微生物实验室规范操作

1、微生物实验室规范操作微生物实验室规范操作卫生部北京医院卫生部北京医院张秀珍张秀珍世界卫生组织（WHO）对临床微生物实验室提出三项指导性方针：l（1）临床微生物实验室尽可能把目标集中在快速诊断快速诊断方面；l（2）显微镜检查显微镜检查对建立快速的初步诊断具有很大价值；l（3）实验室人员必须主动与临床结合，将实主动与临床结合，将实验室数据转化为临床有用的信息。验室数据转化为临床有用的信息。严峻的感染形势l感染性疾病并没有象人类曾经所预料的那样随着抗感染化疗时代的到来而逐一销声匿迹。多种原因造成的易感人群增加易感人群增加;l多重耐药菌多重耐药菌如甲氧西林耐药的金葡菌（MRSA）、产ESBL的肺炎克雷

2、伯菌和大肠杆菌、泛耐药的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等不断涌现并持续蔓延，原先少见的病原如曲霉菌、念珠菌等深部真菌越来越常见;l新发感染病原新发感染病原如SARS、禽流感、手足口病、甲型H1N1流感等也此起彼伏，感染性疾病仍然是人类关注的热点。临床微生物实验室在感染诊疗中的地位l改变感染性疾病的预后，关键是疾病的早期诊断和有早期诊断和有效的抗感染治疗。临床微生物检验在感染性疾病的诊效的抗感染治疗。临床微生物检验在感染性疾病的诊断和治疗中，具有决定性价值断和治疗中，具有决定性价值。l感染主要是由病原微生物引起的，微生物正确检验，是建立准确的感染性疾病病原学诊断和针对性的给予抗感染治疗的前提和基础。

3、良好的微生物检验，可以可以缩短感染确诊的时间缩短感染确诊的时间，同时可以使抗感染治疗准确率提高，从而达到降低医疗费用、改善疾病预后。l而错误的微生物检验，将导致错误的病原学诊断和错而错误的微生物检验，将导致错误的病原学诊断和错误的临床用药决策。误的临床用药决策。临床微生物检验的主要任务l对微生物标本做出快速、准确的鉴定鉴定报告，及时满足临床的需要；l进行有关抗菌药药物耐药性物耐药性方面的各种试验，受理抗菌药物合理应用的咨询；l密切结合临床，与临床医师讨论、研究及处处理理有关感染性疾病的问题；l参与抗菌药物临床合理应用的管理管理和医院感染监测、控制和管理。卫生部 国家中医药管理局 总后卫生部发布

4、卫医发 2004 285 号文件关于实施关于实施抗菌药物临床应用指抗菌药物临床应用指导原则导原则的通知的通知2009-01-9-11卫生部关卫生部关于合理应用抗菌药物的于合理应用抗菌药物的星火计划启动星火计划启动三年三年180个省市个省市8个专业组个专业组,包括微生包括微生物实验室物实验室,药房药房,呼吸呼吸,血液血液,儿科儿科,ICU,感染科感染科,30000-45000个医生或实验个医生或实验室接受培训室接受培训.萌芽计划:2009年6月启动l3年培训450名二级甲等医院微生物实验室技术人员l目的目的l规范常规微生物检验技术l提高基层医院微生物检验人员的业务水平l更新老的实验诊断理念和方法

5、微生物实验室应适应临床需要微生物实验室应适应临床需要l正确正确 规范操作l快速快速 建立新的理念及时报告l有效有效 与临床沟通把实验室数据变为有用的信息 1.标本采集和运输棉 花 纤 维 + 竹 / 木 条 抑抑 菌菌 区区 是是 因因 为为 ： 植植 物物 分分 泌泌 出出 来来 的的 ： 脂脂 肪肪 酸酸 ； 树树 脂脂 ； 福福 尔尔 马马 林林氯 气 ， 重 金 属 与 胶 水 的 影 响 美 国 与 欧 洲 对 实 验 室 的 新 要 求多用途运送系统多用途运送系统 需氧需氧 + + 厌氧厌氧低低 氧氧 化化 的的 环环 境境 不会不会对标本的微生物造成损害对标本的微生物造成损害拭拭

6、 子子 是是 深深 入入 培培 养养 基基 中中 来来 保保 护护 苛苛 养养 菌菌 与与 厌厌 氧氧 菌菌ASM 2004流感嗜血杆菌在三种不同的运送基的存活率流感嗜血杆菌在三种不同的运送基的存活率 2.血液及骨髓标本的收集美国和英国血液培养指南l1. 采血时间：尽可能在用抗生素前，心内膜炎和导管相关性感染例外。l2. 采血量：采一次或采一瓶是错误的，应采套，至少应采一套 2瓶，分需氧和厌氧。2瓶血量不少于16-20ml，先将10ml注入需氧瓶，再将剩余血采血注入厌氧瓶。l3. 采血方法：不要与血气和血沉标本一起采血；不推荐血入瓶前换针头；不推荐静脉血直接入瓶；不宜在静脉导管或静脉留置口采血

7、。血液及骨髓标本l4. 采血间隔：如第一次采集2套（4瓶）血培养标本，在以后的2-5天不必采血，但除外心内膜炎和导管相关性败血症。l5. 儿童：采血量是总血量的1%。，不做厌氧培养l6. 延迟培养瓶处理: 延迟培养瓶不要放冰箱或孵箱,放常温，尽早送往临床细菌室。l7. 皮肤消毒液推荐：建议先用70-80%异丙醇去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。第一次多瓶血液培养的意义第一次多瓶血液培养的意义l提高阳性率l识别定植菌或致病菌l多瓶采样后的以后的2-5天不需采样,可提前获得病原学报告为什么必须同时做厌氧细菌为什么必须同时做厌氧细菌?l16%链球菌l17%肠杆菌科细菌 仅厌氧瓶报告阳性 Bartlett

8、 JG,et al. The controversy regarding routine anaerobic blood cultures. Am J Med , 2000，108:505-506. 需氧菌需氧菌兼性厌氧菌兼性厌氧菌厌氧菌厌氧菌需氧瓶需氧瓶厌氧瓶厌氧瓶病原菌培养更完整菌血症病原菌种类构成抽血量和体重的关系l体重体重 Kg抽血量抽血量 ml套（需氧套（需氧+厌氧）厌氧）=36.340-602-33. 趋向性鉴定试验趋向性鉴定试验 l革兰阳性球菌:l触酶试验触酶试验:3%H2O2用30%的H2O2稀释10倍后使用，避光4度保存 ；试验时设立阳性和阴性对照；1分钟内产生大量气泡为阳性

9、。l凝固酶试验凝固酶试验：采用商品试剂或EDTA抗凝的多个兔混合血浆；测定玻片法测定凝聚因子10秒钟即可观察结果；测定凝固酶需在37度3-4h，若阴性还应放置24h再观察结果。革兰阴性杆菌趋向试验革兰阴性杆菌趋向试验l氧化酶氧化酶:l可用二甲基或四甲基均可以l如用液体,变色后不能用l如用纸片方法,在制作时防止纸片变为兰色 5.质量控制质量控制l1 1药物敏感试验的质量控制：应包括药物敏感试验的质量控制：应包括3030天的初始质天的初始质量稳定测试；每周一次的常规质量控制；量稳定测试；每周一次的常规质量控制；5 5天的纠控天的纠控程序。程序。l2 2鉴定试剂质量控制：购入新的试剂；在更换批号；鉴

10、定试剂质量控制：购入新的试剂；在更换批号；更换生产厂家；结果发生异常等情况时均应进行质量更换生产厂家；结果发生异常等情况时均应进行质量控制。控制。l3 3染色液质量控制：每天临床标本染色前应包括染染色液质量控制：每天临床标本染色前应包括染色结果阳性和阴性的对照物及染色液污染的质量检查。色结果阳性和阴性的对照物及染色液污染的质量检查。质量控制内容质量控制内容l4分离培养基：如血琼脂和巧克力，用肺炎链球菌、B-溶血和草绿色溶血的链球菌、流感嗜血杆菌、等苛养细菌的标准菌株或经标准化试剂已证实结果正确的菌株进行测试，判断其分离能力。l5.培养箱温度的质量控制：每天第一个开箱和最后离开实验室均应对培养箱

11、的温度作记录；CO2培养箱还应记录CO2的含量。 质量控制内容质量控制内容l6冰箱温度记录：按每一冰箱存放的物品不同设置不同的质控范围，特别对低温冰箱；每天记录一次。l7自动化设备：按厂家提供的SOP文件进行质控；在设备软件升级或修改版本时均应进行质量控制程序。l8.每一有权向临床发报告的实验室都应参加全国或省或市级质量控制活动.1.涂片是最简单的导向性病原学检测 方法曲霉菌有顶囊曲霉菌有顶囊Mucor species - Microscopic Morphology, 400 x Lactophenol cotton blue 大型孢子囊大型孢子囊,无囊托无囊托,无匍无匍 菌丝及假根菌丝及假

12、根 新型隐球菌的厚夹膜 卡氏肺孢子菌卡氏肺孢子菌2.降钙素原（PCT）的临床价值l早期诊断：早期诊断：l在感染发生在感染发生2-3h血浆血浆PCT浓度就会升高浓度就会升高.lPCT含量升高含量升高,随着感染的恢复随着感染的恢复PCT也随也随着下降着下降.l预后判断预后判断:不同血流感染阶段死亡率不同细菌性脑膜炎和病毒性脑膜炎降钙素元的含量不同败血症和严重败血症PCT含量如果如果PCT不能转阴性病人预后不好不能转阴性病人预后不好,相相反病人会有好的预后反病人会有好的预后l酵母菌、丝状真菌细胞壁成分酵母菌、丝状真菌细胞壁成分l不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠

13、菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属毛孢子菌、支顶孢属l不能检测：隐球菌和接合菌不能检测：隐球菌和接合菌l美国美国FDA已批准，欧洲部分国家已注册已批准，欧洲部分国家已注册l敏感性、特异性：敏感性、特异性：90左右左右3.G试验:1,3-D葡聚糖l美国大多数研究限于念珠菌菌血症美国大多数研究限于念珠菌菌血症l其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料少其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料少l假阳性：血液透析；接受血制品治疗（免疫球蛋假阳性：血液透析；接受血制品治疗（免疫球蛋白）白）l抗生素对结果的影响？抗生素对结果的影响？ G试验 的价值GM-半乳甘露聚糖 l曲霉菌细胞壁上一种多聚糖抗原l可以从血

14、清、脑脊业、胸水、BALF检测到l方法：lELISA（BioRad）：敏感性高 1ng/mllLatex agglutination： 15ng/ml三种方法检测真菌GM GPCR曲霉菌属A. fumigatus镰刀霉Fusarium接合菌纲Zygomycetes念珠菌属Cadida隐球菌Cryptococcus青霉菌Penicillium拟青霉菌Paecilomyces如何将实验数据转化为实际效果?l和临床医师交流与解释检验结果和临床医师交流与解释检验结果, 是将实验数据转化为实际效果的是将实验数据转化为实际效果的最好途径。最好途径。l实验结果不能凑效的原因是信息没有及时传到医师那里，检验医

15、师没有对结果进行中肯的分析与解释，个别临床医师不接受建议等。l近代医学和微生物学发展都很迅速，年轻的医生可能不知道如何年轻的医生可能不知道如何解释结果解释结果，年长的医师可能不知道哪些快速试验可以应用。年长的医师可能不知道哪些快速试验可以应用。l这就要临床微生物检验医师进行宣传、交流和培训。检验医师还要根据临床送检标本结果主动去临床科室进行巡视、会诊、参加感染问题讨论例会等。只有实验室和感染症医师之间有了一个密切的工作关系，快速报告才能显出最佳效果。继续教育的内容l医院感染的流行病学l定期向各科室通报细菌耐药监测资料l学术交流医院感染的流行病现状l医院感染病原检验，是当前临床微生物检验的一项重

16、要工作内容。微生物工作人员对医院感染及其流行病学应有足够认识。l本单位医院感染类型感染类型,发病率发病率,主要病原菌及其主要病原菌及其耐药性耐药性.l 医院感染的流行病现状l下呼吸道感染 主要为肺炎，发病率0.5%5%，国内约为1%2%，占全部医院感染的26%42%，是我国最常见的医院感染类型。病死率23.8%50% l尿路感染 在欧美等国家报告其发病率为2%5%，近年来有下降趋势，而国内统计资料显示约为0.6%1.07%，占全部医院感染的20.8%31.7%，列我国第二、三位常见医院感染类型。主要病原菌仍为大肠杆菌，但所占比例较院外感染为低。肠球菌为最常见的革兰阳性球菌，念珠菌的比例也较高。留置导尿是最常见的危险因素。l手术切口感染 包括表浅、深部手术切口感染和腔隙感染。占全部医院感染的10%30%，为第二、三位常见医院感染类型。l l 血流感染 发病率0.3%2.8%，国内约为0.110.95%，很可能由于临床较少做血培养导致漏诊所致。病