！是反映两组分间的分离情况！当两组分当两组分 K K 或或 k k 相同时，相同时， =1=1 时，两组分时，两组分不能分开；当两组分不能分开；当两组分 K K 或或 k k 相差越大时，相差越大时， 越大，分离得越好。也就是说，两组分在两相越大，分离得越好。也就是说，两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。间的分配

13、系数不同，是色谱分离的先决条件。 和和 k k 是计算色谱柱分离效能的重要参数是计算色谱柱分离效能的重要参数！/sssmmmmscmVVKkkcmVV第23页/共76页 例1:1:从色谱测得组分1 1流出时间为16min30s，组分2 2流出时间为26min，空气流出时间为1min30s，求： （1 1） 组分2 2对组分1 1的相对保留时间 （2 2） 色谱柱对组分1 1的容量比 （3 3） 组分2 2的分子在固定相中停留时间 解解 ：(1) 2,1=(tR2-tM)/(tR1-tM) =(26.0-1.5)/(16.5-1.5)=1.63 (2) k=(tR1-tM)/tM=(16.5-1

14、.5)/1.5=10.0 (3) tR2=26.0-1.5=24.5min第24页/共76页色谱流出曲线的意义色谱流出曲线的意义色谱峰数样品中单组份的最少个数；色谱保留值定性依据；色谱峰高或面积定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据第25页/共76页18.3 色谱法基本理论18.3.1 塔板理论塔板理论 在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论塔板理论用于色谱分析法。 第26页/共76页塔板理论假定：1）塔板之间不连续；2）塔板之间无分子扩散；3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达

15、至平衡， 达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔 板体积加入。第27页/共76页 ( (一）色谱分离过程：第28页/共76页第29页/共76页( (二) ) 色谱流出曲线方程21222RRVVNVRNMceV12max2RNMcV22maxRRVVNVcce22maxRRttNtcce第30页/共76页 ( (三) )柱效 对一个色谱柱来说，若色谱柱长度固定L L，每一个塔板高度H H越小，塔板数目越多，分离的效果越好，柱效越高。塔板数用n n 表示。 n =L/H 或 H=L/n H越小，n越多，分离效果越好，用

16、H,n评价柱效。 由塔板理论导出n与W，W1/2 的关系。 n=5.54(tR/W1/2)2 =16(tR/W)2 第31页/共76页 有时n n大，分离效果也不好，因用tR内含tm，后来改用有效塔板数。n 有效= 5.54 (tR/ W1/2)2=16 (tR/W)2 H有效n 有效n理 = 5.54 (tR/W1/2)2=16 (tR/W)2 H理n 理第32页/共76页(1)当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，

17、应指明测定物质。(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数 K 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。第33页/共76页 塔板理论的成功之处，提出了计算理论塔板高度、塔板塔板理论的成功之处，提出了计算理论塔板高度、塔板数的公式及评价柱效的方法，具有开创性，但有一定局限数的公式及评价柱效的方法，具有开创性，但有一定局限性性: :塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。第34页/共76页 前面已知，用塔板理论来说明色谱柱内各组分的分离过程并不合理，因为色谱柱内并没有塔板。当同一试样进入同一色谱柱，当流动相速度变化时

18、，得到不同的色谱图。测得的n和H也不同，充分说明塔板理论不足以说明色谱柱的分离过程。18.3.2 速率理论范弟姆特方程式： 第35页/共76页18.3.2.1 气相色谱的速率理论1 涡流扩散项涡流扩散项(12) 在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性同一组分运行路线长短不同流出时间不同峰形展宽。第36页/共76页 展宽程度以1 12 2表示：1 12 2 =2 =2 dpLdpL 其中dpdp填充物平均直径； 填充不规则因子。 减小1 12 2 ：固定相颗粒应适当细小、均匀填充要均匀。 对于空

19、心毛细管柱，无涡流扩散，即1 12 2=0=0。 第37页/共76页 待测组分是以“塞子”的形式被流动相带入色谱柱的，在“塞子”前后存在浓度梯度，由浓稀方向扩散，产生了纵向扩散，使色谱峰展宽。 （2 2）分子扩散项2 22 2 （纵向扩散项） 第38页/共76页 22 是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相的几何形状对分子扩散的阻碍情况。 D为组分在流动相中扩散系数（cm2s-1）。 Dg 气相扩散系数比液相扩散系数Dm大的多（约105倍）第39页/共76页 减小纵向扩散项22采取措施： 适当提高流动相流速u u，减小保留时间 用相对分子质量较大的气体作流动相。 适当

20、降低柱温c c . .1DMr第40页/共76页 3 32 2流动相传质阻力系数 组分从流动相移动到固定相表面进行两相之间的质量交换时所受到的阻力，质量交换慢，引起色谱峰变宽。（3 3）流动相传质阻力项3 32 2和固定相传质阻力项4 42 2 222320.01(1)pgdkL ukD采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体作载气, ,可减少3 32 2, ,提高柱效。第41页/共76页 4 42 2 固定项传质阻力系数 即组分从两相界面移动到固定相内部，达分配平衡后，又返回到两相界面，在这过程中所受到的阻力为固定相传质阻力。组分在固定相中扩散系数固定液的膜厚度22423(1)fSdkL u

21、kD第42页/共76页减小42采取措施： 降低固定液的含量, ,可以降低液膜厚度, ,但k k随之变小, ,又会使42增大。 当固定液含量一定时, ,液膜厚度随载体比表面积增加而降低, ,因此, ,一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度。 降低固定液液膜厚度( (42df2) )并且液膜要均匀；若膜厚，扩散，费时；但不能太薄，否则包不住载体。 提高柱温, ,虽然可以增大D1, ,但会使值减小, ,为了保持适当的值, ,应该控制适宜的柱温。 第43页/共76页 u 为流动相线速度； A，B，C为常数，其中A分别表示涡流扩散系数；B分子扩散系数；C传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。在流

22、动相流速一定时:、最小时，才小，n 才最高，柱效高。、最大时，才大，n 才最小，柱效低。BHACuu第44页/共76页为提高柱效，小，应注意以下几点：）采用适当小而均匀的载体，柱填充应均匀。）固定液液膜薄而均匀，并且不宜流失。）载气流速小的时候，u u是影响的主要因素，选r r大的载气，；载气流速大的时候，C Cu u是影响的主要因素，选r r小的载气，H H2 2，NeNe）采用适当的柱温。 气相色谱气相色谱 uDskkdDdkkuDdHfgpgp)1(32)1(01. 02222222第45页/共76页18.3.2.2 液相色谱的速率理论速率理论虽然实在研究气液色谱时提出的, ,但作适当修

23、改, ,也使用于液相色谱, ,其板高方程可写成如下形式: : 式中Ce、Cm、Cd、Cs、Csm为有关项的板高系数, ,当填料一定时均为定值; ;DM和DS分别是组分在流动相和固定相的扩散系数; ;df为固定相层的厚度. .12221sfsmpdMMepsMMPC dC dC DDHuC dDDC d uu ()()()() ()第46页/共76页 表示涡流扩散项.LC与GC相似,涡流扩散项和填料的粒径有关. 填料粒径越小,涡流扩散项越小,反之亦然 项是流动区域内,流动相的传质阻力.它指出流动相通过同一流路时,在接近固定相表面的流速比在流动相中间的要慢一些.(1) 增大DM即组分在流动相的扩散

24、系数;(2) 减小填料的粒径;(3) 减小流动相的流速.1epC d2MMPDC d u第47页/共76页项表示分子扩散项.在液相色谱中,由于组分在液体中的扩散系数比在气相中小45个数量级,因此在液相色谱中,分子扩散项通常可以忽略不计.(1)减小减小DM即组分在流动相的扩散系数即组分在流动相的扩散系数;(2)增大流动相的流速增大流动相的流速. 项为固定相传质阻力.该项与气液色谱中固定相传质阻力项相同.(1)增大增大DS即组分在固定相的扩散系数即组分在固定相的扩散系数;(2)减小减小df即固定相层的厚度即固定相层的厚度;(3)减小流动相的流速减小流动相的流速.第48页/共76页项是流动相停滞区域

25、内的传质阻力.固定相孔穴中的流动相,一般是不移动的.流动相中溶质分子与固定相进行交换时,必须首先扩散进入滞留区.如固定相的微孔小且深,就会大大减慢传质速率.(1)增大增大DM即组分在流动相的扩散系数即组分在流动相的扩散系数;(2)减小填料的粒径减小填料的粒径;(3)减小流动相的流速减小流动相的流速.第49页/共76页综合分析，提高液相色谱柱效的因素可归纳为：增大增大DM和和DS即组分在流动相和固定相的扩散系即组分在流动相和固定相的扩散系数数;减少填料的孔穴深度减少填料的孔穴深度;采用低黏度的流动相采用低黏度的流动相;适当提高柱温适当提高柱温;减小填料的粒径减小填料的粒径减小流动相的流速减小流动

26、相的流速减小减小df即固定相层的厚度即固定相层的厚度LC塔板高度的形式与塔板高度的形式与GC一致，其主要区别在于一致，其主要区别在于扩展扩展项可以忽略，影响柱效的主要因素是传质项。项可以忽略，影响柱效的主要因素是传质项。第50页/共76页HuGC（a）LC（b）GCGC（a a）u u有一最低点有一最低点u u最佳最佳；u u小小或或u u大大，H H都大都大LCLC（b b）u u没有最低点；没有最低点； u u大大，H H增大不多，因增大不多，因此可用较高的流速，提高分析速度此可用较高的流速，提高分析速度第51页/共76页二 液相色谱中的柱外谱带展宽柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩展

27、. . a.a.柱前展宽：主要由进样所引起；b.b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起. . 由于流动相在管壁邻近处的流速明显快于管中心区域的流速, ,从而导致柱外谱带展宽. .为此，连接管的体积、检测器的死体积应尽可能小. . 第52页/共76页柱外效应对板高的总影响Hex可用下式表示: : 式中, , 是流动相的线性流速, ,单位用cms-1;r是管子半径, ,单位用cm;DM是溶质在流动相中的扩散系数, ,单位用cm2s-1. . 采用低黏度的流动相采用低黏度的流动相; ; 适当提高柱温适当提高柱温; ; 采用半径小的管道采用半径小的管道. .224exMr uHDu第53页/

28、共76页18.4 组分分离基本分离方程 柱效能和选择性柱效能和选择性 柱效能柱效能指色谱柱在分离过程中的分离效能，常用n，来描述。 选择性选择性描述两个相邻组分在同一固定相中热力学分布行为的重要参数，用r2,1相对保留值表示.第54页/共76页色谱分离中的四种典型情况色谱分离中的四种典型情况分离效果差，柱效低，分离效果差，柱效低，选择性（选择性（ ）差）差 完全分离，柱效高，完全分离，柱效高，峰窄，选择性（峰窄，选择性（ ）差差 ；完全分离，选择性完全分离，选择性（ ）好，柱效低，峰）好，柱效低，峰宽宽完全分离，柱效高，完全分离，柱效高，选择性（选择性（ ）好）好第55页/共76页一一 分离度

29、分离度色谱柱的总分离效能指标色谱柱的总分离效能指标 1.1.定义：相邻两个峰的保留值之差与两峰宽度平均值之比v分子反映了溶质在两相中分配行为对分离的影响，分子反映了溶质在两相中分配行为对分离的影响，是色谱分离的是色谱分离的热力学因素热力学因素。v分母反映了动态过程溶质区带的扩宽对分离的影分母反映了动态过程溶质区带的扩宽对分离的影响，是色谱分离的响，是色谱分离的动力学因素动力学因素。2121()/ 2RRttRWW18.4.1 分离度第56页/共76页 两个峰两个峰t tR R 相差越大，相差越大，Y Y越窄，值越大，越窄，值越大，说明分离较高。说明分离较高。 .5 .5 两个组分能完全分开。两

30、个组分能完全分开。 .0 .0 两组分能分开，满足分析要两组分能分开，满足分析要求。求。 .0 .0 两峰有部分重叠。两峰有部分重叠。2121()/2RRttRYY第57页/共76页 分离度与柱效能，选择性的关系分离度与柱效能，选择性的关系1 1）分离度）分离度R 与柱效的关系与柱效的关系 由色谱方程可得：由色谱方程可得：2111222()RnLRnL22141knRk18.4.2 分离方程第58页/共76页 2 2）分离度R与选择因子 的关系 改变 的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。 3 3）分离度R 分配比 k 的关系 改变 k 的方法有：适当增加柱温( (GC) )、改

31、变流动相性质和组成( (LC)以及固定相含量。22222116()()1knRk22141knRk第59页/共76页 例题1 已知物质A和B在一根30.00 cm长的柱上的保留时间分别为16.40 min和17.63 min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30 min。峰底宽度分别为1.11 min和1.21 min，计算： （1）柱的分离度； （2）柱的平均塔板数；第60页/共76页解:(1)柱的分离度 (2)柱的平均塔板数 n=16(16.40/1.11)2 = 3493 n=16(17.63/1.21)2 = 3397 n平均=(3493 + 3397)/2 = 3445212117.

32、63 16.401.06()/ 2(1.11 1.21)/ 2RRbbttRWW第61页/共76页 例2:用一根2m长色谱柱将组分A、B分离，实验结果如下： 空气保留时间30s；A峰保留时间230s；B峰保留时间250s；两峰的峰底宽25s。 求：色谱柱的理论塔板数n；A、B各自的分配比；相对保留值；两峰的分离度R；若将两峰完全分离，柱长应该是多少？ 第62页/共76页 解解 ：n=16(tR/W)2=16(250/25)2=1600 kA=tRA/tM=(230-30)/30=6.7 kB=tRB/tM=(250-30)/30=7.3 = tRB/ tRA=220/200=1.1 R=( t

33、RB - tRA)/W=(220-200)/25=0.8 L=nH 对同一个色谱柱,H是一定的 LnR2 L=2(1.5/0.8)27m第63页/共76页18.5.1 定性分析 定性分析的任务是确定色谱图上各个峰代表什么物质。 1.1.利用保留值与已知物对照定性（1 1）利用保留时间定性 在相同色谱条件下，将标准物和样品分别进样，两者保留值相同，可能为同一物质。 18.5 定性和定量分析第64页/共76页第65页/共76页（2 2）利用峰高增量定性 若样品复杂，流出峰距离太近，或操作条件不易控制，可将已知物加到样品中，混合进样，若被测组分峰高增加了，则可能含该已知物。（3 3）利用双色谱系统定性 通过改变色谱条件来改变分离选择性，使不同物质显示不同保留值。例：选用极性差别较大的两种不同固定液来制备色谱柱，不同物质具有不同保留值第66页/共76页2 其它定性方法沸点规律 在一定色谱条件下, ,同族具有相同碳数的碳链异构体, ,其调整保留时间的对数与其沸点呈线性关系 lg tR=A2Tb+C2 A2、C2 均为常数；Tb 为组分的沸点（K） 根据同族同碳数碳链异