人牙龈成纤维细胞原代培养及鉴定

1、人牙龈成纤维细胞原代培养及鉴定摘要目的：分离培养人牙龈成纤维细胞，为进一步研究 细胞因子对牙龈成纤维细胞的调控作用提供实验条件。方法: 用组织块法培养人牙龈成纤维细胞，并进行形态学和免疫学 鉴定。结果:牙龈成纤维细胞原代培养成功并稳定传代，细胞 呈长梭形或星形，免疫学鉴定抗波形丝蛋白抗体阳性，抗角 蛋白抗体阴性，为中胚层来源的成纤维细胞。结论:组织块法 培养的细胞符合牙龈成纤维细胞的形态学和免疫学特征，可 作为体外细胞模型，为研究细胞因子对其功能的调控作用奠 定基础。关键词牙龈成纤维细胞；细胞培养;鉴定中图分类号r329. 2+8 文献标识码a 文章编 号1673-7210(2010)01 (

2、c)-026-02the primary culture and identification of human gingival fibroblastscui juanl, sun keqinl, li xial, zhang huaping2(1.oral medicine department of oral hospital of shanxi medical university, taiyuan 030001, china； 2. central laboratory of oral hospital of shanxi medical university, taiyuan 03

3、0001, china)abstract objective： to isolate and culture human gingival fibroblasts (hgfs) in vitro, and provide the experimental condition for further research on the hgfs regulation by cytokines methods： hgfs were primary cultured by tissue explant culture technique and identified by morphological a

4、nalysis and immunocytochemical analysis results： the hgfs were cultured and passaged successfully. the cells showed long spindle or star appearance by immunocytochemical analysis, these cells tested positive to anti-vimentin antibody and negative to anti-keratin antibody, indicating the cells were m

5、esoderm derived fibroblasts conclusion： the cells cultured by tissue explant culture technique are consistent with typical hgfs， characteristics of morphology and immunocytochemical observation. the hgfs are used as cell model in vitro for future research on hgfs regulation by cytokines.key words gi

6、ngival fibroblasts； cell culture； identification人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts, hgfs) 是牙龈结缔组织中的主体细胞，在牙周组织的保护和修复中 起重要作用1。许多学者利用牙龈成纤维细胞体外培养模 型，在牙周组织发病机制及治疗方面进行了有益的探索2。 原代培养是获取牙龈成纤维细胞的主要手段，目前有酶消化 法和组织块培养法3。本实验采用组织块法培养人牙龈成 纤维细胞，为进一步研究细胞因子对牙龈成纤维细胞的调控 作用提供实验条件。1材料与方法1. 1主要试剂和仪器dmem培养液（gibco,美国）；胎牛血清（

7、四季青,杭州）；胰 蛋白酶（sigma,美国）；抗波形丝蛋白抗体、抗角蛋白抗体、 免疫组化试剂盒、dab显色试剂盒（中杉金桥，北京）；25 ml 塑料培养瓶、六孔板（orange scientific,比利 时）:rc03000-7 c02培养箱（revco,美国）；gb- ii超净工作台 （北京市新技术应用研究所）；倒置显微镜（重庆光学仪器 厂）。1.2实验方法1. 2. 1组织来源牙龈组织取材于山西医科大学口腔医院口外科门诊因 正畸需拔牙或者因手术需切除牙龈且牙龈无炎症的患者，征 得其同意后切取牙龈组织，患者年龄1226岁。1.2.2组织块法培养及传代新鲜切取的牙龈组织立即投入预冷含双抗的

8、dmem培养 液中（含青霉素100 u/ml,链霉素100 ug/ml）,在超净工作 台中用5倍抗生素溶液浸泡消毒，在无菌培养皿中用眼科剪 将牙龈组织剪成1 mm3大小（剪切时在组织块上滴加dmem培 养液，且尽量去除上皮组织），用牙科探针将组织块以均匀间 距分散接种于25 ml培养瓶壁上,倒置培养瓶在c02培养箱 中（5% c02.95%空气,100%湿度，37°c恒温）孵育4 h后翻瓶, 加入dmem培养液。当细胞长至培养瓶底80%左右时，用0. 25% 胰酶消化，以1 ： 2或1 ： 3传代。1.2.3细胞的鉴定1.2. 3.1形态学鉴定倒置显微镜下观察细胞由组织块 边缘游出的

9、情况，观察细胞形态及传代后细胞生长状况。1.2. 3.2免疫学鉴定细胞传至4代，制成lx105/cm2的 细胞悬液，制备细胞爬片，按免疫组化试剂盒说明书及dab显 色步骤，分别进行抗波形丝蛋白抗体、抗角蛋白抗体染色，以 磷酸盐缓冲液（pbs）代替抗体作为阴性对照组，光镜下观察 染色结果。1.2.4细胞生长曲线取4代生长状态良好的牙龈成纤维细胞,0.25%胰酶消化 后，加入dmem培养液离心，将细胞稀释为1 x 1042x104/cm2, 接种于96孔板中，200 p1/孔，每24小时测定一板，每孔加 入20 ul mtt培养4 ho吸出上清加入150 u 1/孔dms0, 室温下振荡10 mi

10、n；490 nm处测定吸光度，绘制细胞生长曲 线。2结果2. 1细胞原代培养成功率本实验共接种10例牙龈组织，其中8例组织块周围有细 胞游出，游出时间为1015 d,接种的10例组织无一例污染,6 例在细胞游出30 d左右长满瓶底并传代成功，其他2例未在 30 d内长满瓶底且细胞有老化趋势,被淘汰，细胞培养成功率 为 60% o2.2细胞传代细胞单层长满瓶底80%可进行传代，用0. 25%胰蛋白酶消 化，不同形态的细胞对胰酶敏感性不同，成纤维样细胞几分 钟内即被胰酶从瓶壁上消化下来，以此可分离成纤维细胞和 上皮源性细胞，传代后贴壁良好，形态不发生改变，生长速度 加快，细胞长满单层，呈漩涡状、栅

11、栏状、放射状排列。2. 3细胞鉴定2. 3. 1形态学鉴定倒置显微镜下，原代及传代生长的细胞呈长梭形或星形, 核呈圆形或椭圆形,有数目不等、长短不同的胞质突，核仁清 晰可见，呈典型的成纤维样细胞形态。原代培养的细胞以组 织块为中心呈放射状生长，传代后的细胞呈放射状或漩涡状 走行，排列紧密，有极性。2. 3.2免疫学鉴定光镜下对细胞进行免疫组化染色观察，显示细胞抗波形 丝蛋白染色阳性，胞质内阳性颗粒均匀分布，胞核清晰、无染 色；抗角蛋白染色阴性，证明细胞为中胚层来源，且无上皮源 性细胞混杂。阴性对照组均未见阳性染色结果。2.4细胞生长曲线见图lo图lhgfs的生长曲线3讨论牙周病是发生在牙齿支持

12、组织（包括牙龈、牙周膜、牙 槽骨和牙骨质）的慢性非特异性感染性疾病，是导致成年人 失牙的主要原因4。随着老龄化社会的到来,牙周病尤其牙 周炎更将成为突出的保健问题，是学者研究的热点和难点。 广义上牙周病包括牙龈炎和牙周炎。牙龈炎是牙周炎的前驱 和首要症状，防治牙龈炎可有效防止牙周炎的发生及发展。 牙龈成纤维细胞是牙龈结缔组织中的主体细胞，不仅具有活 跃的自身更新能力，而且可合成胶原纤维、弹性纤维及基质5。已有报道牙龈成纤维细胞具有一定的潜在成骨能力，使 牙龈成纤维细胞有望成为牙周组织工程的种子细胞6-7 o 此外，牙龈成纤维细胞的体外培养成活率高于牙周膜成纤维 细胞，取材方便，创伤较小。因此，

13、体外建立牙龈成纤维细胞 模型有利于今后对牙周组织炎症机制和防治措施的进一步 研究。细胞原代培养目前有酶消化法和组织块培养法,本实验 利用组织块法，操作简便，污染率低，创伤小，成活率较高，进 一步证实组织块法是培养牙龈成纤维细胞的经典方法。通过 形态学和免疫学鉴定，细胞呈长梭形或星形，抗波形丝蛋白 抗体阳性，抗角蛋白抗体阴性，证明是中胚层非上皮来源细 胞，结合组织取材部位，证实本实验培养的是人牙龈成纤维 细胞。在传代培养过程中，由于操作和条件的限制，有时不能 完全去除上皮组织而混有上皮源性细胞，但两种细胞对胰酶 的敏感性不同，消化时间长短不同，因此可通过传代纯化成 纤维细胞3。细胞培养是进行多种

14、实验研究的基础，组织中分离的原 代细胞与体内细胞性状相似，较好地保存了细胞的遗传特征 和生物学特性8,又避免了体内研究所受的多因素干扰，使 实验结果更为可靠。但是体外培养的细胞反复传代性状有可 能发生改变。因此，体外培养的细胞要在稳定的状态下方可 进行实验。本实验通过对细胞的形态学观察及对绘制的细胞 生长曲线进行分析显示,36代牙龈成纤维细胞形态结构稳 定，生长状态良好，适于进行实验研究;8代以后细胞生长时 间延长，细胞形态改变，有融合老化趋势，不再适合进行实验研究。细胞培养的成功与否受到很多因素的影响，新鲜组织的消毒：尽量避免组织过多在外暴露及与其他有菌物品接触, 实验中应用一定浓度的抗生素

15、既防止污染又不影响细胞的 生长;减少影响接种时细胞贴壁的不利因素：接种4 h内应 尽量不移动培养瓶，而且接种时组织块的湿润程度要适 中；培养液胎牛血清的浓度：细胞从组织块游出过程中，培 养液中胎牛血清的浓度高，更利于细胞生长;无菌观念：操 作的全部过程都要谨慎保持无菌观念，使细胞生长良好。参考文献1 bartold pm, walsh lj, narayanan as, et al. molecular and cell biology of the gingival j periodontology,2000,24(1):28-55.2 刘斌，吴军正人牙龈成纤维细胞系的建立及生物学 特性j.牙体牙髓牙周病学杂志,1999,9(1):34-36.3 司徒振强，吴军正.细胞培养m.西安：世界图书出 版社,1996:65,71.4 0kuda k, kato t, ishihara k. involvement of periodontopathic biofilm in vascular diseases j oral diseases,2004,10(1)：512.5 hoang am, chen d, oates tw, et al. developmentand characterization of atransformed human periodontal ligame