生物技术大全

1、一细胞培养技术过程：1、 复苏1. 把冻存管从液氮中取出来，立即投入37水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。2. 把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。3. 把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。4. 标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。5. 3天换一次培养基。二、 传代1. 培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代

2、。2. 把原有培养基吸掉。3. 加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。4. 细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。5. 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。6. 把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。7. 倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。8. 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。三、 冻存把细胞消化下来并离心（同上）。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4 30min，-20 30min，-80过夜，然后放到液氮灌中保存。冻存液的配制： 70

3、%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。要注意的就是无菌操作！二PCR技术过程：PCR技术操作程序和优化方法典型的PCR操作      (一)  试剂       (1)引物根据待扩增DNA不同，引物亦不同。       (2)耐热DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温(93100)。       (3)10x PCR缓冲液：  500mm01

4、L KCl；  100mmolL Tris一HCl(pH8.4，  20)，150mmolL MgCl2，  lmgm1明胶。       (4)5mmo1L dNTP贮备液：将dATP，dCTP，dGTPT和dTTP钠盐各100mg合并，加3m1灭菌去离子水溶解，用NaoH调pH至中性，分装每份300v1， (-) 20保存dNTP浓度最好用uv吸收法精确测定。另外。现在已有中性dNTP溶液商品供应(Sigma公司和Pharmacia公司等).      

5、; (5)标本处理试剂：不同标本所需试剂不同，根据具体情况而定.       (二)  操作程序      利用PcR扩增的操作程序基本相同，只是根据引物与靶序列的不同，选择不同的反应体系与循环参数(见本章第：节)o基本的操作是将PcR必需反应成分加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。每个实验室或每个人都有不同的操作习惯，但需遵守一定的操作规范。      我们推荐下述操作程序，因这样操作可最大程度地增加反应的成功率。 

6、    (1)向一微量离心管中依次加入：      ddH20    补至终体积(终体积50100ul)      10 x PCR缓冲液    110体积      dNTP    各200umolL      引物    各1umolL      DNA模板   

7、10*10一10*10*10*10*10拷贝      混匀后，离心15s使反应成分集于管底。(2)加石蜡油50100ul于反应液表面以防蒸发。置反应管于97c变性7min(染色体DNA)或5min(质粒DNA).       (3)冷至延伸温度时，加入15U Taq DNA聚合酶，在此温度作用1min.      (4)于变性温度下使模板DNA变性适当时间。      (5)在复性温度下使引物与模板杂交一定时间。  

8、0;   (6)在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间。      (7)重复(4)一(6)步2530次。每次即为一个PcR循环o      (8)微量琼脂德凝胶电泳检查扩增产物(见本章第7节)o      上述过程可以用PcR自动热循环仪进行，也可以设定3个恒温水浴锅手工操作.第二节  PCR条件的优化      PCR必需具备下述基本条件：模板核酸(DNA或RNA)；人工会成的寡核苷酸引物；合

9、适的缓冲体系；Mg2+；三磷酸脱氧核苷酸；耐热DNA聚合酶；温度循环参数(变性、复性和延伸的温度与时间以及循环数)o另外，还有一些其它因素，如二甲基亚砜、甘油、石蜡油、明胶或小牛血清白蛋白等也影响某些特定PCR。下面分别讨论这些因素在PCR反应中的作用及其对PCR的影响。      一、模扳核酸      PcR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增需首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环。核酸标本来源广6t可以从纯培养的细胞或微生物中提取，也可以从临床标本(血、尿、粪便、体腔积液、嗽

10、口水等)、犯罪现场标本(血班、毛发、精斑等)和病理解剖标本(新鲜的或经甲醛固定石蜡包埋组织)以及考古标本中直接提取。无论标本来源如何，待扩增核酸都需部分纯化使核酸标本中不合DNA聚合酶抑制剂。      PcR反应中模板加入量一般为10*10一l0*10*10*10*10拷贝的靶序列。1ug人基因组DNA相当于3xl0*10*10*10*10个单拷贝的靶分子；10ng酵母DNA相当1：3xl0*10*10*10*10靶分子，1ng大肠杆菌DNA相当于3xl0*10*10*10*10靶分子；1的M13噬菌斑相当于 10*l0*10*10*10*10靶分子。

11、因此，扩增不同拷贝数的靶序列时，加入的合靶序列的DNA量亦不同。如真核rRNA基因有200500拷贝，反应中仅需加入0.52ng人基因组DNA即可。      以质粒DNA或染色体DNA为模板时的扩增最适条件是不同的。前者所需的酶量少，循环数夕，温度不如染色体DNA要求严格。扩增染色体DNA时至少需2530循环，如在第15循环后补加一些Taq酶会获得更好的扩增效果。      扩增靶序列的长度根据不同目的而不同。用于检测目的的扩增片段长度一般为500bp以内，以100一300bp为最好。用Taq DNA聚合酶在合适

12、条件(较长延伸时间)下，可扩增长达10一20kb的片段。      二、引物      PCR扩增产物的大小是山特异引物限定的。因此，引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义。      (一)  引物合成的质量      合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析(HPLC)纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整的序列和脱膘吟产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量

13、产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR所用引物质量要高且需纯化。冻干引物干20至少保存3224个月，液体状于-20可保存6个月。引物不用时应存20保存。      (二)  引物的设计原则      遵循一些简单的规则有助于没计PcR引物，通过微机的帮助更有利于PCR的成功。关于引物的详细设计原则与方法详见本章第三节。      (三)  引物的用量及其计算      一般P

14、CR反应中引物的终浓度为021umolL，在此范围内，PCR产物量基本相同。但引物低于0.2umolL时，则产物量降低。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶，dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。      引物浓度的计算可按下面的方法进行：摩尔淬灭系数（Em)是lcm光程比色杯中测定1molL寡核苷酸溶液在UV 260nm下的光密度0D)值。Em可按下式计算：EMa(16000)十b12000)十c(7000)十d(9600) 

15、60;   其中，a、b、c和d分别代表寡核苷酸中A、G、C和T的个数。      例如，  纯化的20mer寡核苷酸溶于0.1ml水中，取10ul稀释至10mL，测其0D0.76。原液的0D为0.76x100=76。若此寡核苷酸碱基组成为A5，G5，C5*T5，其EM为：      EM5(16000)十5(12000)十5(7000)十5(9600)223000      因此，原液个寡核苷酸的摩尔浓度为：   

16、   762230003.4x10-4moIL=340nmolL      三、缓冲液      目前最为常用的缓冲体系为1050mmolL TrisHCl(pH8.38.8、20c)o Tris是一种双极性离子缓冲液，20时其pKa值为8.3，pKa值为-0.021。因此，20mmol/L Tris一HCl(pH8.3, 20)在实际PCR中，PH变化于6.878之间。改变反应液的缓冲能力,如将Tris浓度加大到50mmolL，pH 8.9，有时会增加产量。反应混合液中50mmolL以内的KC

17、l有利于引物的退火，50mm01L NaCl或50mmolL以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH4+代K+,其浓度为16.6mmolL。反应中加入小牛血清白蛋白(100ugml或明胶(0.01)或Tween20(0.05一0.1)有助于酶的稳定，  反应中加入5mmolL的二巯苏醇DTT)也有类似作用，尤其在扩增长片段(此时延仲时间长)比加入这些酶保护剂对PCR反应足有利的。      四、Mg2+，      Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的。因此，反应中优

18、化Mg2+浓度是非常有益的。Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外，也影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，则酶催化非特异的扩增。需指出的是，PcR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的磷酸基因均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。因此，PCR中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.22.5mmolL。最好对每种模板，每种引物均进行Mg2+浓度的优化。另外还需注意引物和模板DNA原液中如含EDTA等螯合剂也会影响游离Mg2+浓度。    

19、  优化Mg2+浓度法：首先须知模板DNA量，引物和dNTP浓度和设定的PcR循环参数。反应中的PcR缓冲液中不加Mg2+。Mg2+是从10mmolLMg2+贮存液中逐一加入反应管中。开始以05mmolL递增(0.5，1.0，1.5，2.0，2.55.0mmolL)，在确定了Mg2+大概浓度以后，再在该浓度上下，以0.2mmolL递增和递减几个浓度来精确确定Mg2+的最适浓度。      五、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP)      贮备dNTP液应用NaoH调pH至中性，其浓度用分光光度计测定。贮备液为5

20、10mmolL，分装后20保存。在PcR的重复热循环过程中共热稳定性应为：50循环后约有50仍为dNTP。反应小练种dNTP(dATP，dGTP，dTTP和dCTP)的终浓度为20-200umolL，在此范围内，PCR产物量、特异性与合成忠实性间的平衡最佳。所用的四种dNTP终浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。开始发明PcK时，以K1enow片段催化DNA的合成，其dNTP浓度要求1.5mmolL，而耐热DNA聚合酶的应用使dNTP的使用浓度明显降低，这可减少在非靶位点的错误引导和降低dNTP的错误掺入，从而改善了PCR的特异性与忠实性。最低的适宜dNTP浓度可根据特定靶序列长度和碱基组成来

21、确定。如在100ul反应液中，每种dNTP若为20umolL，理论上足以合成26ugDNA或10pmol的400bp序列。有报道应用每种州20umolL可成功地捡出10*10*10*10*10*10*10拷贝DNA分子中一个ras点突变。但如此低浓度的dNTP在常规PCR中应避免。因为保持四种dNTP的浓度均在按种dNTPKm值(10-15umolL)以上，对保持碱基掺入忠实性是很重要的。dNTP终浓度大于50mmolL时会抑制TaqDNA聚合酶活性。另外，dNTP的类似物也可掺入PCR产物(参考本章第十节）。      六、耐热DNA聚合酶 

22、     自从耐热Taq DNA聚合酶引入PCR后，  又有多种耐热DNA聚合酶(VENT和Tth等)相继用于PcR。关于各种耐热DNA聚合酶的性质详见本章第四节，但目前仍以TaqDNA聚合酶应用较多。不同来源聚合酶制备条件、测定方法和(或)单位定义有所不同，使用时需加以注意。下面讨论的酶使用情况是以PEcetus公司生产的Taq聚合酶为依据的。在其它参数最佳时，每100ul反应液中含12.5U(比活性为20Upmol)TaqDNA聚合酶为佳。然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。当优化PcR时，最好在每100ul反应体积中加入0.

23、5-5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果酶浓度太高，则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩增带；过低时，则靶序列产量很低。       PCR后可通过下述方式之一灭活Taq DNA聚合酶：(1)99100C加热10min(2)加入EDTA Na2至10mmolL整合Mg2+；(3)酚一氯仿抽提、乙醇沉淀PCR产物。     七、温度循环参数      (一)  变性温度与时间      PCR的变性一步很重要。此步若不能使靶

24、基因模板和(或)PcR产物完全变性，就会导致PCR失败。典型的变性条件是9530s，或9715s，更高的温度可能更有效，尤其是对富合G十C的靶基因。DNA在其链分离温度(strand separation temperature响酶活性。最简单的方法是在加Taq聚合酶前先使模板在97变性710min,在以后的循环中，将模板DNA在94或95变性1min，对PCR的成功亦有益处。环状质粒DNA模板最好酶切线性化，因环状DNA复性极快。在扩增短片段(100一300bp)时，可用简便、快速的两步PcR法，同时在510个循环后，将变性温度降至8790可改善PCR产量。具体降低程度则根据共体反应和使用的

25、PCR仪而定。       (二)  复性温度与时间      如果说变性温度对PCR反应的成败是关键，那么复性温度则决定着PcR的特异性。引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的复性温度应低于扩增引物在PcR条件下真实Tm值的5。根据下式计算最适复性温度(Taopt)有助于PCR的成功。      Taopt =0.3Tm1十0.7Tm2-14.9      其中，Tm1为引物的Tm值，Tm

26、2为产物的Tm值。      实际上，由于模板量呈指数增加，PCR每一个循环中的Taopt均不同。因此，采用变化的Taopt (第一循环为Taopt -8，以后每隔一循环增加1)，对扩增质粒模板中小于1kb的靶片断是有益的 (产量增加，循环数减少)，尤其对300bp以内片段的扩增更为有效。这种变化Taopt法似乎对长片断和染色体DNA的扩增影响不大。但前几个循环在低Ta值下进行，然后再于Taopt下扩增，可增加从染色体DNA中扩增靶序列的量。      对未知序列的扩增很难预知其G十c含量，因此，无法计算上式中的T

27、m2，不免暴露了上述估算法的缺陷。另一种更简便的方法是通过引物的有效长度(1n)来信算。在此，还需引入另一概念，即有效启动温度(effective priming temperature，Tp)。 Tp是最佳引物介导扩增发生时的最高温度。Tp在一定范围(20一35个核苷酸)内与Ln呈直线相关。      Lp22十1.46(1M)    (6)      其中Ln2(G十C)十(A十T)    (7)      最适复性温度为Tp +o

28、r-25。      该法估算的最适复性温度较上法高些。Tp值较引物模板的Tss倪高5-10，这是因为引物复性后，DNA聚合酶很快发生聚合反应，在引物3端加上数个碱基使引物模板更稳定，易于在较高温度下发生廷伸。      研究表明，引物的复性是受动力学因素控制的，而不是受热力学参数控制的。它取决于引物解离与延伸效率间的平衡。Tp不仅是PcR的最适复性温度，也是PcR最佳特异性温度，在等位基因特异PCR(AsPCR)时，决定Tp很重要。      Tp值基本上不受Mg2+浓度影

29、响，当Mg2+由15mmolL升至10mmolL时，Tp才升高3。      确定了复性温度后，复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。复性时间也不能太短(30s)。如用手控温度反应，从复性状态移至延伸状态的时间不能太长，耽搁过长会增加非特异复性。      (三)  延伸温度与时间      引物延伸温度一般为72(较复性温度高10左右)。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。72时，核苷酸的掺人率为35100个核

30、苷酸s，这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而，延伸时间决定于靶序列的长度与浓度。34kb的靶序列需34min延伸，延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现。PCR中前几个循环延伸时间应足够长以使靶序列延伸完全，对很低浓度底物的扩增，延伸时间要长些。          (四)  循环数          循坏数决定着扩增程度。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度。过多的循环

31、会增加非特异扩增产物的数量和复杂性(见平台效应)。当然，循环数太少，PCR产物就会极低。在初始靶序列为3x105，1.5x104，1x103和50拷贝分子时其循环数可分别为2530，30一35，3540和40一45个循环。      除循环数外，扩增效率也是决定扩增程度的重要因素。实验表明，以染色体DNA为模板时，第2530个循环过程中，扩增DNA量明显增加。扩增程度(Y)、起始DNA量(A)、扩增效率(R)和循环数(n)间的关系为：      YA(1十R)n   (8)  

32、0;   效率为100时，25个循环后，Y225A33554432A，而效率R90，n25时，Y1.9259307649A，扩增产物减少72，由此可见扩增效率对扩增程度的影      八、其它因素    一)  高温起动hot start)      由于Taq DNA聚合酶在低温下仍具有活性。因此在一般PcR反应的开始加热变性DNA后再加酶的过程中，引物可与模板发生非特异复性，这些非特异复性在达到72前就由Taq聚合酶在其3端聚合上几个碱基并稳定了这种非

33、特异复性引物。因此，可出现非特异延伸和扩增。采用高温起动法便可克服这一缺点，即使Taq聚合酶仅在反应达到较高温度（大于70)时才发挥作用。这可通过在高温(70)下加入某些必需因子(DNA聚合酶，模板DNA，Mg2+或引物等)来控制。这种方法不仅可增加PcR的特异性，还能增加其敏感性，并可减少引物二聚体的形成和引物的自我复性。这是因为在扩增前加热可促进引物的特异复性与延伸，因此增加了有效引物的长度。      (二)  PCR促进刑      1二甲基亚风(DMSO)：许多耐热DNA聚合酶厂家推荐

34、在PCR反应中加入10DMSO，这可能是DMSO有变性DNA的作用。DMSO的使用对大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段是有益的，但对Taq DNA聚合酶有抑制作用，一般反应中应尽量不用DMSO。不过，在复合PCR中可以用。      2甘油：有报道，反应中加入5一20寸油有助于PCR反应的复性过程，尤其对G十C含量高和二级结构多的靶序列以及扩增长片段(大于l 500bp)更适用。应注意的是，DMSO和甘油并非对所有PCR均有益，因此，是否加这些试剂应根据具体情况而定，也需要操作者的探索。      3氯化四甲

35、基铵（TMAC)： 在反应中加入1x10-4一1x10-5molL的TMAC可促进PcR，去除非特异扩增，而不抑制Taq聚合酶。      4T4噬菌体基因32蛋白质(gp32) ：加入0.51ul的gp32(1nmolL，Pharmacia)可使Taq聚合酶对长片段DNA的扩增改善至少10倍。      (三)  石蜡油      反应中所用石蜡油质量要高，不能含抑制Taq DNA聚合酶活性的杂质。加石蜡油目的是防止反应液蒸发后引起的冷却与反应成分的改变

36、。石蜡油的有无对反应影响较大(表22)。但现在PECetus公司又研制了一种新型PCR仪9600型基因扩增PCR系统免除了加石蜡油的步骤。       石蜡油对PcR产物的影响       石蜡油    产物(Hg)     cv           +       2013       6

37、0;          -        405       72       扩增条件：100uI, 94，1min； 37, 2min,72min, 3min      九、PCR仪      由第一台PCR仪问世以来，已有不同加热冷却机理的PcR仪相继诞生。不同仪器由于温控精度不同对PCR反应有一定影响

38、，阅此，优化PcR反应时要注意不同仪器间的差别。       十、平台效应(plateau effect)“平台效应”是描述PCR后期循环产物对数积累的趋于饱和，并伴随0.31pmol靶序列的累积。根据反应条件和热循环，下列因素可能与平台效应有关：dNTP和引物快速掺入底物中，浓度降低；随产物增加，酶与模板的比例下降；由于变性温度高(9395)和温度循环，酶活力和dNTP的稳定性逐渐下降；非特异产物或引物二聚体与反应物的竞争；产物在高浓度时变性不完全，影响引物的延伸；产物浓度高于10-8molL时，可能降低Taq聚合酶的延伸与加工能力(processiv

39、ity)或引起产物链的分支迁移和引物转换；酶与PCR产物的结合，使酶分子减少。       十一、忠实性      反应中dNTP浓度明显低于Km值(小于1umolL)或某一dNTP的浓度低于其它三种的浓度时会增加错误掺入。因此，PcR反应中应使用较高浓度的dNTP，且四种dNTP浓度一样。由于Taq DNA聚合酶缺乏35 外切酶活性，因此，不能象K1enow聚合酶那样校正错误掺入的碱基，错误掺人有利于链的终止，这是因为酶对错误终端的延伸主要依赖于Km值的差别。研究表明，酶对AT配对的延伸速率分别比GT，CT和TT

40、错误快200，1400和2500倍。这种链终止限制了缺陷分子的扩增，而有助于保持反应的忠实性。当dNTP浓度过高(大于1mmolL)时，会促进错配碱基的延伸。在每种dNTP浓度为10一50umolL时，高温复性与延伸会最大程度地保持反应的忠实性。(from:三RT-PCR过程RNA提取（-70保存）1. 组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停）2. 转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min3. 加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min4. 10000 rpm 4离心15min5. 转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室

41、温保存10min6. 12000rpm 4 离心15min7. 倒掉上清，加1ml 75%无水乙醇（4保存），振荡混合，10000rpm 4 离心5min8. 倒掉上清，室温或37放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥9. 加20ul DEPC水至EP管中10. 在60孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解测RNA浓度调零：750ul DEPC水测量：745ul DEPC水 + 5ul RNA总RNA浓度= OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml = OD260×40×150 ug/ml = OD260×

42、;6 ug/ulA1/A2应在1.8-2.0之间逆转录（cDNA：一周内-20保存，长期-70保存）以Fernentas试剂盒为例，反应体系20ul1. RNA短暂离心2. 将11ul的DEPC水和RNA（1ug）放入EP管内，置于冰上，使RNA终浓度为0.5ug/ul,再加入Oligo(dt) 1ul,轻轻混合均匀，短时间离心(RNA=1/总RNA浓度=1/ OD260×6 ；DEPC水=11-RNA)3. 将反应液置于65 5min 冰上1min,短时间离心4. 按顺序加入：5×buffer 4ul200ul核糖核苷酸酶抑制剂 1ul 10mm dNTP MIX 2ul

43、 M-Mulu逆转录酶 1ul 轻轻混合均匀，短时间离心5. 将混合物置于42，60min6. 70加热5min,中止上述反应，置于冰上注意事项1. RNA提取和逆转录时所用器具均应在1DECP水中避光浸泡过夜，再高压烘干2. DECP水配制（先加DEPC，再加水，避光过夜，然后高压）3. 75%无水乙醇配制（DEPC水：无水乙醇=1:3）4. RNA提取和逆转录时应全程佩戴一次性手套和口罩聚合酶链反应PCR(产物-20保存)15ul的反应体系，冰上操作，稍后短时间离心Template 1ul/3ulPrimer 1 1ulPrimer 2 1ul2×Master 12.5ulddH

44、2O 补至25ul (9.5ul/7.5ul)2.PCR循环: 94 5min 94 45s Tm+4 45s 72 45s 2 29-34 (从第2步开始循环30-35个循环) 72 7min 4 12hPCR结束后-20保存或置于冰上开始电泳引物稀释方法1. 引物先离心，后用DEPC水或双蒸水稀释成10倍母液2. 再取5ul母液，加45ulDEPC水或双蒸水稀释10倍成操作液凝胶电泳加样样本孔：上样缓冲液6×Loading Buffer 2ul+ PCR产物 10ul（Loading Buffer：PCR产物=1:5，可自行调整剂量）Mark孔：取0.5ul Mark,或根据电泳

45、结果自行调整图像保存及处理Live preview - exposure - freeze保存后，图像-调整-曲线 进行调整0.5×TBE溶液配制方法1.先配5×TBE溶液：Tris 27g,硼酸 13.75g,EDTA·Na·2 H2O 2.059g（或EDTA 1.86g）,先用400ml ddH2O溶解，调节PH至8.3，然后定容至500ml2.再稀释成0.5×TBE溶液：50ml 5×TBE溶液+ 450ml ddH2O 凝胶配置方法40ml 0.5×TBE +0.6g 琼脂 置于100ml烧杯中，保鲜膜或锡纸封口，

46、开小孔，中火，2min 冷却至60，加 goldview 2ul，振荡混匀倒入干净的电泳槽中，30min后拔梳，加样，开始电泳四 高效液相色谱过程高效液相色谱仪操作步骤：1) 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。2) 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。3) 打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。4) 进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。5) 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击star

47、t，冲洗时速度不要超过10 ml/min。6) 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。7) 设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同

48、的样品而不同。8) 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。9) 关机时，先关计算机，再关液相色谱。10) 填写登记本，由负责人签字。注意事项：1) 流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。2) 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。3) 所有过柱子的液体均需严格的过滤。4) 压力不能太大，最好不要超过2000 psi。 液相色谱法简介 作者： dujinx 正文 气相色谱不能由色谱图直接给出未知

49、物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。 在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论与技术，在70年代初建立了高效液相色谱分析法（以HPLC表示）。在常压下操作的液相色谱，分离一个样品往往长达几小时至几十小时，因此工作效率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速，以缩短分离时间，但是结果失败了。根据液相色谱理论，因为随着载液（流动相）流速的提高，板高则增大，所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高，人们制成了细小

50、（<10m）而高效的填充物，从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小，柱压降显着增大，为了得到合理的载液流速，使用了高压；输液泵，使流速达到110mL/min。从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器以及电子技术和计算机技术的应用，70年代以业逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱，以区别于经典液相色谱。 高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法一致。按固定相的聚集状态不同分为液固色谱法和液液色谱法。按分离原理不同分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四类。 高效液相色谱

51、所用基本概念：保留值等色谱分析有关术语，以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致；高效液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率理论也与气相色谱一致。因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相，则速率议程H=A+B/+C。式中：纵向扩散项（分子扩散项）B/对板高的影响与气相色谱不同，由于液相色谱中组分分子在流动相中的扩散系数Dm仅为气相色谱中的万分之一，因此纵向扩散项对板高的影响可以忽略不计。于是影响液相色谱的主要因素是传质项Cu。由图14可知，气相色谱（GC）的流动相流速u增大时，板高H显着增大（即柱效显着降低），而液相色谱（LC）的流速增大时，板高增大不显着（即柱

52、效降低不显着）。这说明高效液相色 谱也有很高的分离效能，此外，气相色谱的载气权数种，其性质差别也不大，对分离效果影响也不大。而液相色谱的载液种类多，性质差别也大，对分离效果影响显着。因此流动相的选择很重要，并且在选择流动相对应注意以下几点：流动相对样品有适当的溶解度，但不与样品发生化学反应，也不与固定液互溶；流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测产生干扰作用。 高效液相色谱不但具有高效、高速、高灵敏度的特点，还由于它的流动相（载液）种类比气相色谱的流动相（载气）多，因此可选用两种或多种不同比例的液体作流动相

53、，从机时可提高选择性。此外，液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。便于为红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯样品。 由于高效液相色谱法具有以上特点，它适于分离、分析沸点高、热稳定性差、分子量大（大于400）的气相色谱法不能或不易分析的许多有机物和一些无机物，而这些物质占化合物总数的7580%。因此它已广泛用于核酸、蛋白质、氨基酸、维生素、糖类、脂类、甾类化合物、激素、生物碱、稠环芳烃、高聚物、金属螯合物、金属有机化合物以及多种无机盐类的分离和分析。 但是，高效液相色谱的固定相的分离效率、检测器的检测范围以及灵敏度等方面，目前还不如气相色谱法。此外对于气体和易挥发物质的分析方面也远不如气相色谱法，因

54、此高效液相色谱法和气相色谱法配合使用可互相取长补短，相辅相成。 1分离原理 凝胶色谱，又称空间排阻色谱。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作用也不同而进行分离、分析的方法。 凝胶色谱的分离要理和其它色谱法不同，它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。色谱柱内填充具有一定大小孔穴的凝胶。当样品进入色谱柱后，不同大小的样品分子（图142中以黑点表示）随流动相沿凝胶颗粒（图142中以空心圈表示）外部间隙和凝胶孔穴旁流过，体积在的分子因不能渗透到凝胶孔穴里而得到排阻，因此较为顺利地通过凝胶柱而较早地被流动相冲洗出来。中等体积的分子产生部分渗透作用，小分子

55、可渗透到凝胶孔穴里去而受阻滞，因有一个平衡过程而较晚地被流动相冲洗出来。这样，试样组分基本上按分子大小受到不同阻滞而先后流出色谱柱，从而实现分离目的。 光凝胶色谱采用水溶液作流动相进，称为过滤凝胶色谱（HFC），而用有机溶剂为流动相时，称为凝胶渗透色谱（GPC）。 2固定相 凝胶色谱的固定相凝胶，是含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，是一种经过交联而具有立柱网状结构的多聚体。 根据凝胶的交联程度和含水量的不同，分了软质、半硬质和硬质三种。软质凝胶（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等）交联度低，膨胀度大，容量大，可压宿，不能用于高压（使用压力低于3.5kg/2或更低），主要用于含水体系的常压

56、凝胶色谱，半硬质凝胶（如苯乙烯一二乙烯基苯交联共聚凝胶），容量中等，渗透性较高，压力可用到70kg/2。适用于非水溶剂流动相；硬质凝胶（如多孔硅胶、多也玻球等），膨胀度小，不可压缩，渗透性好，可耐高压，适于高流速下操作。 3流动相 在凝胶色谱中，为提高分率效率，多采用低粘度、与样品折光指数相差大的流动相。常用的流动相有苯、甲苯、邻二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。 岛津液相色谱仪注意事项 作者： 孔桂昌 正文 1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。3

57、.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆 外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。8.堵塞导致压力太大，按预柱混合器中的过滤器管路过滤器单向阀检查 并清洗。清洗方法；以异丙醇作溶剂冲洗：放在异丙醇中间用超声波清 洗

58、；用10稀硝酸清洗。9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相 的清洗。11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的 流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。以上是我参考了相关资料，并结合在安装使用液相色谱仪中的经验得出的，可能存在某些片面性，如有不当之处请多提宝贵建议。 岛津LC_10ATvp液相色谱仪的故障现象及处理措施现 象主要原因措 施输液不稳定泵的脉流大1。泵头内进入气泡。按p

59、ump ，驱出气泡。排液管连接口连接注射器抽出气泡。2。泵头内存有以前的流动相。按 pump ，将旧流动相完全清洗出去3吸滤器的管内进入气泡。按 pump ，将旧流动相完全清洗出去。震动吸滤器，驱出气泡。吸滤器网眼堵塞时，用超声滤清洗。超声滤清洗无效时，需更换。(检查吸滤器网眼堵塞的方法 取出过滤部分，记录压力波形。 如果取出后压力波形不正常，则吸滤器网眼堵塞。 )对流动相脱气。4。单向阀工作不正常输送异丙醇，清洗单向阀。清洗无效时，用超声波清洗单向阀，或更换单向阀.5泵头与泵头座之间的缝隙，或清洗液出口漏液更换柱塞密封圈。更换柱塞密封圈后仍漏液时，更换柱塞。6流路的连接处漏液用力拧紧公螺母。

60、拧紧后仍漏液时，更换公螺母和箍环。7流路堵塞，或将要堵塞。管道过滤器用超声波清洗，或更换过滤器。找出堵塞的部件，更换新部件。8。柱塞密封圈的使用寿命将到极限更换柱塞。流量比设定值小1单向阀工作不正常。输送异丙醇，清洗单向阀清洗后仍无效时，用超声波清洗单向阀，或更换单向阀。2吸滤器网眼堵塞。(*2) 用超声波清洗吸滤器。超声波清洗无效时，更换吸滤器。保留时间的再现性不良1单向阀工作不正常。清洗仍无效时，更换单向阀，或用超声波清洗。高压梯度时2台输液泵的压力表示不一致(相差在±05MPa(5kSfcm2)或±2以内属于正常)1压力传感器的零点未对准。用辅助功能"ZER

61、。 ADJ"，调整零点2。其中1台输液泵的管道过滤器网眼堵塞。用超声波清洗管道过滤器，或更换管道过滤器。3。2台输液泵的流路合流之前，流路有堵塞的地方找出堵塞的部件，更换部件压力上不去1排液阀开着关闭排液阀。2。流路连接处漏液 拧紧公螺母 拧紧后仍无效时，更换公螺母和箍环压力上升过高(取下柱确认)1管道过滤器堵塞。管道过滤器用超声波清洗，或更换2流路堵塞找出堵塞的部件，更换。3配管的内径过细使用指定的管子气相色谱操作规程及注意事项：1. 气相色谱仪简单操作流程1.1 反时针方向开启载气钢瓶阀门，减压阀上高压压力表指示出高压钢瓶内贮气压力。1.2.顺时针方向旋转减压调节螺杆，使低压压力

62、表指示到要求的压力数。1.3开启主机电源总开关，主机的触摸式荧光屏显示仪器正在自检，柱室内鼓风马达运转。1.4打开与气相色谱仪连接的电脑，并运行气相色谱仪工作软件，待软件与仪器连接成功后，即可进行实验。1.5在气相色谱仪工作软件里分别设定载气流量、检测器温度、进样口的温度，柱箱的初始温度及升温程序等。设定完后，各区温度开始朝设定值上升，当温度达到设定值时，READY灯亮。1.6查看仪器基线是否平稳，待基线平直后，即可进样测试。1.7实验完毕后，先关闭检测器电源，再停止加热，待色谱柱、进样口的温度降至80以下时，依次关闭色谱仪电源开关，计算机电源，最后关闭载气减压阀及总阀。1.8登记仪器使用情况，做好实验室的整理和清洁工作，并检查好安全后，方可离开2 测试条件的设定：色谱条件的设定要根据不同化合物的不同性质选择柱子，一般情况极性化合物选择极性柱。非极性化合物选择非极性柱。色谱柱柱温的确定主要由样品的复杂程度决定。对于混合物一般采用程序升温法。柱温的设定要同时兼顾高低沸点或溶点化合物.可根据不同的化合物任意改动，其目的要达到在最短的时间里，使每个化合物的组份完全分离。3 注意事项：3.1操