TM-085微生物限度检查法

1、检验方法文件编号: TM-085版本号: 01微生物限度检查法页码: 12 /11生效日期:微生物限度检查法起草人审核人审核人批准人部门QCQAQC质量管理部姓名饶涛黄祥彪汪大才邓志军签名日期分发部门：质量管理部QC1. 目的制订微生物限度检查法的标准操作规程，便于检验中使用。2. 范围需进行微生物限度检查的物料。3. 职责QC4. 操作内容4.1 简述4.1.1 本规程规定了非灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。包括染菌量及控制菌的检查。4.1.2 引用标准4.1.2.1 中国药典2010年版二部4.1.2.2 中国药品检验标准操作规范2005年版4.2 检查一般要求4.2.

2、1 供试品应随机抽样，如遇有异常或可疑的样品，须选取有疑义的样品。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。供试品在检验前不得开启，在检查前及检查中应防止供试品污染菌受损、致死或繁殖。凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出发霉、变质的药品，可直接判为不合格，无需再抽样检查。4.2.2 检查的全部过程均应严格遵守无菌操作，严防再污染。4.2.3 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为3035，霉菌、酵母菌培养温度为2328，控制菌培养温度为3537。4.2.4 细菌、霉菌（酵母菌）计数和控制菌检查，均应作对照试验。4.2.5 检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm

3、2为单位报告。4.3 仪器4.3.1 恒温培养箱（3035）、生化培养箱（2328）、微波炉、匀浆仪（3000 8000r/min）或康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250300）、电冰箱、离心机、HTY-2000A型集菌仪、蒸汽灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。菌落计数器、显微镜（1500x）、电子天平或天（感量0.1g），PH 系列比色计。4.3.2 玻璃器皿锥形瓶，内装玻璃珠若干；、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器等）、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）、不锈钢桶（带盖）。玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。吸管口

4、上端距0.5cm 处塞入约2cm 适宜疏松的棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞或棉塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于高压蒸汽121.灭菌30min，烘干或160干热灭菌2h，备用。4.3.3 用具大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用75%乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。接种环、乙醇灯、75%乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦

5、盖实验记录纸等。4.4 培养基及其制备方法：营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）、胆盐乳糖培养基（BL）、曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）、麦康凯琼脂培养基（MacC）三糖铁琼脂培养基（TSI）4-甲基伞形酮葡萄苷酸培养基（MUG）等的制备方法应严格按照包装说明的方法配制。4.5 试液 4.5.1靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，加滴边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深；或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐

6、徐滴入。4.6 稀释剂4.6.1 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。4.7 供试品的检验量4.7.1 每批供试品检验量一般为10g或10ml。4.7.2 供试品均须取自2个以上的包装单位。4.8 供试液的制备按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过4530分钟。除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：4.8.1 液体供试品 取供试品10ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为1：10供试液。4.8.2

7、 固体供试品 称取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其它适宜方法，混匀后，作为1:10供试液。4.9 细菌、霉菌与酵母菌计数4.9.1 计数方法的验证由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。4.9.2 菌种验证用菌株：大肠埃希菌CMCC（B）44102 金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003 枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501 白色念珠菌CMCC

8、（F）98001 黑曲霉CMCC（F）980034.9.3 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养18-24h；黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基，培养5-7天。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液。4.9.4 验证方法验证试验分四组，至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。（1）试验组 取最低稀释级的供试液，按每1ml供试液加入50100cfu试验菌，按菌落计数方法测定其菌数。平皿法计数时，取试验菌液、供试液1ml分别注入平皿中

9、，立即倾注琼脂培养基；每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取供试液2ml过滤，冲洗液冲洗，并在最后一次的冲洗液中加入试验菌。（2）菌液组 取上述试验菌液，测定其加入的试验菌菌数。（3）供试品对照组 取最低稀释级的供试液1ml，按菌落计数方法测定其所含菌数。（4）释释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml 供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。验证试验可与供试品的细菌

10、，霉菌及酵母菌计数同时进行。4.9.5 试验组的菌回收率（）=×4.9.6 稀释剂对照组的菌回收率（）=×4.9.7 结果判断 在3次独立的平行试验中稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验

11、证。 验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。4.10 检查法4.10.1 平皿法 4.10.1.1 取均匀供试液，进一步稀释至1：10、1：102、1：103的稀释级。分别取各稀释级的供试液各1ml，置直径约90mm的平皿中，再注入约45的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释级应作23个平皿。细菌计数用营养琼脂培养基，霉菌计数用玫瑰红钠琼脂培养基，酵母菌计数用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基。4.10.1.2 阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养、检查，不得长菌。4.10.1.3 培养和计数 细菌培养

12、时间为48h，分别在24h及48h点计菌落数，一般以48h菌落数为准。霉菌、酵母菌培养时间为72h，分别在48h及72h点计菌落数，一般以72h菌落数为准。 营养琼脂平板一般点计细菌菌落数，玫瑰红钠琼脂平板一般点计霉菌菌落数。在特殊情况下，前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数，酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂平板仅点计酵母菌菌落数。液体制剂同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。4.10.1.4 菌数报告规则 细菌宜选取平均菌落数在30300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30100之间的稀释级作为报

13、告菌数计算的依据。（1）当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该稀释级的平菌菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；（2）当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。（3）当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数的值报告菌数。（4）如各稀

14、释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。4.10.1 结果报告4.10.1.5.1 菌落数在100以内时，按实有数据报告。4.10.1.5.2 菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。4.10.1.5.3 复试供试品细菌数、霉菌和酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应从同一批样品中随机重新取2倍包装量的供试品，依法作单项复试两次，以三次检验结果的均值报告。若3次结果的平均值不超过该品种项下的规定，判供试品符合规定；否则，判供试品不符合规定。4.10.2 薄膜过滤法4.10.2.1 采用薄膜过

15、滤法，滤膜孔径不大于0.45um,直径约为50mm,选择滤膜材质应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤 膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。4.10.2.2 取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g或1ml所含菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤

16、膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml。照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。4.10.2.3 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过10个。菌数报告规则 以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以<1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或1乘以稀释倍数的值报告菌数。4.11 控制菌检查 4.11.1 控制菌检查方法验证 验证时，依各品种项

17、下微生物限度标准中规 定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。4.11.2 菌种 对试验菌种的要求同细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44 1024.11.3 菌液制备 接种大肠埃希菌、新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18-24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10-100cfu的菌悬液。4.11.4 验证方法（1）试验组 取规定量供试液及10-100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法

18、进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。（2）阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。4.11.5 结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等

19、 方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。4.11.6 检查法 4.11.6.1 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。4.11.6.2 阳性对照试验 进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10-100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。4.11.6.3 阴性对照试验 取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。（1）大肠埃希菌（Escherichia coli） 取供试液10ml（相当于供试品1g

20、、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18-24小时，必要时可延长至48小时。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性

21、，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18-24小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。 表1 大肠埃希菌菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑、湿润

22、（2）大肠菌群（Coliform） 取含适量(不少于10ml)的胆盐乳糖发酵培养基管3支,分别加入1:10的供试液1ml(含供试品0.1g或0.1ml)、1:100的供试1ml（含供试品0.01g或0.01ml）、1:1000的供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml），另取1支胆盐乳糖发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18-24小时。胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18-24小时。若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表2所列的菌落形态

23、特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与表2所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。 表2 大肠菌群菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润麦康凯琼脂鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润4.11.6.4 确证试验 从上述分离平板上挑选4-5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24-48小时。若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。根据大肠菌群的检出管数，按表3报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。表3 可能的大肠菌