第四章DNA的复制

1、DNA的复制 DNA Replication 讲授：陈友生物科学与技术学院生物科学与技术学院2014/3/242014/3/241 19 95 51 1年年，沃沃森森到到克克里里克克所所在在的的卡卡文文迪迪什什实实验验室室，在在威威尔尔金金斯斯等等的的X X射射线线衍衍射射分分析析资资料料的的基基础础上上，于于1 19 95 53 3年年提提出出D DN NA A双双螺螺旋旋分分子子结结构构模模型型 1 19 96 62 2年年获获诺诺贝贝尔尔生生理理学学或或医医学学奖奖 生命的遗传实际上染色体生命的遗传实际上染色体DNA自我复制的自我复制的结果，染色体结果，染色体DNA的自我复制主要通过半的

2、自我复制主要通过半保留复制来实现的，是一个以亲代保留复制来实现的，是一个以亲代DNA分分子为模板合成子代子为模板合成子代DNA链的过程。链的过程。 亲代亲代DNA必须以自身分子为模板来合成新必须以自身分子为模板来合成新的分子，准确地复制成两个拷贝，并分配的分子，准确地复制成两个拷贝，并分配到两个子代细胞中去，才能真正完成其遗到两个子代细胞中去，才能真正完成其遗传信息载体的使命。传信息载体的使命。教学重点教学重点 DNA复制的相关概念，特点。参与复制的主要物质及其作用教学难点教学难点 DNA聚合酶和结构与功能DNA复制的起始、延伸和终止（以E.coli为例）问题： 1、复制可以随机起始吗？ 2、

3、复制是单向的还是双向的？ 3、新生链合成的方向是从5to 3 还是还是3 to 5，还是两个方向均可？，还是两个方向均可？ 4、复制时两条链是完全解开吗？ 5、两条链是同时进行复制的吗？是指以亲代是指以亲代DNADNA为模板合成子代为模板合成子代DNADNA的的过程。即遗传物质的传代。过程。即遗传物质的传代。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA复制复制(replication)(replication) 一、DNA复制的一些概念 复制子复制子（replicon） 复制子是基因组中能够独立进行复制的单位。每复制子是基因组中能够独立进行复制的单位。每个复制子都有控制复制开始的复制起点（个复制子都有

4、控制复制开始的复制起点（origin）以及终止复制的终点（以及终止复制的终点（terminus）。任何起点和）。任何起点和终点之间的序列都作为复制子的一部分参与复制。终点之间的序列都作为复制子的一部分参与复制。 在一个细胞周期中，每个复制子只启动一次。在一个细胞周期中，每个复制子只启动一次。 复制起点复制起点：复制子有控制启动复制的元件，称为：复制子有控制启动复制的元件，称为复制起点复制起点(origin of replication)，常用，常用ori来表示；来表示；可以起始一个复制循环，并可控制复制起始反应可以起始一个复制循环，并可控制复制起始反应的频率。的频率。 复制终点复制终点：控制终

5、止复制的元件，称为复制终点控制终止复制的元件，称为复制终点(termini); 复制叉复制叉（replication fork）：）：DNA复制时在复制时在DNA链上通过解旋、解链和链上通过解旋、解链和SSB蛋白的结合等过蛋白的结合等过程形成的程形成的Y字型结构称为复制叉或字型结构称为复制叉或生长点生长点（growing point）。在复制叉处作为模板的双。在复制叉处作为模板的双链链DNA解旋，同时合成新的解旋，同时合成新的DNA链。链。 DNA复制首先将双螺旋复制首先将双螺旋DNA解旋，这一过程需要解旋，这一过程需要特异的拓扑异构酶或解旋酶；特异的拓扑异构酶或解旋酶；DNA的复制至少需的复

6、制至少需要要20多种酶和蛋白质结合在复制叉部位，形成复多种酶和蛋白质结合在复制叉部位，形成复杂的复制体结构。杂的复制体结构。半保留复制半保留复制在复制过程中首先两条亲本链之间的氢键断裂,双链分开，然后以每条亲本链（parental strand）为模板，按碱基互补配对原则(A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合成新的互补子链（daughter strand）。复制结束后，每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的,并且，新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同。这种复制方式称为半保留复制(semiconservation replication)。1958年M

7、eselson和Stabl用实验证明了DNA复制是半保留式的。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成的复制过程中形成的复制叉复制叉子代子代DNA 半保留复制半保留复制半不连续复制半不连续复制 由于由于DNA双螺旋的两条是反向平行的，因双螺旋的两条是反向平行的，因此在复制叉附近解开的此在复制叉附近解开的DNA链一条是链一条是5-3方向

8、，另一条是方向，另一条是3-5方向方向. DNA聚合酶活性是使聚合酶活性是使DNA链沿链沿5-3方向延方向延申，所以就决定了前导链的复制是连续的，申，所以就决定了前导链的复制是连续的，而滞后链的复制是不连续的。因此称为而滞后链的复制是不连续的。因此称为DNA的半不连续复制。的半不连续复制。1、前导链（、前导链（leading strand） 以以5 -3 方向连方向连续续合成的合成的DNA 链链2、滞后链（、滞后链（lagging strand） 总总体上体上沿沿着着3 到到5 方向方向延伸延伸，但但以以小小片段形式片段形式(5 -3 )不不连连续续合成，合成，最最后共价连接后共价连接起来起来

9、3、冈崎片段（、冈崎片段（Okazaki fragment） 在在非连非连续续复复制制中产生的中产生的短短片段，片段，随随后后被被连接连接成成完完整的链整的链 E.coli 1000-2000nt 真核生物真核生物 100-200nt解链方向解链方向 半不连续性复制半不连续性复制（复制叉）（复制叉）3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 领头链、前导链领头链、前导链( leading strand )( leading strand ) 随从链、滞后链随从链、滞后链 ( lagging strand )( lagging strand )冈崎片段冈崎片段（Okazaki fragment）二、

10、复制方向1 1、相向复制（腺病毒）、相向复制（腺病毒）2 2、单向复制（质粒、单向复制（质粒ColE1 DNAColE1 DNA3、双向复制D DNNA A复复制制的的几几种种主主要要方方式式原核生物的染色体和质粒原核生物的染色体和质粒l噬菌体噬菌体复制后期、复制后期、X174X174、T4T4等噬菌体以及爪蟾卵母细胞等噬菌体以及爪蟾卵母细胞的的rRNArRNA基因等。基因等。l线粒体；叶绿体也采取此种方线粒体；叶绿体也采取此种方式，但双链环两条链的起点不式，但双链环两条链的起点不在同一位置。在同一位置。三、复制速度三、复制速度真核生物复制叉移动速度为真核生物复制叉移动速度为13kb/min，

11、细菌细菌DNA复制叉的移动速度为复制叉的移动速度为50kb/min，相差相差2050倍；倍；真核生物染色体在全部复制完成之前起点真核生物染色体在全部复制完成之前起点不再重新开始复制，而在快速生长的原核不再重新开始复制，而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。生物中，起点可以连续发动复制。1）引物(primer)：复制需要一小段RNA作引物2）模板(template)：解开成单链的DNA母链3）底物(substrate)或称原料：dATP、dGTP、dCTP、dTTP4）能源：需ATP供能，原料dNTP本身也是高能化合物5）酶和蛋白质因子：DNA聚合酶(polymerase)等四、参与四

12、、参与DNADNA复制的物质及作用复制的物质及作用RNA引物（引物（RNA primer） 与与一一条条DNA链配对链配对的的短短序列序列(通常通常是是RNA)，（1）RNA引物可以提供引物可以提供3-OH末端作合成新末端作合成新DNA链起点；链起点；（2 2）提高了）提高了DNA复制的准确性。因为复制的准确性。因为DNA复制开始时掺入的复制开始时掺入的核苷酸往往容易出错，加在核苷酸往往容易出错，加在RNA引物中可以被切除，不会影引物中可以被切除，不会影响响DNA复制复制的准确性。的准确性。 问题：为什么需要有问题：为什么需要有RNA引物来引发引物来引发DNA复制呢复制呢?参与参与DNA复制的

13、蛋白质复制的蛋白质1. DNA解旋酶（解旋酶（DNA helicase） 作用：解开双链作用：解开双链2. 单链结合蛋白（单链结合蛋白（single strand binding protein, ssb） 作用：防止单链退火作用：防止单链退火 （在原核细胞中表现出协同效应）（在原核细胞中表现出协同效应）3. 引发酶（引发酶（primase） Dna G (E. coli ) 引发体引发体 Primosome4. DNA连接酶（连接酶（DNA ligase） 需要能量需要能量 NAD（E. coli ）/ ATP（真核）真核）5. DNA螺旋酶（螺旋酶（DNA gyrase）- 拓扑异构酶拓扑

14、异构酶 断裂双链断裂双链 引入负超螺旋引入负超螺旋 （swivel function) 需要需要ATP6. DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase, Pol） Three DNA Polymerases （E. coli）（1）Pol I DNA聚合酶聚合酶 3 5 核酸外切酶（校对）核酸外切酶（校对） 5 3 核酸外切酶（损伤修复、去除引物）核酸外切酶（损伤修复、去除引物） 缺口填充缺口填充 （大缺口（大缺口） DNA 损伤修复损伤修复 缺刻平移缺刻平移 Nick translation（去除引物）去除引物）（2）Pol II 活性很低，不是活性很低，不是DNA复制必需的，复制必

15、需的，主要起修复的作用主要起修复的作用（3）Pol III 3 5 核酸外切酶核酸外切酶 （校对）（校对） 亚基亚基 DNA聚合酶（必需）聚合酶（必需） 亚基（亚基（dna E） 缺口填充（小于缺口填充（小于100bp）（4）. Pol 和和是是19991999年发现，它们能在年发现，它们能在DNADNA损伤部位继续复制损伤部位继续复制讨论： 1、Pol I and III功能上有哪些相同点？功能上有哪些相同点？ 2、 Pol I and Pol III功能上有哪些不同？功能上有哪些不同？ 1 以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为底物催化合成为底物催化合成DNA 2 需要模板需要

16、模板( (3 5)和引物的存在和引物的存在 3 不能从头合成新的不能从头合成新的DNA链（链（必须有必须有3 -OH末端末端） 4 催化催化dNTP加到生长中的加到生长中的DNA链的链的3-OH末端末端 5 催化催化DNA合成的方向是合成的方向是5 3 6 有有 3 5 核酸外切酶活性（校对功能）核酸外切酶活性（校对功能）1 1、PolPol I and I and PolPol III III相同的功能特点：相同的功能特点： 1 5 3核酸外切酶活性不同。核酸外切酶活性不同。 2 Pol I 可进行缺刻平移、去除引物。可进行缺刻平移、去除引物。 3 二者聚合酶活性不同，二者聚合酶活性不同，P

17、ol III是是大肠杆菌大肠杆菌 DNA复制中链延长反应的主导聚合酶。复制中链延长反应的主导聚合酶。 4 Pol I 主要功能是进行主要功能是进行DNA 损伤修复。损伤修复。2、Pol I and Pol III不同的功能特点：Composition of E. coli DNA Polymerase III HoloenzymeSubunitFunctionSubassembliesDNA polymerase3- to 5- exonucleaseCoreStimulates exonucleasePol IIIDimerizes coreBinds complexBinds ATPBin

18、ds to PolIIIBinds to and complexBinds to SSB( DNA-dependent ATPase )Binds to and Sliding clampDNA聚合酶聚合酶III1、亚基亚基（1）结构：）结构：环状的二聚体环状的二聚体（2）作用：作用：“活动夹板活动夹板” 允许全酶沿着允许全酶沿着DNA滑动滑动 使全酶的持续性很高使全酶的持续性很高2、DNA聚合酶聚合酶III-形成形成不对称的二聚体不对称的二聚体 使前导链、滞后链的合成可同时进行使前导链、滞后链的合成可同时进行提高酶持续提高酶持续合成能力合成能力3-53-5外切酶外切酶校对功能校对功能核心酶二

19、核心酶二聚化聚化组建核心组建核心酶酶5-35-3合成合成DNADNA的催的催化活性化活性夹子装配夹子装配器，协同器，协同亚基嵌亚基嵌住模板住模板DNADNA滞后链模板形成了滞后链模板形成了一个回环，使环中一个回环，使环中RNA引物和冈崎片引物和冈崎片段的合成方向与前段的合成方向与前导链一致，以适应导链一致，以适应双链在同一复制体双链在同一复制体上进行复制上进行复制3 3、回环模型、回环模型“”型复制型复制 环状环状DNA的复制方式，即从复制起点开始，的复制方式，即从复制起点开始，双向同时进行，形成双向同时进行，形成样中间物样中间物环节： DNA复制的起始 DNA链的延伸 DNA复制的终止 第二

20、节第二节 细菌细菌DNA复制复制一一、细菌、细菌DNA复制起始复制起始 （一）复制起始复合体（一）复制起始复合体 DnaA（起始点结合蛋白起始点结合蛋白) DnaB（解旋酶）解旋酶） SSB DnaC（装载解旋酶和引发酶）装载解旋酶和引发酶） HU（识别并刺激识别并刺激OriC 形成开链）形成开链） Gyrase（促旋酶）促旋酶）-拓扑异构酶拓扑异构酶（二）复制起始区的结构特点（二）复制起始区的结构特点 1 1、富含、富含AT 2 2、3 3个个13bp13bp的重复序列的重复序列-解链的位点解链的位点 3 3、4 4个个9bp9bp的重复序列的重复序列- DnaA结合位点结合位点（三）复制起

21、始引发的过程：（三）复制起始引发的过程： 1、DNA复制起点双链解开复制起点双链解开 ，形成复制叉形成复制叉GATCTNTTNTTTTTTATNCANADnaA+ATPDnaBDnaCOriC（富含（富含AT）313bp重复序列重复序列49bp重复序列重复序列 DnaA结合位点结合位点HU +ATPATP过程：过程：（1）约）约20个个DnaA结合在结合在49bp重复序列重复序列（2）DnaA复制起始复合物使复制起始复合物使13bp重复序列变性，重复序列变性， 形成开链形成开链（3 ）DnaB与与单链单链DNA结合（需要结合（需要DnaC帮助），帮助）， 进一步解开进一步解开DNA双链，形成复

22、制叉双链，形成复制叉2、RNA引物的合成引物的合成 leading strand: primase（引发酶）引发酶） lagging strand: primosome 引发体（引发前体引发体（引发前体primase） 引发前体：引发前体：n蛋白、蛋白、n蛋白、蛋白、n”蛋白、蛋白、i蛋白、蛋白、 dnaB蛋白和蛋白和dnaC蛋白蛋白 3、DNA聚合酶将第一个dNTP加到引物的3-OH末端 SSBDnaGprimaseDnaBhelicasePol III （ /）引发体（引发体（primosome）Pol I、ligase复制体（复制体（replisome）in vivo 二、细菌二、细菌D

23、NA复制延伸复制延伸（二）二）DNA聚合反应的特征聚合反应的特征1、DNA的聚合反应是以的聚合反应是以dNTP为底物，以为底物，以3 5 DNA为模板，按碱基配对原则在为模板，按碱基配对原则在3-OH上加上加dNTP （DNA聚合酶对碱基的选择功能）聚合酶对碱基的选择功能）2、需二价正离子如、需二价正离子如Mg， 3-OH作亲核进攻形成磷酸作亲核进攻形成磷酸 二酯键二酯键3、链沿、链沿5 3方向延长方向延长4、碱基互补配对，若错配则切除掉、碱基互补配对，若错配则切除掉（一）一）DNA复制体复制体(replisome) DNA聚合酶聚合酶全酶分子、引发体和解旋酶构成的复合体全酶分子、引发体和解旋

24、酶构成的复合体（三）防止拓扑学问题（三）防止拓扑学问题两种机制两种机制1DNA在生物细胞中本身就是负超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和2DNA拓扑异构酶可以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态；DNA拓扑异构酶(旋转酶)可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA nick结合结合Pol I引物移动引物移动 / DNA合成合成封闭缺口封闭缺口降解的引物降解的引物DNA ligase（四）缺刻平移（四）缺刻平移( Nick translation)去除引物去除引物5533parentprogenyAATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCAterD /