打靶载体构建

1、基因敲除小鼠的构建利用同源重组技术进行打靶载体的构建利用同源重组技术进行打靶载体的构建孔 冬小鼠遗传学实验室南京大学模式动物研究所基本原理基本原理传统意义上的打靶载体的构建受基因组 DNA 上限制性内切酶位点的强烈局限。考虑到后期利用 Southern 杂交进行阳性克隆筛选时的内切酶是否可以区分重组和野生型染色体，同时顾及同源臂两端的内切酶是否能与常用载体的多克隆位点相匹配，最后可供我们进行选择的打靶区域往往非常有限。而近年来发展起来的基于噬菌体的大肠杆菌同源重组系统为我们摆脱这种束缚提供了一个有效的平台。高效、省时、灵活是该系统的三大特点。2004 年底小鼠 129 品系 BAC 文库末端测

2、序的完成更为这一技术的应用提供了巨大的便利。大肠杆菌中同源重组的研究由来已久，其原理如图 1 所示。而 Neal G. Copeland, Nancy A. Jenkins 以及 Donald L. Court 实验室所采用的 噬菌体 RED 系统较之前代又有以下优势：高效；所需同源序列由 500bp 降至45bp；低突变率。为使此系统能便利的应用于条件性基因敲除打靶载体的构建，他们建立了两个大肠杆菌菌株EL250、EL350；三个质粒 pL253、pL451、pL452 （图谱见附录）。两个菌株中的 gam 基因以及 RED 重组酶基因 exo 和 bet 均受温度敏感性 抑制子 cI857

3、的严格调控。抑制子在32处于活化状态，而其在 42的短暂失活能使其控制的基因迅速表达。此外，EL250 中的 Flpe 及 EL350 中的 Cre 重组酶基因则受阿拉伯糖诱导的 PBAD启动子的调控，在阿拉伯糖的参与下进行表达。这两个菌株可以有效地去除 loxP 或 FRT 重组位点间的 NEO 筛选框。质粒 pL253、pL451、pL452 均来源于 pBlue/Script 载体，分别用于打靶载体的骨架，loxPFRT-NEO-FRT、或 loxP-NEO-loxP 片段的 PCR扩增。利用此系统构建条件性打靶载体的基本步骤如图 2 所示。图图 1基因敲除小鼠的构建自 Sanger 研

4、究所定购的 129 BAC 克隆被装入 DH108 菌株以琼脂为载体进行邮寄。为使后续操作易于进行，我们首先从 100200 Kb 的 BAC 中将包含左右同源臂的目的片段（约 1020Kb）套取下来（见图 3A）。pL253 载体中的两段同源序列各长 500bp，是以 129 基因组 DNA 为模板，用 PCR 的方法获得，经内切酶消化后连接克隆入 pL253 载体。利用介于两段同源序列之间的线性化位点进行线性化的 pL253 载体在 EL350 中与 BAC 发生同源重组。阳性克隆可用氨苄青霉素筛选获得。插入 loxP 位点的原理如图 3B 所示。包含两段各长80bp 同源序列的 loxP

5、-NEO/Kan-loxP 片段同样以 PCR 制备，所不同的是该同源序列包含在 PCR 的引物进行合成。同源重组后的质粒同时具有氨苄青霉素和卡那霉素抗性。重新将质粒抽提物转入 EL350 中可以去除菌株中其它未发生重组的质粒。加入阿拉伯糖后 Cre重组酶的表达可以将 loxP 位点间的 NEO 剪切掉，从而只留下一个 loxP。同样道理我们可以在 EL250 中插入第二个 loxP。FRTNEO/KanFRT 留在载体中可用于ES 细胞的筛选。最终的载体用测序的方法进行验证。图图 2基因敲除小鼠的构建图图 3实验技术实验技术以下以基因 MLCK(myosin light chain kina

6、se)为例，其载体构建过程如图 4E 所示。129 小鼠品系 BAC 克隆的查询及订购1 前往 ，点击 Mouse（如箭头所示）。2 在 Search 框内寻找目的基因，例如 p53。基因敲除小鼠的构建3 在检索结果中选则所要的项。4 点击 View gene in genomic location 后面的链接。5 滚动页面到图示位置，点击 DAS Source，选择 129S7/AB2.2 clones和 BAC ends 选项。6 点击 close menu，等待页面刷新。滚动页面到图示位置，绿色和红色（代表在克隆内不同的方向）的线条都代表包含 Trp53 的

7、 BAC 克隆，左边线条下是克隆号。7 任选一个克隆比如 bMQ358p19，点击克隆号出现下拉菜单，点击DAS LINK: bMQ358p09。基因敲除小鼠的构建8 滚动页面到图示位置，点击 MTA required（箭头所示处）9 从 Sanger 定购 BAC 需完成两部分表格：（1）网上电子表格 （2）MTA 表格，此表格需传真并邮寄原样。登陆 /Mus_musculus/ 网站查询目的基因。 BAC 的抽提及纯化 试剂：SolutionSolution I I:Tris-HCl0.05 MEDTA 0.01 MpH 8.0SolutionSo

8、lution IIII:SDS1% NaOH0.2 MSolutionSolution IIIIII:KAc5 MpH 5.5步骤:1搜集细菌。9000 rpm 离心 10 分钟，倒掉上清；2加入 5ml 预冷的 Solution I 及 20ul 25mg/ml RNaseA，重悬；3加入 5ml SolutionII,上下颠倒 510 次，室温放置 10 分钟；4加入 5ml 预冷的 SolutionIII，上下颠倒 510 次， 冰放置 10 分钟；510，000 rpm 离心 10 分钟，收集上清到新离心管，如仍有白色沉淀物悬浮，重复离心一次；6加入 12ml 异丙醇，振荡器混匀；71

9、0，000 rpm 离心 10 分钟，倒掉上清，留下白色 DNA 沉淀；8重悬入 500 ul SolutionI，加等体积 1：1 酚氯仿，振荡器混匀；基因敲除小鼠的构建912，000 rpm 离心 5 分钟，将上层吸入新的 1.5 ml 离心管中，注意不要吸入白色沉淀；10加 50ul 3M NaAc pH 5.2, 以及 350 ul 异丙醇，混匀并在 12，000 rpm 离心 10 分钟；11 倒掉上清，加入 500ul 70 乙醇，12，000 rpm 离心 5 分钟；12倒掉上清，将 DNA 沉淀在空气中凉干；13用 100 ul MilliQ 水溶解 DNA。电转感受态细菌的制

10、备及 BAC 电转1.接种单克隆 EL350/EL250 至 3 ml LB 培养基中，32 240 rpm 培养 1216 小时； 2.第二天，将过夜菌液 1ml 接种到 50ml LB 培养基，32 240rpm 培养 23 小时至 OD6000.50.7；3.(如只转 BAC 而不进行同源重组，此步省略) 将 10ml 菌液分装到 200ml 锥形瓶，置于 42水浴摇床中（约 40rpm）保温 15分钟；4.将锥形瓶置于冰上 20 分钟，此间将 pH7.4 MilliQ 水，以及电转杯，离心管置于冰上预冷；5.于 4离心机 3，500 rpm 离心 5 分钟将菌液沉淀；6.以 1ml 冰

11、水将菌体轻轻重悬，3，500 rpm 离心 5 分钟，倒掉上清；7.重复步骤 6 三次；8.倒掉上清，余下约 50ul 用以悬浮菌体；9.将此感受态细菌与 100400 ng DNA（必须溶于 MilliQ）混合并转入预冷的 0.1cM 电转杯中，置于冰上准备转化；10.设置 BIORAD 电转仪，1.75KV，25uF，200,进行电转；11.电击后，迅速加入 500 ul SOC 并于 32保温 30 分钟；12将菌液均匀的涂在相应的 LB 琼脂板上，于 32保温1220 小时PCR 引物设计及 PCR 纯化MI-L 5- GCGGCCGCTGTCCCTACTCCTAATTTGTCC -3

12、MI-R 5- AAGCTTAGTGTGTTGGGGACATGGCT -3MII-L 5- AAGCTTGCAAACCTCAGACATCAGGG-3MII-R 5- ACTAGTGGGAAGCACCTGAAATCTGG-3基因敲除小鼠的构建Ploxp L 5-TGAAGTACCCAAGGACTACAAGAAAGGTTCATGAGGAAATAAATGGCTGGCAGTCACTGGTAAGAGGAGAGTTTGAAGGTGAATTCCTGCAGCCCAATTCCGATC-3Ploxp R 5-CTGACTGGAAAAGGAGCCAGATACATATTGGCAAGCTCTGGTCTCCTCAGCCC

13、AGCCTCCTGACTCCTCCACCATGTCTGGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCTCG -3Pfrt L: 5-AGCAGTCTGCTAGCCTTGGGACCCCTGTACCCACTGTCCTCCTGACTTCTTGTCTAATCTTATCTTTTTAACATATAAATTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCC-3Pfrt R: 5-CCCCATGATTTGCCTCTAGTAGTGTAGAAACAGGAAAGATGAATGAATGGATGGGAGTAAGACCATTTTCTGTTTTCTTATCGCTCTAGAACTAGTGGATCCACCTAATA

14、ACTTC-3其中 MI，M II 两对引物用于扩增两段各长 500bp 同源序列 I 和II。PCR 产物与 T 载体连接，然后分别用 Not I ,Hind III 和HindIII，SpeI 将片段 I 和 II 切下来，同时连入 Not I, Spe I 酶切过的PL253 载体，这样就构建好了用于套取目的片段的载体 I-II-PL253。其中 Hind III 将用于该载体线性化。PLoxp 这对引物用于扩增两端各长80bp 同源序列的 loxP-NEO/Kan-loxP 片段，而引物 Pfrt 用来扩增两端各长80bp 同源序列的 FRTNEO/KanFRT 片段。以上 PCR 产

15、物以及酶切片段均用 QIAquick Gel Extrcction Kit 纯化。 套取 BAC 中的目的片段将转入 BAC 的 EL350 制备成电转感受态，同时将线性化的载体 I-II-PL253 转入其中（100200ng/50 ul 感受态菌）。电转后的菌用 Amp+ 的 LB 板筛选。其中发生准确交换而形成的质粒 MLCK-PL253 的酶切图谱如图 4A 所示。插入loxP-NEO/Kan-loxP 片段 将上述含有 MLCK-PL253 的 EL350 制备成电转感受态，并将纯化的 loxP-NEO/Kan-loxP 片段转入其中（100200ng/50 ul 感受态菌）。电转后

16、用 Amp+ Kan+ 的 LB 板筛选。为了得到插入 loxP-NEO/Kan-loxP 片段的纯的质粒 MLCK-PL253 基因敲除小鼠的构建1stLoxp,我们还需将上面筛选得到的质粒重新转入 EL350 中，并用 Amp+ Kan+ 筛选。质粒 MLCK-PL253 1stLoxp 的酶切图谱如图 4B 所示。Cre 介导的 loxP 位点间 NEO 片段的去除1.将含有 loxP-NEO/Kan-loxP 质粒的 EL350 克隆接种到 3ml LB培养基（Amp+ Kan+）中, 32 240rpm 培养 1216 小时；2.第二天，将 1ml 过夜菌液转入 10ml LB，32

17、 培养 23 小时至 OD6000.5;3.加入 100ul 10% L(+)-阿拉伯糖，继续培养 1 小时；4.将菌液稀释后分别涂在氨苄青霉素和卡那霉素 LB 琼脂板上，32培养过夜5.氨苄青霉素板上的克隆应远远多于卡那霉素板。在前者上挑取几个克隆培养并用 PCR，酶切或测序方法进行验证。 其中 NEO 去除后的质粒 MLCK-PL253 1stLoxP pop out 的酶切图谱如图 4C 所示。插入FRTNEO/KanFRT片段 将质粒 MLCK-PL253 1stLoxp pop out 转入 EL250，并制备成电转感受态，同时将纯化的片段 FRTNEO/KanFRT 转入其中（10

18、0200ng/50 ul 感受态菌）。电转后的菌用 Amp+ Kan+进行筛选。得到的质粒再转入 EL250，通过 Amp+ Kan+ 筛选得到纯的目的载体。插入该片段的质粒 MLCK-PL253 1stLoxP 2ndLoxP 的酶切图谱如图 4D所示。 目的载体经过测序，确认正确后就可用于 ES 细胞的电转。图图 4基因敲除小鼠的构建 (A) MLCK-PL253 酶切图谱 (lane 1, HindIII; lane 2, EcoRI). (B) MLCK-PL253 1stLoxP 酶切图谱(lane 2, HindIII; lane 3, EcoRI). (C) MLCK-PL253

19、 1stLoxP pot out 酶切图谱(lane 2, HindIII; lane 3, EcoRI). (D) MLCK-PL253 1stLoxP 2ndLoxP 酶切图谱(lane 2, HindIII; lane 3, EcoRI). (E) MLCK 打靶载体构建过程. M 代表 Marker EcoR 14 digest. 实验试剂及耗材实验试剂及耗材参考文献参考文献1. Lee, E.C. et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for rec

20、ombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics 73, 56-65. (2001).2. Ellis, H.M., Yu, D., DiTizio, T. & Court, D.L. High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 6742-6. (2001).3. Muyrers, J.

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22、nt mutation of bacterial artificial chromosomes by ET recombination. EMBO Rep 1, 239-43. (2000).6. Muyrers, J.P., Zhang, Y. & Stewart, A.F. Techniques: Recombinogenic engineering-new options for cloning and manipulating DNA. Trends Biochem Sci 26, 325-31. (2001).基因敲除小鼠的构建7. Narayanan, K., Willia

23、mson, R., Zhang, Y., Stewart, A.F. & Ioannou, P.A. Efficient and precise engineering of a 200 kb beta-globin human/bacterial artificial hromosome in E. coli DH10B using an inducible homologous recombination system. Gene Ther 6, 442-7. (1999).8. Swaminathan, S. et al. Rapid engineering of bacterial artificial chromosomes using oligonucleotides. Genesis 29, 14-21. (2001).9. Yu, D. et al. An efficient recom