SRTP2014216研究报告

1、项目编号SRTP2014216 大学生研究训练计划研究报告 项目负责人姓名 指导老师姓名 项目名称黄河三角洲几种芳香植物精油的提取及其抑菌活性研究 项目类别 理科项目 结项时间 所属系院 项目组承诺我们承诺对研究报告内容的真实性负责，保证没有知识产权争议。我们承诺遵守滨州学院科研管理的相关规定，遵守科学研究的学术规范和学术道德，所呈交的科研成果，是项目组成员在指导老师的指导下，独立进行研究所取得的成果。滨州学院有权使用本报告所有数据和资料。我们完全意识到本承诺的法律责任由项目组成员共同承担。项目负责人签名： 日 期： 项目组其它成员签名： 指导教师监督审核意见： 签名： 目 录摘要Abstra

2、ct第一章引言第二章 材料与方法2.1 实验材料与仪器2.1.1 样品采集与制备2.2实验方法2.2.1 培养基2.2.2水蒸气蒸馏法2.2.3菌悬液的制备2.2.4辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的抑菌效力测定2.2.5辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低抑菌浓度（MIC）测定2.2.6辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低杀菌浓度(MBC)测定第三章 结果与讨论3.1辛夷精油对各种测试菌抑菌效力3.2辛夷精油的最低抑菌浓度（MIC）3.3辛夷精油的最低杀菌浓度（MBC）3.4艾蒿精油对各种测试菌抑菌效力3.5艾蒿精油的最低抑菌浓度（MIC）3.6艾蒿精油的最低杀菌浓度（MBC）3.7黄花蒿精油对各种测试菌抑菌效力3.

3、8黄花蒿精油的最低抑菌浓度（MIC）3.9黄花蒿精油的最低杀菌浓度（MBC）3.10辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低抑菌浓度比较3.11辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低杀菌浓度比较第四章 结论4.1 结论参考文献黄河三角洲几种芳香植物精油的提取及其抑菌活性研究摘要本实验利用水蒸气蒸馏法提取辛夷、艾蒿、黄花蒿精油，选取大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）两种细菌为供试菌株，采用菌丝生长发测定了三种芳香植物精油对两种细菌的抑菌活性。测试结果表明：辛夷、艾蒿、黄花蒿精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌活性。其中，辛夷精油对大肠杆菌的最低

4、抑菌浓度为0.1%-0.2%，对大肠杆菌的最低杀菌浓度为0.2%-0.4%，而对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.05%-0.1%，对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为0.1%-0.2%；艾蒿精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.4%-0.8%，对大肠杆菌的最低杀菌浓度为0.8%-1.6%，而对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.1%-0.2%，对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为0.2%-0.4%；黄花蒿精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.4%-0.8%，对大肠杆菌的最低杀菌浓度为0.8%-1.6%，而对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.4%-0.8%，对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为0.8%-1.6%.关

5、键词：辛夷；艾蒿；黄花蒿；精油；抑菌效力；最低抑菌浓度；最低杀菌浓度Yellow River Delta several antimicrobial activity of essential oilAbstractIn this study, the use of steam distillation Magnolia, mugwort, Artemisia annua essential oils, selected E. coli (Escherichia coli), Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) for the two b

6、acteria strains tested , measured using the mycelium growth and development of three essential oil antibacterial activity against two bacteria . Test results showed that: magnolia , mugwort , Artemisia annua essential oils against E. coli and Staphylococcus aureus have antibacterial activity. Among

7、them, the minimum inhibitory concentration of essential oils Magnolia E. coli was 0.1% -0.2 % , the minimum bactericidal concentration of E. coli was 0.2% -0.4 % , while the minimum inhibitory concentration of Staphylococcus aureus was 0.05 % -0.1 % , the minimum bactericidal concentration of S. aur

8、eus was 0.1% -0.2 % ; mugwort minimum inhibitory concentrations of essential oils 0.4% -0.8 E.coli % , minimum bactericidal concentration of E. coli was 0.8% -1.6 %, and the minimum inhibitory concentration of Staphylococcus aureus was 0.1% -0.2 % , the minimum bactericidal concentration of Staphylo

9、coccus aureus was 0.2% -0.4 % ; essential oil of Artemisia annua minimum inhibitory concentration of E. coli was 0.4% -0.8 % , the minimum bactericidal concentration is 0.8% of E. coli 1.6% , while the minimum inhibitory concentrations of S. aureus was 0.4 % to 0.8 % , the minimum bactericidal conce

10、ntration of S. aureus was 0.8% -1.6 % .Keywords : Magnolia ; wormwood ; oils ; antibacterial effect ; minimum inhibitory concentration ; minimum bactericidal concentration annuaIII第一章引言植物精油是植物体内的次生代谢物质，由分子量相对较小的简单化合物组成，具有一定芳香气味，在常温下能挥发的油状液体物质。植物精油所含化学成分比较复杂，按其化学结构的不同可分为脂肪族、芳香族和萜类三大类化合物以及它们的含氧衍生物如醇、醛

11、、酮、酸、醚、酯、内酯等，此外还有含氮和含硫的化合物，这些化合物均有沸点低且易挥发的特点1。植物精油含量较为丰富的植物有柏科、木兰科、樟科、伞形花科、唇形花科、菊科、芸香科、姜科、桃金娘科、龙脑香科和禾本科等。植物精油的制备是以自然界中植物的花朵、叶、枝、根、皮、树胶、全草和果实等为原料，经水蒸气蒸馏法、压榨法、吸收法、溶剂萃取法和超临界二氧化碳萃取法等方法制取2。早期科学家对植物精油化学成分的研究仅限于几个含量较高的成分，随着毛细管气相色谱技术的应用和提高，对精油的研究愈来愈深入。一种精油可鉴定出几十个，甚至上百个化学成分，一些含量甚微的成分也被鉴定出来。这对于精油的深度开发及天然香料资源的

12、寻找、芳香植物优良品种的选育均具有十分重要的意义3。通常，植物精油是用来制备香精、香水的，但随着人们生活质量的飞速提高和环境意识的不断加强，植物精油的应用也逐渐扩大。植物精油在食品添加剂、害虫防治、杀菌抗菌和防腐等方面的功能，也日益受到人们的关注与重视4。目前，植物精油的抑菌活性研究主要在医用和农用两个方面。医用方面如：植物精油有广谱抗菌作用,如连翘精油对动物病原细菌(白葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌)和酵母菌、黑曲霉有很好的抑制活性;丹参金露梅精油对多种植物病原真菌有很好的抑制活性5;来自土耳其的薄荷精油对引起玉米穗腐病的串珠镰孢菌有很强的抑制活性6。农用方面如：其对农业害虫、植物病原菌表

13、现出的生物活性引起了科研工作者的注意。至今，已有菊科、唇形科、樟科、伞形科、桃金娘科、百合科、芸香科、马兜铃科、麻黄科、败酱科十个科二十余种植物精油的农用杀菌活性得到了研究7。精油广泛应用于日化产品中,将其添加到各类护肤品、美容美发香波、皂类、牙膏等,或者调配成香水,可以起到增香、愉悦心情、促进血液循环等作用,具有很好的美容功效8。此外,人们还研究开发了其他精油类产品,如精油类农药和精油类食品防腐剂等9-11。随着人们生活水平的提高和对美的不断追求,口腔卫生已成为现代人关注的焦点之一,因而漱口水在日常生活中扮演了重要的角色。漱口水作为一种口腔保健用品,具有去除口腔异味、保持口腔清洁、带来清爽感

14、觉以及预防或辅助治疗口腔常见疾病的作用12。中草药中的有效成分对龋齿、牙周炎、口腔溃疡、牙肿痛等口腔疾病具有显著的防治效果,因此在开发口腔清洁用品时更加重视对天然功效成分的应用13。植物精油来自于天然,具有很好的环境兼容性，这使得其成为开发无公害农药的一个重要资源，但需要将其开发成为农药还有大量的工作需要做。第一，扩展具有农用抑菌活性的植物精油资源，目前仅有二十余种植物精油进行了农用抑菌活性方面的研究,更多的植物精油(如天竺葵、牛至、黑胡椒、艾叶等植物的精油)在医疗方面得到了研究,这些植物精油都具有潜在的农用抑菌活性。对此类植物精油进行农用抑菌活性研究将极大地扩展植物精油资源在农业上的应用，使

15、植物精油资源得到充分利用14。第二，植物精油中抑菌活性成分有待于进一步研究。植物精油中的化学成分复杂多样，而真正具有抑菌作用化合物可能仅为其中一种或几种，各化合物间也可能存在复杂的拮抗或者增效作用，这就需要对精油中的活性化合物进行分离并鉴定其结构，为新农药的开发提供必要的资源。采用活性跟踪结合仪器分析(如GC/MS、GC/IR等仪器)的方法将大大提高获取活性化合物的速度8,15。第三，植物精油作为农用杀菌剂在产业化研究和应用方面具有广阔前景。植物精油无论是以单种植物精油还是以多种植物精油混合物作为制剂，它们都具有良好的抑菌活性。另外，许多植物精油具有多重生物活性，即具有杀虫活性，也具有抑菌活性

16、。植物精油的这些特点为其开发利用提供了有利条件15。本文研究3种植物精油的抑菌活性, 以黄河三角洲常见的3种芳香植物为原料，利用水蒸汽蒸馏法提取植物精油，采用菌丝生长法测定芳香植物精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性，确定含高效抑菌活性物质的植物精油，为黄河三角洲野生植物资源综合利用提供参考。第二章 材料与方法2.1 实验材料与仪器2.1.1 样品采集与制备采样地点为滨州市滨城区郊区，采集的样品有辛夷、艾蒿、黄花蒿，在实验室中将样品进行清洗，去除土壤烘干捣碎备用。实验使用菌种是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，为本实验室所存。2.1.2 实验仪器及试剂双人单面净化工作台、低温生化培养箱、恒温振荡培

17、养箱、紫外可见分光光度计、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、组织捣碎机、PH计、移液枪、接种针、涂布棒、打孔器、烧杯、锥形瓶、试剂瓶、广口瓶、玻璃棒、胶头滴管、量筒、试管、试管架、镊子、培养皿、酒精灯、钥匙、电炉子、牙签、脱脂棉、纱布牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、丙酮、75%乙醇、95%乙醇、蒸馏水2.2实验方法2.2.1 培养基表1 牛肉膏蛋白胨固体培养基配方（PH=7.2±0.2，NaOH调节）成分牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂含量3g/l10g/l5 g/l20 g/l表2牛肉膏蛋白胨液体培养基配方（PH=7.2±0.2，NaOH调节）成分牛肉膏蛋白胨NaCl含量3g/l10g/

18、l5 g/l2.2.2水蒸气蒸馏法称取实验材料50g（干样）于圆底烧瓶A内，再加入500ml水，振摇混合后，连接挥发油测定器B与回流冷凝管C。自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。置电热套中缓缓加热至沸，调电压至100v，保持微沸2h，至测定器中油量不再增加，停止加热，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将水缓缓放出，再静置一段时间再开启活塞使油收到瓶中，放入4冰箱中保存。装置如图1所示：图1挥发油蒸馏装置将样品辛夷、艾蒿、黄花蒿蒸馏后得到的精油接入培养瓶中，放置4冰箱中保存备用。2.2.3菌悬液的制备大肠杆菌菌悬液的制备: 取长有大肠杆菌的斜面试管，用接种针挑取大肠杆

19、菌,在固体培养基平板上进行四区划线，然后用封口膜封好放入37生化培养箱内培养24h。取出平板，用接种针挑取单菌落放入装有100ml液体培养基的锥形瓶中，放入37恒温振荡水浴锅内培养约9h，测定其OD 值达 0.8时即可使用。金黄色葡萄球菌菌悬液的制备: 取长有金黄色葡萄球菌的平板，用接种针挑取金黄色葡萄球菌，在固体培养基平板上进行四区划线，然后用封口膜封好放入37生化培养箱内培养24h。取出平板，用接种针挑取单菌落放入装有100ml液体培养基的锥形瓶中，放入37恒温振荡水浴锅内培养约8h，测定其OD 值达 0.8时即可使用。2.2.4辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的抑菌效力测定采用琼脂扩散法测定抑菌圈

20、直径：用打孔器将干净的吸水性强的优质滤纸制成直径为 6mm 的小圆纸片，干热灭菌后备用。在无菌条件下，在灭菌的培养皿内注入供试菌悬液各 100ul 到相应菌种的培养平板上，涂抹均匀。将含有精油的滤纸片平展放入在营养皿中。精油在琼脂平板上不断向纸片周围扩散，形成递减的浓度梯度，使其周围的测试菌生长受到抑制而形成透明的抑菌圈，有抑菌圈者为阳性，无则为阴性。根据抑菌圈的大小可判断样品抑菌作用的强弱，同时以加无菌水及丙酮的滤纸片进行空白对照测试，以排除所用试剂的干扰。在 37培养箱恒温培养 24h 后，测定大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径，重复试验 3次。数据统计与处理：用游标卡尺分别测量每一个抑菌

21、圈两个垂直方向的直径大小，记录各个重复的平均值。2.2.5辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低抑菌浓度（MIC）测定采用试管液体培养基稀释法测定精油的最低抑菌浓度(MlC，the minimum inhibitory concentration)。具体步骤如下： 摆好试管进行编号1-9,1-6为测试管，7号试管为培养基对照管，8号试管为加丙酮的对照管，9号试管为加菌悬液的对照管。 由于精油与水是不相混溶的，所以试验中选用丙酮作为介质，其与精油的体积比为1:1。取精油0.5ml和丙酮0.5ml混匀备用。 取精油与丙酮的混合液160ul加入1号试管，再加入4.84ml液体培养基，混匀。 向2-7、9号试管

22、中分别加入2.5ml液体培养基。 取1号试管的混合液体2.5ml加入2号试管混匀；取2号试管的混合液体2.5ml加入3号试管混匀；照此顺序，用二倍稀释法依次稀释剩余试管，使其精油浓度梯度设置为0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%。 向8号管加80ul丙酮、80ul无菌水和4.84ml液体培养基，混匀。 向1-6、8-9号试管分别加50ul菌悬液，震荡后放入37生化培养箱内培养24h后看试管的浑浊度，重复实验三次。澄清的试管说明没有长菌，浑浊的试管有菌生长。 2.2.6辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低杀菌浓度(MBC)测定最低杀菌浓度(MBC Minimal bacteric

23、idal concentration)就是指精油能杀死微生物的最低浓度，最小杀菌浓度的测定可以和 MIC 同步进行。将比较澄清的试管进行涂平板，然后放在37下培养一天，以完全没有菌落生长的最低精油浓度为其最低杀菌浓度的测定。第三章 结果与讨论3.1辛夷精油对各种测试菌抑菌效力采用琼脂扩散法，辛夷精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性测定。抑菌效果见图2.1，有精油的滤纸片周围产生的抑菌圈直径大小不等，丙酮对照和无菌水对照菌落生长较密，没有抑菌圈。图2.1辛夷精油对不同菌种的抑菌效果BAAC (A) 辛夷精油对大肠杆菌抑菌圈 (B) 无菌水对照 (C) 丙酮对照FED (D) 辛夷精油对金

24、黄色葡萄球菌抑菌圈（E）无菌水对照（F）丙酮对照3.2辛夷精油的最低抑菌浓度（MIC）表 2.2 辛夷精油的最低抑菌浓度(MIC)的测定效果菌种精油浓度（%）无菌水丙酮0.050.100.200.400.801.603.206.40大肠杆菌+-金黄色葡萄球菌+- 注：+，阳性；-，阴性。从表2.2中可看出：辛夷精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.10%0.20%，辛夷精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.05%0.10%。3.3辛夷精油的最低杀菌浓度（MBC）表2.3 辛夷精油对不同菌种的最低杀菌浓度(MBC)菌种精油浓度（%）无菌水丙酮0.050.100.200.400.801.603.20

25、6.40大肠杆菌+-金黄色葡萄球菌+- 注：+，阳性；-，阴性。从表2.3中可看出：辛夷精油对大肠杆菌的最低杀菌浓度为0.20%0.40%，辛夷精油对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为0.10%0.20%。3.4艾蒿精油对各种测试菌抑菌效力采用琼脂扩散法，艾蒿精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性测定。抑菌效果见图2.4，有精油的滤纸片周围产生的抑菌圈直径大小不等，丙酮对照和无菌水对照菌落生长较密，没有抑菌圈。图2.4艾蒿精油对不同菌种的抑菌效果CAB(A) 艾蒿精油对大肠杆菌抑菌圈 (B) 无菌水对照 (C) 丙酮对照DEF(D) 艾蒿精油对金黄色葡萄球菌抑菌圈（E）无菌水对照（F）丙酮对

26、照3.5艾蒿精油的最低抑菌浓度（MIC）表 2.5 艾蒿精油的最低抑菌浓度(MIC)的测定效果菌种精油浓度（%）无菌水丙酮0.050.100.200.400.801.603.206.40大肠杆菌+-金黄色葡萄球菌+- 注：+，阳性；-，阴性。从表2.5中可看出：艾蒿精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.40%0.80%，艾蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.10%0.20%。3.6艾蒿精油的最低杀菌浓度（MBC）表 2.6 艾蒿精油对不同菌种的最低杀菌浓度(MBC)菌种精油浓度（%）无菌水丙酮0.050.100.200.400.801.603.206.40大肠杆菌+-金黄色葡萄球菌+- 注：

27、+，阳性；-，阴性。 从表2.6中可看出：艾蒿精油对大肠杆菌的最低杀菌浓度为0.80%1.60%，艾蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为0.20%0.40%。3.7黄花蒿精油对各种测试菌抑菌效力采用琼脂扩散法，黄花蒿精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性测定。抑菌效果见图2.7，有精油的滤纸片周围产生的抑菌圈直径大小不等，丙酮对照和无菌水对照菌落生长较密，没有抑菌圈。图2.7黄花蒿精油对不同菌种的抑菌效果ABC(A) 黄花蒿精油对大肠杆菌抑菌圈 (B) 无菌水对照 (C) 丙酮对照DEF(D) 黄花蒿精油对金黄色葡萄球菌抑菌圈（E）无菌水对照（F）丙酮对照3.8黄花蒿精油的最低抑菌浓度

28、（MIC）表 2.8 黄花蒿精油的最低抑菌浓度(MIC)的测定效果菌种精油浓度（%）无菌水丙酮0.050.100.200.400.801.603.206.40大肠杆菌+-金黄色葡萄球菌+- 注：+，阳性；-，阴性。从表2.8中可看出：黄花蒿精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.40%0.80%，黄花蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.40%0.80%。3.9黄花蒿精油的最低杀菌浓度（MBC）表 2.9 黄花蒿精油对不同菌种的最低杀菌浓度(MBC)菌种精油浓度（%）无菌水丙酮0.050.100.200.400.801.603.206.40大肠杆菌+-金黄色葡萄球菌+- 注：+，阳性；-，阴性。

29、 从表2.9中可看出：黄花蒿精油对大肠杆菌的最低杀菌浓度为0.80%1.60%，黄花蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为0.80%1.60%。3.10辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低抑菌浓度比较表3.10辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低抑菌浓度比较 植物菌种辛夷艾蒿黄花蒿大肠杆菌0.10%0.20%0.40%0.80%0.40%0.80%金黄色葡萄球菌0.05%0.10%0.10%0.20%0.40%0.80%从表中可看出:这三种植物中，辛夷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都比较敏感；艾蒿对大肠杆菌不敏感，对金黄色葡萄球菌较敏感；黄花蒿对大肠杆菌较敏感，对金黄色葡萄球菌不敏感。3.11辛夷、艾蒿、黄花蒿精

30、油的最低杀菌浓度比较表3.11辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低杀菌浓度比较 植物菌种辛夷艾蒿黄花蒿大肠杆菌0.20%0.40%0.80%1.60%0.80%1.60%金黄色葡萄球菌0.10%0.20%0.20%0.40%0.80%1.60% 从表中可看到：这三种植物中，辛夷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都比较敏感；艾蒿对大肠杆菌不敏感，对金黄色葡萄球菌较敏感；黄花蒿对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都不怎么敏感。第四章 结论4.1 结论辛夷精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.1%-0.2%，辛夷精油对大肠杆菌的最低杀菌浓度为0.2%-0.4%，辛夷精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.05%-0.1%，辛夷精油对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为0.1%-0.2%；艾蒿精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.4%-0.8%，艾蒿精油对大肠杆菌的最低杀菌浓度为0.8%-1.6%，艾蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.1%-0.2%，艾蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为0.2%-0.4%；黄花蒿精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.4%-0.8%，黄花蒿精油对大肠杆菌的最低杀菌浓度为0.8%-1.6%，黄花蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.4%-0.8%，黄花蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为0.8%-1.6%。参考文献1庞建光,张明霞,韩俊杰.植物精油的研究及应用J.邯郸农业