食品生物技术完整版

1、名词解释：发酵工程：在最适发酵条件下，在发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。发酵单位：又称效价。是衡量发酵罐中目的产物的含量高低的指标，属于技术指标一把用u/ml,mg/l。一般情况下用于表示发酵水平的高低生物转化：指外源化学物在机体内经多种酶催化的代谢转化前体:指在产物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质。最早是在青霉素生产中发现的 玉米浆（苯乙胺） 虾青素（甲羟戊酸）消毒：在工业微生物中消毒指的是除去杂菌，除去会引起污染的微生物，在工业上是灭杀引起生产污染的微生物灭菌：指的是杀死一切微生物(包括繁殖体和芽孢），不分病原和非病原微生物，杂菌和非杂菌。指把物体

2、上的所有微生物（包括细菌芽孢在内）全部杀死的方法透气比/VVM：单位时间（min）单位体积（m³）培养基中通入标准状况下空气的体积在线检测：利用传感器检测不离开生产线的对参数实时监测离线监测：检测样品离开生产线，检测后生成不在一起的检测溶解氧：指溶解在水中的分子氧，以每升水中所含氧的毫克数来表示临界溶氧浓度：不影响微生物呼吸时的最低溶氧浓度Monod方程：随着细胞的大量繁殖，培养基中的营养物质迅速消耗至限制浓度，培养基中有害代谢产物积累增多，细胞的生长速率逐渐下降，进入减速期，当培养液中不存在抑制细胞生长的物质时，细胞的比生长速率和限制性基质浓度S的关系活化：保藏菌种到斜面种子扩大培

3、养：斜面种子-三角瓶液体培养-种子罐干热灭菌：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物，适用于玻璃及金属用具、沙土管灭菌 140180 12h湿热灭菌法：借助蒸汽释放的热能使微生物蛋白质酶核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆变形，使微生物死亡。在有水分存在情况下，pr更易受热凝固变性，是用培养基和发酵设备灭菌。121 30min 饱和蒸汽；100度 水煮热灭菌法：利用空气压缩时放出的热量进行保温杀菌。从压缩机到空气贮罐一段管道保温进行保温是空气达到高温后保持一段时间，保证卫生网死亡辐射灭菌：声能，高能阴极射线、X射线、Y射线和紫外线都能破坏蛋白质活性起到杀

4、菌作用静电除菌：悬浮于空气中的微生物，微生物孢子大多有不同的电荷，没有带电荷而微粒在进入高压静电场是都会被电桥变成带电微粒过滤除菌：微粒随电流通过滤层是，滤层纤维所形成的网格阻碍气流直线前进，使气流出现五十次改变运动速度和运动方向，绕过纤维前进，这些改变引起微粒对滤层纤维产生惯性冲击、阻拦，重力沉降，布朗扩散，静电吸引壁作用而微粒滞留子纤维表面，从而达到除菌目的。影响氧传递的因素：微生物发酵中，通入发酵罐内的空气中含有的氧不断溶于培养液中，以供菌体细胞代谢之需。这种由气态氧转变为溶解态氧的过程与液体吸收气体的过程相同，所以可用描述气体溶解于液体的双膜理论的传质公式表示：N=kLa(C*-CL)

5、 N:O2的传递速率 C*：溶液中饱和溶解氧浓度 CL：溶液主流中的溶解氧浓度 kL:以浓度差为推动力的氧传质系数 a：比表面积培养基灭菌机理：致死温度：杀死微生物的极限温度（最低或最高温度）2致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需时间。反应速率常熟K：K与菌种的特性有关，相同温度下，微生物越耐热，K值越小；相同温度下，微生物越不耐热，K值越大同样的温差，如同样升高10，活化能越高，则K增加越多，K对温度越敏感。活化能为零，则为零级反应。K不随温度变化。碳氮比：有机物中碳的总含量与氮的总含量的比氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影

6、响产量。碳源过多，则容易形成较低的pH（封压变大，CO2在水中溶解度变大），不利于菌体的生长，若碳源不足则会引起菌体的衰老和自溶。速效碳源：能够被微生物直接利用的含碳化合物迟效氮源：无机氮源或已蛋白质降解产物形式存在的有机氮源速效氮源：可以直接被菌体吸收利用的氮源内源调节：由发酵液中微生物分泌的代谢产物导致的发酵液pH的变化外源调节：由外源添加的物质导致的发酵液pH的变化如何调节：用难溶碳酸盐调节pH渗透压：在半透膜两侧由于浓度差而导致的溶剂压力差。附上图 恰好能够阻止水分子通过半透膜从浓度较低的溶液移向浓度较高的液体的，在较高浓度溶液的液面上施加的额外压强。湿热灭菌：微生物细胞是由蛋白质组成

7、，加热可以导致蛋白质变性，从而达到微生物灭菌的目的。微生物对高温的敏感性大于对低温的敏感性，所以采用高温灭菌是一种有效的灭菌方法。细胞内蛋白质的凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内的含水量越大，蛋白质凝固越快。优点：更低温度达到更好的效果。高温比低温易死，湿热比干热更易死。易错PCR：指在扩增目的基因的同时加入碱基错配，导致目的基因随机突变交错延伸：在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步，缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。填空：发酵方法的类别：按微生物生长特性： 分批发酵 连续发酵按培养基物理

8、性状： 液体 固体 按对氧气需要： 厌氧 有氧发酵按用途： 斜面培养基 种子培养基 发酵培养基细菌：营养肉汤和营养琼脂培养基 牛肉膏和蛋白胨菌种保藏的意义：菌种会退化菌种保藏的原理：休眠体菌种保藏的方法：斜面低温保藏 液体石蜡保藏 液氮冷冻保藏 临时保种 低温缺氧 慢速冻结 每min 30 霉菌 酵母菌 有芽孢的细菌易保存Q发酵=Q生物+Q搅拌Q蒸发Q辐射微生物细胞的破碎：机械破碎法：高压匀浆法 珠磨法 超声波碎法 非机械破碎法：溶酶法 化学渗透法 除菌方法：辐射杀菌 热杀菌 静电除菌 过滤除菌法（空气中用得最多）降低发酵液中的CL：减少通气量或搅拌转速膜分离的四种方法： 透析、超滤、反渗透、

9、电渗透简答：灭菌意义：如有杂菌 6.噬菌体溶菌 5.杂菌降解所要产物 4.杂菌汤所产生的物质使提取产物时发生困难 3.杂菌污染终产品 2.杂菌生长速度快1.搅拌桨的作用：1产生轴向和横向流动，促进传质和传热2打碎气泡，增加气液接触面积，提高溶氧3消除泡沫4速度太快会导致剪切力增加，也会导致气泛提高饱和溶解氧浓度C*的办法：降温溶液性质：溶质含量越高，氧溶解度越小氧分压：在系统总压小于0.5MPa时，氧在aq中溶解度只与氧的分压成直线关系，气相中氧浓度越高，溶液中氧浓度也增加温热灭菌巴斯德灭菌：酒、啤酒、乳类、奶油和各种腌制食物的调制63 30s 7215s间歇灭菌：各种M的营养体在100下半小

10、时即可被杀死，先杀亲本，等子代长大再杀而芽孢和孢子不会失去活力，当它们长成营养体再杀菌，连续灭菌3次过滤除菌：用于压缩空气，酶溶液以及其他不耐热的微生物 0.01-0.45mm辐射灭菌（超净工作台）：紫外线、X射线、Y射线 紫外灯刚灭菌有O3（臭味）化学物质灭菌：使用范围：器皿、双手，实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌高锰酸钾：强氧化剂，使Pro氧化 （浸化）漂白粉：强氧化剂，使Pro氧化变性75%酒精：细胞脱水，Pro凝固 新洁尔灭：阳离子表面活性剂，膜损伤和蛋白质变性甲醛：强还原剂，与氨基结合，蛋白质变性。利用高锰酸钾的催化作用，促使甲醛迅速蒸发放出大量穿透力大，杀菌力弧的甲醛气

11、体，进行空气消毒发酵工程的产品：1.以微生物细胞为产物的发酵工业 2.以微生物代谢产物为产品的发酵工业 3.以微生物酶为产品的发酵工业 4.生物转化或修饰化合物的发酵工业1、 生物技术包括哪些主要内容？基因工程在生物技术中作用和地位？ 主要内容：基因、细胞、酶、蛋白质、分子进化工程 地位：是现代生物技术中的核心技术 作用：基因工程的主要原理是应用人工方法将生物遗传物质DNA分离出来，在体外进行切割、拼接和重组，然后通过运载工具将重组的基因导入某种宿主细胞或个体，从而改变宿主的遗传特性；有时还使导入新的遗传信息在宿主细胞中或个体中大量表达，以获得大量所需的基因表达产物（各种生理活性物质，如蛋白质

12、、酶、多肽、抗生素等等）。这种利用DNA重组技术来创造新物种或给予生物以特殊的技术称基因工程，由此可见，基因工程为生物技术中的其他内容如细胞工程、酶工程等提供了基础，为其它内容提供新的，具有特殊功能的细胞。2、 简述生物技术在食品工业中的作用 传统生物技术：传统生物技术从很早起便为人们所开发和利用，并造福人类，如利用传统生物技术，人们使面包发酵，制作酒精饮料，果汁发酵、制醋和酿酒等。丰富了食物的风味和种类 现代生物技术：现代生物技术以基因工程为核心，带动了现代发酵工程、现代酶工程、现代细胞工程、蛋白质工程以及分子进化工程的发展，它的出现，为改造传统的食品生产、进行食品深度加工，开发新产品，提高

13、食品质量和减少营养损失增添了新的活力如其中的基因工程和细胞工程可改善食品原料农产品的品质和提高产量；通过基因工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程和分子进化工程食品加工工艺高效化，提高食品附加值，提高农产品利用率，以及提高食品保健功能；利用生物技术减少食品损失，保证食品的安全性和质量。1、 何为限制性内切酶？II型限制性内切酶的基本特征有哪些？限制性内切核酸酶，简称限制酶，是指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶基本特征： 识别序列和切割位点：大多数II型限制性内切核酸酶可识别长度为4-7bp的双链DNA特定序列，该识别序列（识别位点）常呈旋转对称性 切割方式：根据双链DNA被

14、切割所称的末端，可分为平齐末端，黏性末端和单链黏性末端 同裂酶和同尾酶：由同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以彼此连接起来，但是由此连接形成的重组DNA分子往往不能被原来同尾酶中的任何一种重新切开，即原来同尾酶的识别序列都已不再存在。 限制性片段长度与切割频率：不同限制酶切割后所产生的DNA后所形成的限制性片段长度不一2、 DNA聚合酶在分子生物学基因工程中有哪些用途？DNA聚合酶催化DNA体外合成反应。不同DNA聚合酶具有不同用途： 大肠杆菌DNA聚合酶I：a以切刻平板法标记DNA；b对DNA分子的3突出尾进行末端标记 大肠杆菌DNA聚合酶I大片段：a补平限制酶切割双链DNA所产生的3凹端；

15、b如果以标记的dNTP补平双链DNA的3凹端，那么可对DNA分子进行末端标记；c对DNA分子的3突出尾进行末端标记；d在cDNA克隆中，合成cDNA第二链；e应用Sanger双脱氧末端终止法进行DNA测序 T4噬菌体DNA聚合酶：a补平限制酶双链DNA产生的3凹端；b如果以标记的dNTP补平双链DNA的3凹端，那么可对DNA分子进行末端标记；c对DNA分子的3突出尾进行末端标记，并且该酶为利用此法进行此类末端标记的首选酶；d将双链DNA的突出端转化成平齐端 TaqDNA聚合酶：a对DNA进行测序b通过聚合酶链式反应对DNA分子的特定序列进行体外扩增 逆转录酶：a将mRNA转录成双链cDNA；b

16、标记带5突出端的DNA片段（补平反应）；c当大肠杆菌DNA聚合酶I的KIenow片段或测序酶等使用结果不理想时，它可用于双脱氧链终止法测定DNA序列 末端脱氧核苷酸转移酶：a给载体DNA或cDNA加上互补的同聚尾；b以32P标记的一种dNTP、一种ddNTP或一种rNTP来标记DNA片段的3端3、 理想的质粒基因工程载体的应具备哪些条件？ 分子结构中具有多个单一限制酶切位点，具有易被检测的选择标记基因，且切点位于选择标记基因上； 能插入、运载一定大小的外源基因； 在携带外源基因前后在宿主细胞内均能自主复制 在与外源基因构建重组质粒后具有转化功能； 分子量小，易于操作，一般为松弛型复制控制 容易

17、控制，安全可靠4、 Ti一元载体和双元载体体统比较有哪些优缺点？ 微型Ti质粒具有大肠杆菌质粒的复制起点，能在大肠杆菌宿主中复制，使其质粒拷贝数增加10-100倍 微型Ti质粒分子量小（10kb），可以直接对其进行体外遗传操作，而且将其导入根癌农杆菌也比较容易 一元载体系统的重组频率很低，而双元载体系统两个质粒的接合频率较高，一般后者比前者至少高4倍 一元载体系统构建成功后工程菌的稳定性较好，而双元载体系统相应稳定性较差，易丢失 双元载体系统不需要经过共整合过程。因为，双元载体系统中的两个质粒不必含有同源序列，而且构建操作步骤比较简单。 双元载体系统在外源基因转入植物细胞前，无须进行同源重组。

18、因此插入双元载体系统外源基因的可能变异比插入一元载体系统外源基因的可能变异小 双元载体系统比一元载体系统对植物的转化效率高5、 标记基因应具备哪些条件？举例说明植物载体中常用的选择标记基因和筛选标记基因标记基因一般需要具备以下几个条件： 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶 基因较小，可以构成嵌合基因 能在转化体中得到充分表达 检测容易，并能定量分析植物载体中常用的选择标记基因： Npt-II（新霉素磷酸转移酶）基因：目前在植物基因工程中应用最广泛的选择标记基因原理：其表达产物通过酶促磷酸化作用使氨基葡萄糖苷类抗生素失活，从而解除其毒性，它对茄科植物的转化选择特别有效，但是，其对豆科植物和单子叶

19、植物的转化选择效果不好 HPT（潮霉素磷酸转移酶）基因：原理：其表达产物通过酶促磷酸化作用使潮霉素失活，从而解除其毒性植物载体中常用的筛选标记基因： Gus（葡萄醛酸糖苷酶）基因：来自于大肠杆菌染色体其在植物细胞中所产生的葡糖醛酸糖苷酶在检测上具有以下特点：A 在一定条件下水解特定底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡糖醛酸酯生成蓝色物质，呈现蓝色沉淀。因此，既可用分光光度计测定，又可通过组织化学方法直接观察植物组织中的蓝色沉淀斑点B 在一定条件下，水解特定底物4-甲基伞形酮酰-葡糖醛酸苷生成4-甲基伞形酮，产生荧光，因此，可用荧光光谱法测定，该法非常灵敏。C 检测简便、迅速且能定量D Gus检

20、测比Ntp-II检测便宜，且不需要使用放射性同位素 Cat（氯霉素乙酰转移酶）基因：该基因来自于细菌转座子Tn9其在植物细胞中所产生的氯霉素乙酰转移酶在检测上具有以下特点：A 可用硅胶G薄层层析法等测定所生成的乙酰化产物以确定该酶的活性，但操作繁琐B 一般Cat基因表达产物不够稳定C 测定花费大6、 酶促标记探针的方法有哪些？用到了哪些工具酶？ 切刻平移法：DNA酶I DNA聚合酶I 随机引物法：DNA聚合酶I 末端标记法：DNA聚合酶I，T4DNA聚合酶，T4多核苷酸激酶，末端脱氧核苷酸转移酶7、 Southern blotting的实验流程及注意要点实验流程：用适当的限制性内切核酸酶对待测

21、DNA进行酶切经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离将含有DNA片段的琼脂糖凝胶进行碱变性处理将其中的单链DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜或其它固相支持物上（各DNA片段的相对位置保持不变）放射自显影或免疫酶法显色显示杂交结果注意要点： 所取待测DNA样品的量因样品种类及研究目的而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5g；对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列，取10-20g；对于采用寡核苷酸探针或当探针的比放射性活性较低时，取30-50g 选用适当的限制性内切核酸酶酶切待测DNA样品的目的在于获得合适长度的DNA片段，一般而言，较理想的片段长度为0.5-10kb 电

22、泳结束后，需要在紫外线下仔细观察检查DNA样品有无降解，酶切是否完全，电泳分离效果是否理想，DNA电泳带型是否清晰，有无拖尾现象。 一般采用0.45m孔径的硝酸纤维素滤膜，但当DNA片段小于300bp时，可选用0.22m孔径的硝酸纤维素滤膜或采用尼龙膜8、 PCR反应体系有哪些成分？PCR的基本流程反应体系： KCl 50mmol/L Tris-Cl 10mmol/L（在室温时pH8.4） MgCl2 1.5mmol/L 明胶或牛血清蛋白 100g/L 2个引物 各0.25mol/L 4种底物（dATP、dCTP、dGTP、dTTP） 各200mol/L 模板DNA 0.1g TaqDNA聚合

23、酶 2.5IUPCR的基本流程： 变性，通过加热至一定温度使双链DNA两链之间的氢键断裂，DNA双链离解形成两条DNA单链 复性，当反应体系温度突然降低时，由于模板DNA分子的结构比引物DNA分子复杂得多，而且反应体系中引物的量大大多于模板，因此引物和与其互补的模板配对形成局部杂交双链，而变形后离解形成的两条模板DNA单链之间互补配对的机会则较少 延伸：在4种脱氧核糖核苷三磷酸底物、Mg2+等存在的条件下，TaqDNA聚合酶以模板-引物杂交体分别为模板和引物催化DNA链沿5-3方向合成延伸，每个循环的扩增产物作为下循环的模板9、 PCR引物设计的一般原则（1） 长度可为15-30nt，常为20

24、-27nt（2） G+C含量一般可谓40%-60%，常为45%-55%（3） 组成碱基尽可能随机分布，不能存在聚嘌呤或者聚嘧啶。尤其3端不能以3个连续G或者3个连续结束。否则，会使引物在模板G+C富集区错误引发。（4） 引物自身不能存在互补序列，连续互补碱基不能超过3个。否则，引物自身会折叠形成发奖状等二级结构，这些二级结构的空间位阻作用更影响引物与末班的复性结合。（5） 两个引物之间不能有互补性，尤其3端不能存在互补性。否则，会形成引物二聚体。两个引物之间不能超过4个连续碱基的同源性或者互补性。（6） 引物3端原则上须与模板DNA配对。当引物3端末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能较好引

25、发链的延伸。而当引物3端末位碱基为T时，如果为错配之碱基，其引发链延伸的效率就大大降低。当引物3端末位碱基为G或C时，如果错配之碱基，其引发链延伸的效率就介于上述两者之间。因此，引物3端的末位碱基最好选T、C或G，不选A。（7） 由于引物5端只限定PCR产物的长度，而不影响扩增的特异性，因此引物5端可被修饰。修饰包括：附加酶切位点、引入蛋白质结合序列、突变位点、启动子、生物素等。总之，引物5端碱基没有严格限制，只要与模板DNA结合的引物部分的长度足够，其5端碱基可以不与模板DNA匹配而呈游离状。（8） 如果需要扩增编码区域，引物3端就不要终止于密码子的第三位，因为密码子的第三位易出现简并现象，

26、从而影响扩增的特异性与效率。（9） 引物的序列与模板的非扩增区序列之间的同源性不要超过70%或者不要有连续8个碱基互补同源。10、 反向PCR，简并PCR，逆转录PCR，巢式PCR（1） 反向PCR：将含已知序列区段的DNA分子，用在已知序列区段内没有切点的合适的限制性内切核酸酶媒介，产生大小适于PCR扩增的酶切片段。将这些酶切片段的两端连接起来形成环状分子，用一对与已知序列区段两侧互补的引物进行PCR。对已知序列区段而言，在引物与模板复性后，两引物的3端相背，两引物的延伸沿环状分子的未知序列区段进行。（2） 简并PCR：所谓简并引物是指碱基序列不同，但有相同碱基数的一组针对某一基因相同区段的

27、寡核苷酸混合物。值得指出的是，由于次黄嘌呤可与任何碱基配对，因此在碱基高度简并位置可以使用次黄嘌呤替代。简并引物PCR是指利用简并引物进行PCR的方法，该法主要用于仅知蛋白质部分序列而求知其编码基因序列的研究、寻找已知基因家族中新成员的研究等。（3） 逆转录PCR：以总RNA或mRNA为模板进行逆转录，然后再进行PCR扩增。该法主要用于基因表达等研究。（4） 巢式PCR：首先以第一对引物对模板进行扩增，即扩增靶基因中较大区域片段DNA，然后再以较大区域内的序列设计合成第二对引物。再对模板进行PCR扩增，即扩增靶基因中较小区域片段DNA。该法两次连续扩增模板靶基因，可进一步提高PCR检测的灵敏度

28、和特异性。该法特别适于微量模板的扩增11、 如果要分离目标基因，应该至少知道哪些特征？在完全位置基因核苷酸序列的情况下，基因的分离策略大多比较复杂。一般分离基因的策略多基于基因一下几个基本特性中的至少一个：具有特定的核苷酸序列；存在于基因组中某一特定位置；编码mRNA；大多具有一定的功能。12、 目标基因制备的方法有哪些？（1） 基因化学合成法：全基因合成；基因的半合成就化学本质而言，基因是一段具有特定生物功能的核苷酸序列。如果知道了基因的分子结构，就可以进行基因的化学合成。（2） 基因组文库法：机械切割法；限制性内切酶局部消化法是一种直接从基因组中分离目的基因的方法。所谓基因组文库是指汇集某

29、一基因组所有DNA序列的重组DNA群体（3） cDNA文库法：是从真核生物细胞分中分离目的基因的常用方法cDNA文库：是指汇集以某种生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体构建cDNA文库的一般操作程序如下：总RNA的提取mRNA的分离cDNA双链的合成cDNA与载体连接噬菌体的包装及转染或质粒的转化（4） PCR法：可用于已知核苷酸片段的特意扩增；而一些改进的PCR法可以用于一些未知核苷酸序列核酸片段的特意扩增。13、 重组体导入大肠杆菌，植物动物各有什么方法？植物：农杆菌质粒介导法；基因枪法动物：显微注射法；磷酸钙共沉淀法；电穿孔法；病毒感染法14、 重组体筛选和鉴定

30、方法（遗传检测法） 利用表型特征进行筛选a) 利用载体提供的表型特征进行筛选（抗药性标记基因插入失活筛选法；-半乳糖苷酶显色反应筛选法）b) 利用外源DNA提供的表型特征进行筛选c) 利用噬菌斑的形成进行筛选d) 利用遗传互补作用进行筛选 物理筛选鉴定法（电泳检测法；R-环检测法） 利用限制性内切核酸酶酶切进行鉴定 利用核酸杂交进行鉴定 利用PCR技术进行鉴定 利用免疫学方法进行筛选鉴定放射性抗体检测法；免疫沉淀检测法；酶联免疫吸附检测法 利用Western杂交进行鉴定 利用寡核苷酸序列测定进行鉴定 转译筛选鉴定法（阻断转译杂交法；释放转译杂交法）15、 几丁质酶具有抗真菌作用，设计实验获得几

31、丁质抗真菌植物基因序列已知 基因序列未知 设计引物（加合适限制性内切酶 获得基因序列 位点，保证阅读框不被破坏） 扩增基因、酶和Ti载体连接 （合适的启动子、终止子、筛选标记等） 筛选阳性克隆（抗药性、PCR、酶切、 测序）-E.coli 转化农杆菌、转入植物细胞 筛选转化细胞，验证、获得完整植株评价蛋白质工程1、 蛋白质工程的组成部分蛋白质工程主要包括以下两方面： 分子遗传学的相关理论与技术：完整的cDNA克隆技术、DNA序列的快速测定技术、DNA序列推测蛋白质序列的多维程序系统、原核生物及真核生物基因表达过程的调控、基因的定位诱变及随机诱变理论与技术 蛋白质结构功能相关的理论与技术：蛋白质

32、一级结构氨基酸序列的分析、X光单晶衍射结构分析技术、两维和三维核磁共振结构分析技术、蛋白质数据库的建立、蛋白质功能的酶学和免疫研究技术。2、 目的基因的定点突变的方法有哪些 寡核苷酸引物街道的定点突变 PCR介导的定点突变 盒式突变3、 易错PCR的原理，简述利用易错PCR进行酶分子进化的基本实验流程易错PCR：是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高Mg2+浓度、加入锰离子、改变体系中四种dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，未改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体第五章 细胞工程1、 何为细胞融合技术？诱

33、导细胞融合的方法有哪些？细胞融合技术：是利用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞，用于制造新的物种或品系（植物、微生物上用得多，动物上用得少）及产生单克隆抗体等的技术诱导细胞融合的方法：病毒诱导细胞融合、化学因子诱导的细胞融合、电融合方法、其他2、 影响微生物原生质体形成的因素有哪些？ 菌龄：微生物菌体的不同生长时期，表现的生理状况不同，不同生长时期的微生物细胞的细胞壁对脱壁促进剂的敏感程度可能会存在很大的不同。一般而言，对数期的菌体易被溶解酶脱壁，原生质体的生成效率最高 培养基成分；构巢曲霉生长于葡萄糖+盐的培养基菌丝比酵母膏培养基培养的菌丝有利于原生质体的形成，降低磷或增加螯

34、合剂也有利于原生质体的形成 培养方法也影响原生质体形成 酶的用量和处理时间也影响原生质体的形成 获得的原生质体要保存与核实的渗透环境3、 微生物原生质体如何制备？1) 亲本菌株的标记（如何将亲本菌株与杂种细胞有效地分离是原生质体融合技术中非常关键的一步）亲本的标记是否适于融合子的有效检出和融合子中优良性状的保持有很大关系。 营养缺陷型标记 抗药性标记 荧光标记 失活原生质体供体法2) 不同微生物细胞壁的消化一般采用溶菌酶处理就可达到细胞壁消化的目的。主要的细菌细胞壁溶解酶可分为两大类：作用与糖苷键的糖苷酶类和作用于酰胺部分和肽部分的酶。前者也称自溶素，在微生物的细胞自溶中起重要作用；后一类酶包

35、括了切开肽聚糖中肽段部分肽键的肽酶。4、 微生物细胞融合的基本步骤 微生物原生质体的制备 原生质体的再生（原生质体只有再生才能对其后代进行遗传鉴定， 而且再生率的高低，将直接影响原生质体融合育种的重组效果 原生质体的融合和杂合子的筛选5、 细胞系、细胞株、原代培养、细胞传代细胞系：原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系。如果传代有限，可称为有限细胞系；如可连续传代，则称为联系细胞系。细胞株：通过选择法或克隆从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称为细胞株。原代培养：从供体取得组织细胞后，在体外进行的首次培养（PPT）。以直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养称为原代培养。细胞

36、传代：当原代培养的细胞增值到一定程度时（一般标准是瓶底被细胞覆盖），这时需进行分离培养，细胞由原代培养瓶分离稀释后转到新的培养液的过程，称为传代。（PPT）无论稀释与否，将细胞从一个培养容器转移或移植到另一个培养容器即称为传代或传代培养。6、 植物细胞培养、外植体、愈伤组织、细胞全能性植物细胞培养：即植物细胞的体外培养，是指在无菌条件i啊，将植物细胞从机体内分离出来，在营养培养基上使其生存和生长的过程。利用细胞培养技术可以直接观察到生活细胞的形态和生长活动，并且将植物微生物化，在一定容积的反应器中得到大量的植物细胞。植物细胞培养主要依据是细胞的全能性，即植物体每一个分化的细胞在一定培养条件下具

37、有形成一个完整植株的潜在能力。再生的植物具有与母体植株基本相同的全套遗传信息。外植体：植物组织培养中，作为离体培养材料的器官或组织的片段统称为外植体愈伤组织：愈伤组织是由母体外植体组织的增生细胞产生的一团不定型的疏松排列的薄壁细胞。一般愈伤组织培养中没有明显的组织或器官的分化。细胞全能性：这是指植物体的每个细胞在离体条件下都具有诱导生长分化形成完整植株的潜在能力，这是由于每个细胞都有一套完整的基因组。细胞全能性是植物细胞核组织培养的主要依据。7、 植物细胞培养的营养要求和特点植物细胞生长所需营养成分与整个植物对营养的要求一样，通产更包括：无机盐、碳源、维生素、生长调节剂、氮源、核酸及其水解物和其他成分。应用最广的是MS和LS培养基，特别适于植株再生。 无机盐：钾、铵、钙、镁、磷、 碳源和能源：一般以蔗糖和葡萄糖为碳源 维生素：植物细胞培养需要硫胺素，如果加入烟