脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验报告模板一

1、 医学微生物学实验报告 姓 名_ _ 学 号_ _ 年 级_ _ 组 别_ _实验名称脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验者合作者日期指导老师1、 实验目的1、掌握培养基的制备的原则和一般方法2、掌握细菌的分离培养方法3、掌握油镜的正确使用，细菌标本图片的制备4、掌握细菌的形革兰氏染色法以及形态学检查方法5、熟悉细菌的生化试验方法（糖发酵试验、抗菌素敏感性试验、血浆凝固酶实验、动力学实验）的原理及方法6、掌握玻片凝集试验的原理及方法二、实验器材1、5ml试管15支、托盘天平、锥形瓶、营养肉汤干粉培养基、量筒、使馆狂、酒精灯、洗耳球、刻度吸管2、脓汁标本1支，粪便标本1支、伊红美兰平板2个，营养琼脂

2、平板2个、接种环、酒精灯3、斜面4支、细菌分离培养物（上次实验平板）4、斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张5、斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，眼科镊子2把。6、半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。三、方法与步骤流程图：营养琼脂培养基的制备细菌的分离培养细菌的纯培养细菌形态学检查液体培养基接种细菌的生化实验1、 营养肉汤培养基的制备 称取1.1g营养肉汤干粉培养基于锥形瓶中，加入50ml蒸馏水溶解 加热煮沸1次，加热时需要摇动 分装于15支小试管

3、中，每支3ml 集中放在试管筐中，罩上硫酸纸和牛皮纸，用橡皮筋包扎好 灭菌2、细菌的分离培养平板画线法： 小组分工 ： 甲脓汁标本营养琼脂平板 丙粪便标本伊红美蓝平板 乙脓汁标本营养琼脂平板 丁粪便标本伊红美蓝平板 步骤： 点燃酒精灯，把接种环在酒精灯上烧灼灭菌，金属杆快速通过火焰23次，以杀灭表面微生物。 取出标本，在火焰旁边，左手斜持标本管下端，右手小指夹住试管棉塞上端，缓慢拔出棉塞并夹持之，管口迅速通过火焰3次 将冷却的接种环沾取标本1环，管口迅速通过火焰灭菌后塞上棉塞放回。 接种环与平板呈3040度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每

4、区划线不少于30条。画完第一区要烧掉接种环上多余的标本。 转动平板，转动平板，通过第一区57次，使接种环重新沾上少量细菌，同样的方法划过第二到五区，接种环呈递减次数地通过第二到第四区。 平板倒置，37培养1824h,观察结果。3、细菌的纯培养（斜面接种法）分工： 甲金黄, 乙白色。 丙紫黑, 丁粉红。步骤： 取制作的平板，在菌落分布最稀疏的区域，选择平板上典型的、容易挑取的单菌落。（从营养琼脂平板中分别选取金黄色菌落、白色菌落，从伊红美蓝平板上分别选出紫黑色菌落、粉红色菌落。） 接种环套住菌落，轻轻刮取细菌。 接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉一条细菌接种线。再伸入底部，自下向上，作蜿蜒

5、划线。 37培养24小时，观察结果。4、 细菌形态学检查（革兰氏染色法） 加样枪取盐水左3ul、右3ul,水滴间距小于2cm。 挑取菌苔少许（1mm小菌落的半量）与生理盐水混匀，涂成1cm2大小的均匀薄膜 涂毕，环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，将接种环通过火焰灭菌 涂片在室温干燥或烘干，手持玻片一端，标本面朝上，在火焰外层快速通过23次，将标本固定，促使菌体蛋白质凝固，固定在载玻片上，以免染色水洗的时候，细菌被水洗掉。 革兰染色：初染：结晶紫 初染1分钟水洗 媒染：卢戈碘液媒染1分钟水洗 脱色：95乙醇脱色约20秒钟水洗 复染：稀释品红复染1分钟水洗 吸干,镜检。5、 液体培养基接种 分组

6、：甲金黄 乙白色, 丙紫黑 丁粉红。 无菌操作，接种环斜面取菌，在靠近培养基液面管壁上，上下研磨接种。 在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。退出接种环，烧灼灭菌。6、细菌的生化实验（一）半固体穿刺接种法分工：甲紫黑, 乙紫黑； 丙粉红, 丁粉红。无菌操作，接种针斜面取菌，从半固体中心,垂直刺入，到达培养基底部5分之4处，再循原来的路线,退出接种针。管口、接种针经火焰烧灼灭菌。（二）细菌的糖发酵试验分工：甲紫黑葡萄糖 丙粉红葡萄糖 乙紫黑乳糖 丁粉红乳糖 用砂轮在糖发酵管液面上方23cm处，切割一道切痕。将管子打开，管口烧灼灭菌 接种针针尖斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。 管口朝向相

7、同，放置在平皿内。（三）抗菌素敏感性试验（纸片扩散法) 接种环取菌液35ul 2次,在平板培养基表面，拉出2条细菌接种线，使呈“十字形”(操作时，不得同时握持菌液管和平板，以免菌液倒出来，造成污染）。 平板密集划线接种细菌（纱窗样）。每次将平板旋转90°，保证菌液均匀分布。 设计三点，作标记：青、链、庆。呈等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。 镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，镊子火焰灭菌。 做标记，371824小时培养，观察结果。（四）血浆凝固酶试验 兔血清+白色和黄色 取2滴兔血浆置于洁净的玻片上。 分别用接种环取白色和黄色菌苔(约23个菌落的菌量

8、)与血浆研磨混合，立即观察结果。 菌液出现明显凝块者为阳性，否则为阴性。7、细菌的血清学试验（玻片凝集试验） 取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul 用接种环分别取粉红色菌苔，约2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀，涂抹展开。 载玻片来回倾侧，让菌液充分混匀，凝集速度更快、结果更清楚。 菌液凝集者记为阳性，菌液均匀混浊记为阴性四、结果与讨论1、营养肉汤培养基的制备图1：营养肉汤培养基的制备图2.2丙，丁粪便标本伊红美蓝平板图2.1甲，乙脓汁标本营养琼脂平板2细菌的分离培养平板画线法：结果观察：1、由实验结果图可看

9、出，脓汁标本在普通平板上有金黄色、白色两种菌落，菌落直径约2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、不透明。2、粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、粉红色两种菌落，颜色不是细菌本身的颜色，其中紫黑色菌落较大较明显，且形成紫黑色具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落。讨论：1、 粪便标本在伊红美蓝平板上，颜色的产生是因为大肠埃希菌分解乳糖产酸，酸使伊红与美蓝结合，形成紫黑色具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落。2、 从四张平板画线的结果上来看，第三张图分离效果很好，得到的菌落典型。而其他三张均有不足。第一二张脓汁的营养琼脂平板，前面两区涂抹太密集，而板的其他部位未充分利用，得不到十分明显的菌落。

10、第四张粪便的平板第一区太稀疏，未充分利用平板，故在培养后未见到数量较少的粉红菌落，原因是划线时不熟练，不能连续划线。3、 细菌的纯培养（斜面接种法）图3.1斜面接种产物（右左向右依次为金黄，白色粉红，紫黑菌苔)结果观察与讨论：1、 从普通平板上挑取的金黄色和白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，仍然呈金黄色和白色。2、从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、半透明。4、细菌形态学检查（革兰氏染色法）图4.1脓汁菌苔（左边为白色菌苔，右图为金黄色菌苔）图4.2粪便菌苔（左图为粉红菌苔，右图为紫黑色菌苔）结果观察与讨论：1、从脓汁标本中

11、分离得到金黄色、白色两种菌落，显微镜油镜下呈紫色为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。2、从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。显微镜油镜下呈粉红色为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。5、液体培养基接种图5液体培养基接种结果6、细菌的生化实验（一）半固体穿刺接种法图6.1（照片拍摄不明显）结果观察及讨论： 表1.动力试验结果 菌苔 半固体 紫黑细菌1 + 紫黑细菌2 - 粉红细菌1 - 粉红细菌2 -+：阳性 -：阴性1、 紫黑细菌1细菌自接种部位向四周移动、扩散生长，培养基呈云雾状或根须状混浊状态，有

12、鞭毛。但是实验时发现紫黑菌苔2无任何现象。经过分析，应当是用接种针取菌苔时，操作者仅针尖前部接触了少量菌苔，导致穿刺后无细菌的生长。但是结合其他组的结果，我们认为紫黑菌苔应当是动力阳性的。2、 粉红细菌菌苔均沿着直线生长，可看出其无鞭毛。（二）细菌的糖发酵试验图6.2.从左至右分别为：（粉红乳糖粉红葡萄糖 紫黑乳糖 紫黑葡萄糖）结果观察与讨论:1、 实验结果记录为下表：葡萄糖 乳糖 葡萄糖 乳糖 + -+：产酸或阳性 ：产酸产气 -：阴性2、 紫黑细菌微型发酵关内液体变黄，产生气泡，气泡的高度分别为10mm和17mm，说明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，产酸产气；粉红细菌只分解葡萄糖，不产气

13、，不分解乳糖。（3） 抗菌素敏感性试验（纸片扩散法) 图6.3结果观察与讨论：1、 表3各菌抑菌圈直径（mm）表 菌苔 青霉素 头孢曲松 庆大霉素 金黄色 42 25 30 白色 30 22 40 紫黑 37 26 粉红 36 282、 表4.药敏试验结果分析 青霉素 头孢曲松 庆大霉素 金黄色 + + + 白色 + ± + 紫黑 - + + 粉红 - + +-：耐药 ±：中度敏感 +：敏感3、G+球菌对青霉素和头孢曲松敏感。 4、G-杆菌对青霉素耐药，对头孢曲松敏感。5、G+球菌和G-杆菌对广谱抗菌素庆大霉素都敏感。（四）血浆凝固酶试验图6.4白色（右）与金黄色（左）菌苔

14、结果观察与讨论：1、黄色菌苔能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白,附着于菌体表面,形成凝块，涂抹不开。说明黄色细菌为致病菌。2、白色菌苔不发生凝块，容易涂抹。呈均匀乳白状态。7、细菌的血清学试验（玻片凝集试验）图6.5粉红菌苔（右）凝集结果（左侧为对照）结果观察与讨论：1、由实验结果图可看到，生理盐水一端不出现凝集，福氏志贺菌诊断血清一端菌液浑浊，少量絮状，为阳性。说明粉红菌为福氏志贺菌。2、根据糖发酵试验和半固体动力试验结果结合肠道杆菌科各菌属生化反应鉴别表分析： 表4：肠道杆菌科各菌属生化反应鉴别表葡萄糖 乳糖 麦芽糖 甘露醇 蔗糖 半固体埃希菌属 +志贺菌属 +

15、+/- -/+ -沙门菌属 /+ - - + 霍乱弧菌 + - + + + +变形杆菌属 - - +注： + 产酸或阳性， 产酸产气，- 阴性，综合上述分析可确定：粉红色菌落属于志贺菌属，紫黑色菌落是大肠埃希菌，白色菌落为白色葡萄球菌，金黄色菌落为具有致病性的金黄色葡萄球菌。但不可以确定粉红色菌落属于志贺属的哪一种。五、总结1，在革兰染色法和镜检观察后，可以得出金黄色和白色细菌都是G+菌，且都为葡萄球菌，可初步判定他们分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。血浆凝集实验可得出金黄色葡萄球菌为致病菌。通过抗生素敏感实验可得出这两种细菌对青霉素、庆大霉素、头孢曲松都敏感，其中青霉素对金黄色葡萄球菌最敏感。2. 在革兰染色和镜检观察后可得出紫黑色和粉红色为G-杆菌，但不能确定它们为哪种细菌；糖发酵试验中紫黑色对葡萄糖产酸产气，对乳糖产酸产气；粉红色对葡萄糖产酸不产