血管组织工程PPT课件

1、 目录 1 绪论 2 支架材料 3 种子细胞 4 生长因子的引入 5 生物反应器 6 展望第1页/共47页 1、绪论u 组织工程学（tissue engineering）是一门工程学与生命科学相结合的边缘科学，是在体外构建具有生物活性的生物替代物，用于替代、修复或改善人体各种组织器官形态和功能。u 基本原理： 种子细胞 生物反应器 细胞-生物材料复合物 植入人体 支架材料 第2页/共47页 u 组织工程化血管是利用组织工程学方法，用血管种子细胞(内皮细胞，平滑肌细胞)与相关细胞外基质(支架材料)复合，以构建从形态到功能都接近活体血管的组织工程化血管。 第3页/共47页 组织工程血管应具备以下条

2、件：u 具有或模拟体内血管壁三层结构u 具有生物相容性，不易产生血栓，不易发生免疫排斥反应u 具有生物学特性，如对药物刺激有收缩性u 具有血管的力学特性，即有粘弹性并能承受一定的压力第4页/共47页u 1986年，Weinberg CBWeinberg CB等最早应用自体来源的平滑肌细胞、成纤维细胞、等最早应用自体来源的平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞构建了复合的组织工程化血管，但血管强度无法满足回植要求内皮细胞构建了复合的组织工程化血管，但血管强度无法满足回植要求uL heureux等人在 vitamin C存在条件下, 通过培养间充质细胞(平滑肌细胞和成纤维细胞)提高了移植物的机械强度,

3、构建了一个具有类似生理血管的脱细胞基质(脱细胞基质是成人皮肤的脱水产物)。第5页/共47页uNikalson等在血流条件下在聚合物管道上构建血管uNiklason 等注意到在类似活体内或者能够经历自然形成阶段等外环境条件下能够更好的形成血管移植物第6页/共47页 Hemothes膨体聚四氟乙烯人工血管 第7页/共47页第8页/共47页 2、支架材料 天然材料 支架材料 人工合成材料 复合材料第9页/共47页 2.1 天然材料u 天然生物降解材料是指来源于动植物或人体内天然存在的可生物降解的大分子。u 应用于组织工程血管研究的天然生物材料包括甲壳素、葡聚糖明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、多聚氨基酸、多

4、肽、透明质酸及其复合物、某些组织的脱细胞基质等。第10页/共47页 优点 u本身包含许多生物信息，能够提供细胞所需的信号u与细胞亲和性强，能为细胞提供近似体内的发生发育的细胞外基质支架条件，能使细胞聚集成组织，控制组织结构，调节细胞表型u极低的免疫排斥反应，良好的顺应性 第11页/共47页u现在应用较多的脱细胞血管基质材料均富含胶原，保持着胶原纤维、弹性蛋白等结构蛋白的构象和原有的排列分布，力学性能及强度与脱细胞前相似。u胶原支架用碳胶原支架用碳- -二酰亚氨交联后，抗降解能力增强。种植成纤维细胞时细胞黏附、二酰亚氨交联后，抗降解能力增强。种植成纤维细胞时细胞黏附、增殖能力强。增殖能力强。第1

5、2页/共47页 脱细胞基质支架材料脱细胞基质支架材料 u 动物体内多种纤维组织（心包膜、筋膜等）动物体内多种纤维组织（心包膜、筋膜等）u 内脏平滑肌器官内脏平滑肌器官 u 小肠黏膜下层小肠黏膜下层( (small intestinal small intestinal submucosa,SISsubmucosa,SIS) )第13页/共47页第14页/共47页 2.2 人工合成高分子生物材料 优点 u可预先设计和调控，降解完全，可避免异物刺激所引起的不良反应可预先设计和调控，降解完全，可避免异物刺激所引起的不良反应u生产重复性好，可大批量生产生产重复性好，可大批量生产 第15页/共47页 缺

6、点u缺乏生物信号和功能基团，与种子细胞的黏附性较差缺乏生物信号和功能基团，与种子细胞的黏附性较差 u在材料降解过程中，会产生一些酸性物质，对局部会产生一定的影响在材料降解过程中，会产生一些酸性物质，对局部会产生一定的影响第16页/共47页 u血管组织工程应用的人工合成可降解材料有聚羟基乙酸血管组织工程应用的人工合成可降解材料有聚羟基乙酸(PGA),(PGA),聚乳酸聚乳酸(PLA),(PLA),聚聚L-L-乳酸乳酸(PLLA)(PLLA)及上述材料的共聚物及上述材料的共聚物(PLGA),(PLGA),聚羟基烷酸酯聚羟基烷酸酯(PHA)(PHA)、聚、聚-4-4-羟基丁羟基丁酸酸(P4HB) (

7、P4HB) 等。其中作为血管支架材料应用最多的是等。其中作为血管支架材料应用最多的是PGAPGA和和PLGAPLGA。第17页/共47页 uPGAPGA的吸收和代谢机制已经明确并具有可靠的生物安全性，但的吸收和代谢机制已经明确并具有可靠的生物安全性，但PGAPGA降解速度过降解速度过快快 u最典型的共聚物是羟基乙酸最典型的共聚物是羟基乙酸(GA)(GA)和乳酸和乳酸(LA)(LA)形成的无规则共聚物形成的无规则共聚物- -聚乳酸聚聚乳酸聚羟基乙酸羟基乙酸(PLGA)(PLGA)。PLGAPLGA共聚物的降解速度可根据需要通过调整两种单体的比共聚物的降解速度可根据需要通过调整两种单体的比例来加以

8、控制。例来加以控制。第18页/共47页PGA血管支架（胶原包埋）第19页/共47页u 聚乳酸聚乳酸(PLA)(PLA) 优点：无毒害作用优点：无毒害作用 缺点：缺乏良好细胞亲和性能缺点：缺乏良好细胞亲和性能u 聚聚 - -己内酯己内酯(PCL)(PCL) 具有良好的亲水性具有良好的亲水性第20页/共47页 2.3 复合材料u人工合成材料的优点是它们的强度、降解速人工合成材料的优点是它们的强度、降解速度、微结构和渗透性均可在生产过程中进行控度、微结构和渗透性均可在生产过程中进行控制制u天然材料的优点则在于包含有生物信息天然材料的优点则在于包含有生物信息( (如特如特殊的氨基酸序列殊的氨基酸序列)

9、 )，可促进细胞吸附或使细胞，可促进细胞吸附或使细胞保留分化功能保留分化功能u通过合成材料与天然可降解高分子材料复合，通过合成材料与天然可降解高分子材料复合，可以在保持支架材料的力学强度及降解行为不可以在保持支架材料的力学强度及降解行为不变的前提下，获得具有生物活性的表面变的前提下，获得具有生物活性的表面第21页/共47页 3 种子细胞 正常的血管壁有内膜、中膜、外膜构成。 内皮细胞（单层） 内膜 内皮下层 平滑肌细胞（多层环形排列） 中膜 细胞外基质 外层 疏松结缔组织 第22页/共47页 u 内皮细胞和平滑肌细胞是血管的重要组成成分，因此是组织工程化血管种子细胞的主要研究内容u目前用于构建

10、组织工程血管的种子细胞主要分自体血管壁细胞和干细胞两大类目前用于构建组织工程血管的种子细胞主要分自体血管壁细胞和干细胞两大类第23页/共47页3.1 自体血管壁细胞 3.1.1 静脉内皮细胞u从体内非必须血管或者人脐静脉内皮，一般采用从体内非必须血管或者人脐静脉内皮，一般采用酶消化法酶消化法u静脉内皮获取的方法已经成熟，但是在体外培养中容易老化，表型和功能容易静脉内皮获取的方法已经成熟，但是在体外培养中容易老化，表型和功能容易丢失，细胞增殖能力和活性等因人而异，而且，体外培养扩增的时间较长，难丢失，细胞增殖能力和活性等因人而异，而且，体外培养扩增的时间较长，难以达到血管构建种子细胞的要求以达到

11、血管构建种子细胞的要求第24页/共47页 3.1.2 血管平滑肌细胞 u 取材时损伤较大取材时损伤较大u 伤口容易感染伤口容易感染u 获得的细胞在体外培养下容易丧失平滑肌获得的细胞在体外培养下容易丧失平滑肌 细胞表型细胞表型u容易衰老容易衰老第25页/共47页3.2 干细胞（Stem cells）u 干细胞具有能自我复制、多向分化的潜能，且增殖能力强，具有稳定传代的功干细胞具有能自我复制、多向分化的潜能，且增殖能力强，具有稳定传代的功能。因此成为理想的组织工程种子细胞。能。因此成为理想的组织工程种子细胞。 胚胎干细胞胚胎干细胞u干细胞干细胞 内皮祖细胞内皮祖细胞 成体干细胞成体干细胞 骨髓间充

12、质干细胞骨髓间充质干细胞第26页/共47页第27页/共47页3.2.1 胚胎干细胞（Embryo stem cells,ESCs）u 胚胎干细胞存在于哺乳动物发育的早期，是指由胚胎内细胞团或原始生殖细胞胚胎干细胞存在于哺乳动物发育的早期，是指由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外抑制培养而筛选出的细胞经体外抑制培养而筛选出的细胞u具有具有“发育全能性发育全能性”，还具有持续增殖而不分化的能力，还具有持续增殖而不分化的能力 第28页/共47页3.2.2 成体干细胞u成体干细胞按照其来源和分化方向的不同可以分为造血干细胞、骨髓间充质干成体干细胞按照其来源和分化方向的不同可以分为造血干细胞、骨髓间充质干

13、细胞、内皮祖细胞、神经干细胞、表皮干细胞、脂肪干细胞等，适用于组织工细胞、内皮祖细胞、神经干细胞、表皮干细胞、脂肪干细胞等，适用于组织工程血管构建的有程血管构建的有内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞 u自体移植的成体干细胞可以避免免疫排斥的问题，分离使用成体干细胞不存在自体移植的成体干细胞可以避免免疫排斥的问题，分离使用成体干细胞不存在伦理社会问题伦理社会问题第29页/共47页3.2.2.1 内皮祖细胞内皮祖细胞( (EPCsEPCs，endothelial progenitor cellsendothelial progenitor cells）uEPCs是一群是一群C

14、D34+的细胞，最早由的细胞，最早由Asahara等从人外周血中分离得到，在体等从人外周血中分离得到，在体外可以诱导分化为内皮细胞，参与了新生血管的形成。外可以诱导分化为内皮细胞，参与了新生血管的形成。EPCs具有和造血干细胞具有和造血干细胞一些共表达的标志，如一些共表达的标志，如:flk-1，Tie-2等，认为二者都源自成血管祖细胞。等，认为二者都源自成血管祖细胞。第30页/共47页u优点：优点：EPCs具有容易获得和很强的增殖能力具有容易获得和很强的增殖能力u缺点：缺点： 1.体外扩增培养时间较长体外扩增培养时间较长 2.关于关于EPCs本身的特殊标志，来源较少本身的特殊标志，来源较少“不

15、稳定不稳定”，有效的分离聚集，有效的分离聚集办法等都还在摸索阶段，而且在一些特定的病理条件下办法等都还在摸索阶段，而且在一些特定的病理条件下“其表型会发生改变其表型会发生改变”， 3.生物学活性下降生物学活性下降第31页/共47页光镜下的细胞学形态A :刚分离的单个核细胞,细胞呈小圆( 40) ;B :培养4 d后的内皮祖细胞细胞变大、 透亮度增强、 出现梭形细胞( 40) ;C:培养7 d后的内皮祖细胞细胞数量增多,有较多的小杆形细胞和梭形细胞( 40) ;D :培养 7 d 后的细胞团呈集落样生长( 10) -方叶青.外周血内皮祖细胞分离和培养的试验研究 第32页/共47页 3.2.2.2

16、 骨髓间充质干细胞（BMSCs,bone marrow mesenchymal stem cells）u间充质细胞间充质细胞(MSC)(MSC)最初是由最初是由Friedenstein发现发现的一类易贴附于塑料培养板表面的细胞。在机体的一类易贴附于塑料培养板表面的细胞。在机体内内MSCMSC存在于许多组织中，尤以骨髓中最多，简存在于许多组织中，尤以骨髓中最多，简单的骨髓穿刺即可获得，不存在组织配型及免疫单的骨髓穿刺即可获得，不存在组织配型及免疫排斥问题，理论上能分化为所有的间充质组织类排斥问题，理论上能分化为所有的间充质组织类型，如型，如: :软骨、脂肪、肌肉及肌健等。软骨、脂肪、肌肉及肌健等

17、。 第33页/共47页u 有研究表明，骨髓间充质干细胞在体外能够分化为血管平滑肌细胞。有文有研究表明，骨髓间充质干细胞在体外能够分化为血管平滑肌细胞。有文献报道，在血管损伤修复的过程中，骨髓间充质干细胞参与了血管平滑肌献报道，在血管损伤修复的过程中，骨髓间充质干细胞参与了血管平滑肌层的重建过程。这些为层的重建过程。这些为BMSCsBMSCs诱导分化为血管平滑肌细胞提供了依据，为组诱导分化为血管平滑肌细胞提供了依据，为组织工程血管平滑肌种子细胞提供了选择的可能。织工程血管平滑肌种子细胞提供了选择的可能。第34页/共47页4 生长因子的引入u 动物体中存在着大量对于细胞生长、分化、代谢、凋亡进行调

18、控的生长因子动物体中存在着大量对于细胞生长、分化、代谢、凋亡进行调控的生长因子( (growth factor) )，这些因子对于组织器官正常功能的维持起着至关重要的作，这些因子对于组织器官正常功能的维持起着至关重要的作用用u常用的生长因子有成纤维细胞生长因子常用的生长因子有成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子、转化生长因子(TGF-)、胰岛素、胰岛素样生长因子样生长因子(IGF)、血小板衍化生长因子、血小板衍化生长因子(PDGF)、骨形态发生蛋白、骨形态发生蛋白(BMP)等。等。第35页/共47页第36页/共47页 在人工合成的高分子和大部分天然高分子材料中，缺乏这些生长因子或者在人工

19、合成的高分子和大部分天然高分子材料中，缺乏这些生长因子或者这些生长因子大部分在材料制备过程中遭到了破坏。因此，将生长因子负载到这些生长因子大部分在材料制备过程中遭到了破坏。因此，将生长因子负载到组织工程支架上，也是越来越被关注的问题。组织工程支架上，也是越来越被关注的问题。第37页/共47页 u在材料中引人生长因子、黏附因子等，可以对细胞生长、分化、增殖起到促进在材料中引人生长因子、黏附因子等，可以对细胞生长、分化、增殖起到促进作用作用 u在此基础上，可以将表达生长因子的基因片断负载到支架上进行基因治疗在此基础上，可以将表达生长因子的基因片断负载到支架上进行基因治疗 第38页/共47页5 生物反应器u 生物反应器是指对微生物/动物细胞培养环境和运行参数（如：PH值、温度、压力、营养的供给和废物的移出）进行监测和调控的一种装置。 第39页/共47页 类型u搅拌式生物反应器 u旋转壁式生物反应器u中空纤维生物反应器 u灌流式生物反应器第40页/共47页 血管生物