08章离子交换法zuihou

1、1v第一节第一节 基本原理基本原理v离子交换法：利用溶液中离子交换法：利用溶液中带电粒子带电粒子与离子与离子交换剂之间交换剂之间结合力结合力的差异进行物质分离的的差异进行物质分离的操作方法。操作方法。v带电粒子与离子交换剂间的作用力是带电粒子与离子交换剂间的作用力是静电静电力力。 v电荷密度、电荷种类电荷密度、电荷种类2v离子交换剂：离子交换剂：由惰性的不溶性载体、功能基团和平由惰性的不溶性载体、功能基团和平衡离子组成。衡离子组成。v阳离子交换剂：平衡离子带正电荷。阳离子交换剂：平衡离子带正电荷。v阴离子交换剂：平衡离子带负电荷。阴离子交换剂：平衡离子带负电荷。vr-x+ + y+ r-y+

2、+ x+vr-表示阳离子交换剂的功能基团和载体表示阳离子交换剂的功能基团和载体；x+ 为平衡为平衡离子离子；y+为交换离子为交换离子。 3v选择性吸附选择性吸附：调节溶液调节溶液的的ph值，值，使目的物带使目的物带有相当数量的静电荷，而主要杂质离子带相有相当数量的静电荷，而主要杂质离子带相反电荷或较弱的电荷。反电荷或较弱的电荷。v选择合适的树脂（如阳离子交换树脂），使选择合适的树脂（如阳离子交换树脂），使目的物被离子交换树脂吸附，而杂质较少被目的物被离子交换树脂吸附，而杂质较少被吸附吸附。 4v（1）调节洗调节洗脱液的脱液的ph值值。v（2）用高浓度的同性离子将目的物离子取用高浓度的同性离子将

3、目的物离子取代下来。代下来。v对阳离子交换树脂而言，目的物对阳离子交换树脂而言，目的物的的pi值愈大值愈大（愈碱），将其洗脱下来所需溶液（愈碱），将其洗脱下来所需溶液的的ph值也值也愈高愈高。 5v （1 1）x x+ +为平衡离子，为平衡离子，yhyh+ +及及z z+ +为待分离离子；为待分离离子；（2 2）yhyh+ +和和z z+ +取代取代x x+ +而被吸附；而被吸附；（3 3）加碱后）加碱后yhyh+ +失去正电荷，被洗脱；失去正电荷，被洗脱；（4 4）提高）提高x x+ +的浓度取代出的浓度取代出z z+ + 动画动画6vph大于等电点时，物质带负电荷，大于等电点时，物质带负电

4、荷，与阴离子交换剂进行交换；与阴离子交换剂进行交换；vph小于等电点时，物质带正电荷，小于等电点时，物质带正电荷，可以与阳离子交换剂进行交换。可以与阳离子交换剂进行交换。 789v离子交换树脂构成：离子交换树脂构成：v（1）惰性的不溶性高分子固定骨架，称）惰性的不溶性高分子固定骨架，称载体载体。v（2）与载体）与载体共价键共价键连接的不能移动的活性基团，连接的不能移动的活性基团，又称又称功能基团功能基团。v（3）与功能基团以）与功能基团以离子键离子键连接的可移动的活性连接的可移动的活性离子，亦称离子，亦称平衡离子平衡离子。 v如聚苯乙烯磺酸型钠树脂如聚苯乙烯磺酸型钠树脂。10v强酸型树脂：磺酸

5、型树脂，功强酸型树脂：磺酸型树脂，功能基团为磺酸根能基团为磺酸根(so3h)及甲及甲基磺酸根基磺酸根(ch2so3h)，有好有好的解离能力的解离能力。v中酸性树脂：磷酸型树脂中酸性树脂：磷酸型树脂（po3h2 ）v弱酸性树脂：羧酸型树脂和酚弱酸性树脂：羧酸型树脂和酚型树脂（型树脂（cooh , ） ，在在酸性环境中解离度受到抑制酸性环境中解离度受到抑制。11v强碱型阴离子交换树脂：强碱型阴离子交换树脂：v v弱碱型阴离子交换树脂：活性基团为伯、仲、叔胺弱碱型阴离子交换树脂：活性基团为伯、仲、叔胺基。基。在碱性环境中解离度受到抑制在碱性环境中解离度受到抑制。v中强碱性阴离子交换树脂：兼有以上两类

6、活性基团中强碱性阴离子交换树脂：兼有以上两类活性基团。 121314两性树脂：两性树脂： 蛇笼树脂蛇笼树脂(snake-cage resins) na+ci-15v强酸类强酸类 1100号；号；v弱酸类弱酸类 101200；v强碱类强碱类201300；v弱碱类弱碱类301400；v中强酸类中强酸类401500v交联度交联度：是合成载体骨架时交联剂重量的百分数，：是合成载体骨架时交联剂重量的百分数，用用“”将树脂编号与交联度分开。将树脂编号与交联度分开。v弱酸弱酸101 4其交联度为其交联度为4。v国内常用树脂命名：国内常用树脂命名：724；732；71716v724；弱酸阳离子交换树脂；弱酸阳

7、离子交换树脂v732；强酸阳离子交换树脂；强酸阳离子交换树脂v717；强碱阴离子交换树脂；强碱阴离子交换树脂17v由由苯乙烯苯乙烯与与二二乙烯苯乙烯苯经过氧经过氧苯甲酰催化聚苯甲酰催化聚合而成。合而成。v交联度交联度1819丙烯酸型阳离子交换树脂：是由丙烯酸型阳离子交换树脂：是由丙烯酸甲酯丙烯酸甲酯与与二乙烯苯二乙烯苯经过氧苯甲酰催化聚合而成。经过氧苯甲酰催化聚合而成。20v110树脂：树脂：丙烯酸甲酯与二乙烯苯聚合而成。丙烯酸甲酯与二乙烯苯聚合而成。v724树脂：树脂：它是由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲它是由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯和二乙烯苯三元共聚而得酯和二乙烯苯三元共聚而得 。21v蛇笼树

8、脂蛇笼树脂：脱盐脱盐 v螯形树脂螯形树脂：金属离子：金属离子 v吸附树脂吸附树脂 ：“脱色树脂脱色树脂” v热再生离子交换树脂：热再生离子交换树脂： 22v一、离子交换平衡一、离子交换平衡v vr代表离子交换树脂，代表离子交换树脂，z1及及z2分别为交换离子分别为交换离子a1和和平衡离子平衡离子a2的价电数。的价电数。v 23v用用m1、m2及及c1、c2分别代表树脂上和溶液中分别代表树脂上和溶液中的两种离子的浓度的两种离子的浓度。v数量关系可表示数量关系可表示:v v尼科尔斯基方程式尼科尔斯基方程式vk k1 1时时 交换离子交换离子a a1 1比平衡离子比平衡离子a a2 2对树脂有较大对

9、树脂有较大的吸引力的吸引力 24vrb+ + a+ ra+ + b+v离子交换过程离子交换过程：v1、a+从溶液扩散到树脂表面。从溶液扩散到树脂表面。v2、a+从树脂颗粒表面扩散到颗粒中从树脂颗粒表面扩散到颗粒中心。心。v3、交换离子、交换离子a+ 与平衡离子与平衡离子b+交换。交换。v4、b+从交换中心扩散到颗粒表面。从交换中心扩散到颗粒表面。v5、b+ 再扩散到溶液中。再扩散到溶液中。25v速度：速度：v 颗粒孔径颗粒孔径、v 颗粒半径颗粒半径、v 树脂交换容量、树脂交换容量、v 交换离子交换离子a+的半径与电荷的半径与电荷、v 平衡离子的性质（电荷、半径）。平衡离子的性质（电荷、半径）。

10、26v1、树脂粒度树脂粒度：树脂粒度大，交换速度慢。：树脂粒度大，交换速度慢。v2、搅拌速度、搅拌速度v3、树脂交联度树脂交联度：交联度大，交换速度低。：交联度大，交换速度低。v4、离子半径和离子价离子半径和离子价：离子每增加一个电荷，：离子每增加一个电荷，交换速度下降一个数量级。交换速度下降一个数量级。v5、温度。、温度。v6、离子浓度离子浓度：交换速度随离子浓度的上升而加：交换速度随离子浓度的上升而加快。快。27v交换离子被吸附，平衡离子被释放。交换离子被吸附，平衡离子被释放。v交换带交换带：交换离子交换离子a1由于被树脂吸附，其由于被树脂吸附，其浓度从起始浓度浓度从起始浓度co逐渐下降到

11、逐渐下降到0的树脂层。的树脂层。v交换带窄交换带窄：k k1 1 ；a a1 1浓度小；流速慢浓度小；流速慢。 28v一、离子交换对树脂的基本要求一、离子交换对树脂的基本要求v二、影响树脂性能的几个因素二、影响树脂性能的几个因素v三、主要理化常数的测定三、主要理化常数的测定29v1、有尽可能大的有尽可能大的交换容量交换容量。v2、有良好的有良好的交换选择性交换选择性。v3、化学性质稳定。化学性质稳定。v4、化学动力学性能好。化学动力学性能好。v5、物理性能好。物理性能好。30v1、离子交换树脂具有的离子交换树脂具有的功能基团性质功能基团性质和和数数目目，数目数目是其交换容量的基础。是其交换容量

12、的基础。（ph）v2、树脂的树脂的交联度交联度树脂强度、交换选择树脂强度、交换选择性、动力学性质。性、动力学性质。v3 3、树脂骨架树脂骨架和和平衡离子平衡离子。 3132v偶极离子偶极离子vrso3-na+ + h3+nrcoo - rso3- h3+ nrcoo - +na+ vrso3- h + + h3+nrcoo - rso3- h3+ nrcoo hv钠盐树脂钠盐树脂v氢型树脂氢型树脂，被取代的氢离子为羧基所固定，使被吸附，被取代的氢离子为羧基所固定，使被吸附的氨基酸不能形成偶极，与树脂之磺酸基没有排斥力。的氨基酸不能形成偶极，与树脂之磺酸基没有排斥力。v与钠型树脂相比，与钠型树脂

13、相比，氢型树脂氢型树脂有较有较大大的有效的有效交换容量交换容量。 33v1 1、含水量含水量：常用：常用干燥法和离干燥法和离心法心法测得。测得。v2 2、膨胀度膨胀度：膨胀系数：膨胀系数k k膨胀膨胀。v3湿真密度树脂充满水时湿真密度树脂充满水时的密度。的密度。v4.4.交换容量交换容量:meq/g:meq/g 树脂树脂。34v阳离子交换树脂阳离子交换树脂（氢型）的测定方法：一定量（氢型）的测定方法：一定量树脂中加入树脂中加入naoh溶液，一天或数天后测定溶液，一天或数天后测定naoh剩余量，从剩余量，从消耗的碱量消耗的碱量求交换容量。求交换容量。v阴离子交换树脂阴离子交换树脂（氯型）的测定方

14、法：一定量（氯型）的测定方法：一定量树脂装柱，用过量树脂装柱，用过量na2so4溶液进行离子交换，溶液进行离子交换，测定测定流出液中氯离子总量流出液中氯离子总量，求交换容量，求交换容量。35361 1强酸树脂强酸树脂amberliteamberlite ir-120 ir-120；2 2弱酸树脂弱酸树脂amberliteamberlite irc-84 irc-84；3 3强碱树脂强碱树脂amberliteamberlite ira-400 ira-400；4 4弱碱树脂弱碱树脂amberliteamberlite ir-45 ir-45强酸强碱树脂有水平段强酸强碱树脂有水平段转折点位置转折点

15、位置功能团种类功能团种类交换容量随交换容量随ph值变化值变化37v影响离子交换选择性的因素：影响离子交换选择性的因素：v 离子价与离子水合半径离子价与离子水合半径v 离子价与离子浓度离子价与离子浓度v 交换环境交换环境v 树脂结构树脂结构v 偶极离子排斥偶极离子排斥38v相对亲和力相对亲和力和相对浓度。和相对浓度。v电荷效应越强的离子与树脂的亲和力越电荷效应越强的离子与树脂的亲和力越大，而决定电荷效应的主要因素是大，而决定电荷效应的主要因素是价电价电数和离子半径数和离子半径。39v一价阳离子亲和力的次序是：一价阳离子亲和力的次序是：vh+li+na+k+ nh4+ ag+ v对对强碱性强碱性树

16、脂阴离子亲和力次序：树脂阴离子亲和力次序：vfoh hcoo clbriso4 2-v对对弱碱性弱碱性树脂阴离子亲和力次序：树脂阴离子亲和力次序：vfclbr=i=ac so4 2- oh。4041v h+li+na+k+ nh4+ pb+cs+ag+ti+ 。42v设离子平衡后溶液中两种离子的浓度比设离子平衡后溶液中两种离子的浓度比是定是定值值p.p.v c c1 1/c/c2 2=p=pv在稀溶液在稀溶液(c(c2 2较小较小) )中，树脂吸附高价离子的中，树脂吸附高价离子的倾向很大倾向很大。 43v例如：例如：v当当k=2 p=1 m1+m2=1 c2=0.1mol/l z2=1时时v若

17、若z1=2 则则m10.9，m20.1v若若z1=3 则则m10.97，m20.03v在较稀的溶液中，树脂几乎仅吸附高价离子在较稀的溶液中，树脂几乎仅吸附高价离子。44v1、溶液溶液的的ph：解离度解离度、交换容量、交换容量、选择性。选择性。v2、离子强度离子强度：交换容量、交换容量、选择性、选择性、交换速度交换速度v3、有机溶剂有机溶剂：能降低有机离子的解：能降低有机离子的解离程度离程度。45 （一）（一）树脂载体的交联度树脂载体的交联度：v交联度上升，交联度上升，膨胀度下降膨胀度下降，k值增大值增大，树，树脂潜在的选择能力提高脂潜在的选择能力提高。v选择性选择性的影响，膨胀度增大时，的影响

18、，膨胀度增大时，k值减小，值减小，促使树脂吸附量降低；促使树脂吸附量降低；v空隙大小空隙大小的影响，即膨胀度增大，促使树的影响，即膨胀度增大，促使树脂吸附量增加。脂吸附量增加。v膨胀系数值很小时，空间效应占主要地位。膨胀系数值很小时，空间效应占主要地位。v膨胀系数增大到一定值时，选择性占主要膨胀系数增大到一定值时，选择性占主要地位。地位。图8.14 磺酸基树脂吸附土霉素的量与树脂膨胀度之间的关系46甲基丙烯酸甲基丙烯酸丙烯酰胺树脂，链霉素与钠离子交换等温线与树脂膨胀度丙烯酰胺树脂，链霉素与钠离子交换等温线与树脂膨胀度的关系的关系 1 1膨胀系数膨胀系数1.91.9； 2 2膨胀系数膨胀系数3

19、3； 3 3膨胀系数膨胀系数4.54.5； 4 4膨胀系数膨胀系数5.25.2； m m1 1树脂对链霉素吸附量树脂对链霉素吸附量； c c1 1，c c2 2溶液中链霉素和钠离子浓度溶液中链霉素和钠离子浓度47v（二）（二）辅助力辅助力：离子交换树脂与被吸附离子间的：离子交换树脂与被吸附离子间的作用力除静电力外，还存在一种辅助力。作用力除静电力外，还存在一种辅助力。v无机离子交换常数无机离子交换常数k值多在值多在110之间。之间。v有机离子交换有机离子交换时，时，k值可高达值可高达102103。v（三）（三）其它结合力：某些树脂对金属离子有特殊其它结合力：某些树脂对金属离子有特殊的亲和力。的

20、亲和力。 v羧酸型树脂羧酸型树脂 48v偶极离子偶极离子vrso3-na+ + h3+nrcoo - rso3- h3+ nrcoo - +na+ vrso3- h + + h3+nrcoo - rso3- h3+ nrcoo hv钠盐树脂钠盐树脂v氢型树脂氢型树脂v与钠型树脂相比，与钠型树脂相比，氢型树脂氢型树脂有较有较大大的有效的有效交换容量交换容量。 4950v一、一、 树脂的选择树脂的选择v目的物是弱酸性或弱碱性的目的物是弱酸性或弱碱性的小分子小分子物质时，宜选用强酸强碱树脂物质时，宜选用强酸强碱树脂（氨（氨基酸的分离）基酸的分离）。v蛋白质、酶蛋白质、酶和和其它生物大分子其它生物大分

21、子的分的分离多采用离多采用弱碱或弱酸性树脂弱碱或弱酸性树脂，减少，减少生物大分子的变性，利于洗脱，提生物大分子的变性，利于洗脱，提高选择性高选择性。 511 1、 外观特征外观特征v透明或半透明；颗粒圆整，透明或半透明；颗粒圆整，粒度粒度均匀，强度。均匀，强度。v2 2、 树脂的预处理树脂的预处理v（1 1） 物理处理：去杂，过物理处理：去杂，过筛。筛。v（2 2） 化学处理化学处理：用：用8 81010倍倍的的1mol/l 1mol/l 盐酸或氢氧化钠溶液盐酸或氢氧化钠溶液交替浸泡交替浸泡。 525354 树脂再生：树脂再生：使用过的树脂重新获得使用性能的处理使用过的树脂重新获得使用性能的处

22、理过程。过程。 再生过程：再生过程：v（1） 去杂，大量水冲洗，除去物理吸附的杂质。去杂，大量水冲洗，除去物理吸附的杂质。v（2） 用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质。用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质。v (3) (3) 转型转型：55v交换：交换：静态交换静态交换 动态交换动态交换v洗脱方式：分静态洗脱及动态洗脱两种洗脱方式：分静态洗脱及动态洗脱两种，ph及离子强度改变。及离子强度改变。v洗脱液：洗脱液：酸、碱、盐酸、碱、盐。56v酸、碱洗脱液酸、碱洗脱液目的是改变目的是改变吸附物的电荷吸附物的电荷或或改改变树脂活性基团变树脂活性基团的解离状态，以消除静电结的解离状态，以消除静电结合力

23、，迫使目的物被释放出来；合力，迫使目的物被释放出来；v盐类洗脱液盐类洗脱液是通过高浓度的同种电荷的离子是通过高浓度的同种电荷的离子与目的物与目的物竞争竞争树脂上的活性基团，使吸附物树脂上的活性基团，使吸附物游离。游离。 57v动态洗脱：动态洗脱：v 1、 溶液溶液ph及离子强度不变。及离子强度不变。v 2、分阶段改变溶液、分阶段改变溶液ph及离子强度。及离子强度。v 3、连续改变溶液连续改变溶液ph及离子强度及离子强度。v梯度洗脱梯度洗脱：自动化的梯度仪自动化的梯度仪58v梯度混合器梯度混合器:v a瓶为低浓度盐溶液瓶为低浓度盐溶液v b瓶为高浓度盐溶液瓶为高浓度盐溶液vc=ca（cacb）v

24、aa/ab 浓度梯度曲线浓度梯度曲线59v分离纯化分离纯化氨基酸制备氨基酸制备v无盐水制备无盐水制备60v猪血粉水解制备猪血粉水解制备6种种氨氨基酸基酸:61v无盐水制备是利用无盐水制备是利用氢型氢型阳离子交换树脂和阳离子交换树脂和羟羟型型阴离子交换树脂的组合以阴离子交换树脂的组合以除去水中所有的除去水中所有的离子离子，其反应式如下：，其反应式如下：62v阳离子交换树脂用阳离子交换树脂用强酸性强酸性树脂，树脂，阴离子交换树脂可以用阴离子交换树脂可以用强碱或强碱或弱碱弱碱树脂。树脂。v强酸强酸弱碱弱碱 或或 强酸强酸强碱；强碱；v强酸强酸弱碱弱碱强酸强酸强碱强碱；v强酸强酸强碱强碱混合床混合床。

25、63v混合床系将阳、阴两种树脂混合而成，混合床系将阳、阴两种树脂混合而成，脱盐效果好脱盐效果好。v混合床中所发生的反应混合床中所发生的反应:64图8.20 混合床的操作(a)为水制备时的情形；(b)为制备结束，用水逆流冲洗。阳、阴树脂根据比重不同分层，阳树脂较重在阳、阴树脂根据比重不同分层，阳树脂较重在下面，阴树脂在上面；下面，阴树脂在上面；(c)为上部、下部同时通入碱、酸再生，废液自中间排出；(d)为再生结束，通入空气，将阳、阴树脂混合、准备制水 65v经过第一柱（阳树脂）时，溶液变酸，经过第一柱（阳树脂）时，溶液变酸，而经过第二柱（阴树脂）时，溶液又变而经过第二柱（阴树脂）时，溶液又变碱。

26、碱。v链霉素脱盐：链霉素脱盐：强酸强酸125和弱碱和弱碱3114树脂组成混合床，脱盐效果较好。树脂组成混合床，脱盐效果较好。66v一、大孔、均孔树脂一、大孔、均孔树脂v（一）（一）大孔型离子交换树脂大孔型离子交换树脂（macro porous ,mp）v（二）均孔型离子交换树脂（二）均孔型离子交换树脂 ( ir )v二、多糖基离子交换剂二、多糖基离子交换剂v（一）（一）离子交换纤维素离子交换纤维素v（二）（二）葡聚糖凝胶离子交换葡聚糖凝胶离子交换剂剂6768v（1）载体骨架交联度高。）载体骨架交联度高。v（2）孔径大孔径大。v（3）表面积大，表面吸附强，对大分）表面积大，表面吸附强，对大分子物

27、质的交换容量大。子物质的交换容量大。v（4）孔隙率大。）孔隙率大。6970vd113是大孔弱酸性丙烯酸系树脂是大孔弱酸性丙烯酸系树脂vd代表大孔型树脂代表大孔型树脂v第一位数字代表产品的分类第一位数字代表产品的分类：0 代表强酸性，代表强酸性，1代表代表弱酸性，弱酸性，2代表强碱性，代表强碱性，3代表弱碱性代表弱碱性v第二位数字代表不同的骨架结构第二位数字代表不同的骨架结构：0代表苯乙烯系，代表苯乙烯系，1代表丙烯酸系，代表丙烯酸系，2代表酚醛系，代表酚醛系，3代表环氧系等。代表环氧系等。v第三位数字为顺序号，用以区别交联剂等的差异。第三位数字为顺序号，用以区别交联剂等的差异。7172v主要是

28、主要是阴离子交换树脂阴离子交换树脂。v骨架的交联度比较均匀。代号骨架的交联度比较均匀。代号为为ip或或ir。v交联度均匀，孔径大小一致，交换容交联度均匀，孔径大小一致，交换容量都较高，膨胀度、机械强度好。量都较高，膨胀度、机械强度好。73v生物大分子对离子交换的要求生物大分子对离子交换的要求: : 固相载体具有固相载体具有亲水性亲水性和较大的和较大的交换空间交换空间; ;v 对其生物活性有稳定作用，并便于洗脱。对其生物活性有稳定作用，并便于洗脱。v生物来源稳定的高聚物生物来源稳定的高聚物多糖作载体。多糖作载体。v多糖基离子交换剂可以分为：多糖基离子交换剂可以分为：v 离子交换纤维素离子交换纤维

29、素v 葡聚糖离子交换葡聚糖离子交换剂剂 74v(1)(1)开放的长链骨架，开放的长链骨架，亲水性强亲水性强，表面积大，易，表面积大，易吸附大分子吸附大分子。v(2)(2)交换交换基团稀疏基团稀疏，对大分子的实际交换容量大。，对大分子的实际交换容量大。 v(3)(3)吸附力弱，吸附力弱，交换和洗脱条件缓和交换和洗脱条件缓和，不宜变性。，不宜变性。v(4)(4)分辨率分辨率高。高。75v羧甲基纤维素（羧甲基纤维素（cm-c）：）：弱酸性阳离子交换纤维素弱酸性阳离子交换纤维素，pk=3.6 。v二乙基氨基乙基纤维素二乙基氨基乙基纤维素（deae-c）：强碱型阴离）：强碱型阴离子交换纤维素子交换纤维素

30、，pk=9.1。76v 77v 78v可静态交换，也可动态交换。可静态交换，也可动态交换。v交换基团密度低、吸附力弱。交换基团密度低、吸附力弱。v盐浓度不宜高盐浓度不宜高（控制在（控制在0.0010.02 mol/l）。 7980v洗脱缓和洗脱缓和。v升高环境升高环境的的ph、降低、降低ph或是增加离子强度都能将或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。被吸附物质洗脱下来。v 81v请以请以deae-c为例说明离子交换纤维素分离为例说明离子交换纤维素分离纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些？并说出各纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些？并说出各种方法的洗脱原理。种方法的洗脱原理。 82v 83v酸碱浓度要适当

31、降低，酸碱浓度要适当降低，处理时间处理时间也从也从4h缩短缩短为为0.31h。v以交换缓冲液平衡。以交换缓冲液平衡。v注意：注意：v不耐酸，用酸处理的浓度和时间须小心控制不耐酸，用酸处理的浓度和时间须小心控制。84v是将是将活性交换基团活性交换基团连接于连接于葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶上制成的各种上制成的各种交换剂交换剂 。v命名命名: :v交换活性基团交换活性基团- -sephadex c (a)- -编号。编号。v具有具有离子交换和分子筛离子交换和分子筛的双重作用，对生物分子有的双重作用，对生物分子有很高的分辨率很高的分辨率。 85v 86v琼脂糖凝胶上引入功能基琼脂糖凝胶上引入功能基vdeae

32、 sepharose cl-6bvcm sepharose cl-6bvdeaetoyopearlvcmtoyopearl8788v能专一地水解能专一地水解l-门冬酰胺生成门冬酰胺生成l-门冬氨酸和氨。门冬氨酸和氨。v外源门冬酰胺被降解，蛋白质合成过程中氨基酸的外源门冬酰胺被降解，蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏，导致肿瘤细胞的死亡。缺乏，导致肿瘤细胞的死亡。vl-门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物。门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物。v大肠杆菌能产生大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，即种天冬酰胺酶，即l-门冬酰胺酶门冬酰胺酶和和l-门冬酰胺酶门冬酰胺酶。v重组重组l-门冬酰胺酶门冬酰胺酶pi为为4.85

33、。8990v弱酸弱酸阳离子交换阳离子交换树脂树脂 724v强酸强酸阳离子交换阳离子交换树脂树脂 732v强碱强碱阴离子交换阴离子交换树脂树脂 717vd113 大孔弱酸性丙烯酸系树脂大孔弱酸性丙烯酸系树脂vcm-cvdeae-cvcm-sephadex c vdeae-sephadex a91v色谱聚焦色谱聚焦（chromatofocusing）: 是一种高是一种高分辨的新型的蛋白质纯化技术。分辨的新型的蛋白质纯化技术。是根据蛋白是根据蛋白质的等电点，结合离子交换技术的大容量色质的等电点，结合离子交换技术的大容量色谱谱，能分离几百毫克蛋白质样品，洗脱峰被，能分离几百毫克蛋白质样品，洗脱峰被聚焦

34、效应浓缩，分辨率高。聚焦效应浓缩，分辨率高。v适用适用水溶性的两性分子水溶性的两性分子，如蛋白质、酶、多，如蛋白质、酶、多肽、核酸肽、核酸等。等。 92v（一）（一）自动形成自动形成ph梯度梯度。v（二）（二）蛋白质的色谱行为蛋白质的色谱行为v（三）（三）聚焦效应聚焦效应 93v在在聚焦层析聚焦层析中，当中，当洗脱液流进洗脱液流进多缓冲多缓冲交换剂交换剂时，由于交时，由于交换剂带有缓冲能力换剂带有缓冲能力的电荷基团的电荷基团，故，故ph梯度溶液可以梯度溶液可以自动形成自动形成。94n（1）柱内每点的柱内每点的ph值从高到低逐渐下降值从高到低逐渐下降。n（2）从层析柱顶部到）从层析柱顶部到底部就

35、形成了底部就形成了ph69的梯度。的梯度。n（3）ph梯度会逐渐梯度会逐渐向下迁移。向下迁移。n（4）底部流出液的底部流出液的ph由由9逐渐降至逐渐降至6。95v当柱中当柱中ph低于蛋白质低于蛋白质的的pi时，蛋白质带时，蛋白质带正电荷正电荷，不与阴离，不与阴离于交换剂结合于交换剂结合,随洗脱液向下移动随洗脱液向下移动 。v当蛋白质移动至环境当蛋白质移动至环境ph高于高于其其pi时，蛋白质时，蛋白质由带正电荷变由带正电荷变为带负电荷为带负电荷，并与，并与阴离子交换剂结合阴离子交换剂结合。v由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境ph 再次低于再次低于pi时，时，它又

36、带它又带正电荷正电荷，并，并从交换剂解吸下来从交换剂解吸下来而下降而下降 。v移至移至ph大于大于pi时又重新结合，直至蛋白质从柱下流出。时又重新结合，直至蛋白质从柱下流出。v v不同蛋白质具有不同的等电点，在被离子交换剂结合以前，不同蛋白质具有不同的等电点，在被离子交换剂结合以前，移动距离移动距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。的。96v当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处时，移动速度明显减慢。至等电点处时，移动速度明显减慢。v此时加上此时加上相同相同的的第二个样品第二个样品，它将，它将以洗脱液移动的速

37、度下降，直至追以洗脱液移动的速度下降，直至追到正在慢移的第一个样品（到正在慢移的第一个样品（聚焦聚焦）。）。v如果加入的第二个样品的等电点比如果加入的第二个样品的等电点比第一个样品高，它可以越过第一个第一个样品高，它可以越过第一个样品区先被洗脱出样品区先被洗脱出来。来。 97v多缓冲剂是一种两性电解质缓冲剂，是多缓冲剂是一种两性电解质缓冲剂，是分子分子量大小不同的多种组分的多羧基多氨基化合量大小不同的多种组分的多羧基多氨基化合物物。vpolybuffer96 pbe94vpolybuffer74 pbe9498vpbe94是以是以交联琼脂交联琼脂糖糖6b（sepharose 6b）为载体，并在

38、糖基上通过醚键偶合上配基制成为载体，并在糖基上通过醚键偶合上配基制成的的多缓冲交换剂，是多缓冲交换剂，是阴离子交换剂阴离子交换剂。v当当polybuffer96流进多缓冲交换流进多缓冲交换剂时，剂时，ph梯度梯度溶液可以自动形成（溶液可以自动形成（96）。99v（一）凝胶和缓冲剂的选择（一）凝胶和缓冲剂的选择 vpbe94 polybuffer96vpbe94 polybuffer74vph间隔为间隔为3个单位。个单位。vph范围应包含要分离样品各组分等电点范围应包含要分离样品各组分等电点，并使其有并使其有2/31/2柱长的吸附解吸时间柱长的吸附解吸时间。 100v（1）凝胶按）凝胶按1 1悬浮于悬浮于起始缓冲液起始缓冲液中，除气泡。中，除气泡。v（2）在柱中放）在柱中放23ml起始缓冲液，搅拌下缓缓倒起始缓冲液，搅拌下缓缓倒入。入。v（3）打开柱底部开关，待凝胶沉降后将柱顶部接）打开柱底部开关，待凝胶沉降后将柱顶部接头装好。头装好。v（4）用）用1015个柱床体积个柱床体积起始缓冲液平衡起始缓冲液平衡。101v100mg蛋白质