第四章补充—沉淀分离与结晶

1、 通过改变溶液条件，使溶质的溶解度降通过改变溶液条件，使溶质的溶解度降低而以固体形式从溶液中分离出的一种低而以固体形式从溶液中分离出的一种操作技术。操作技术。 盐析法盐析法 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法等电点沉淀法 结晶法结晶法2定义：盐析法是利用各种生物定义：盐析法是利用各种生物分子分子在浓盐溶液中溶解度的在浓盐溶液中溶解度的差异差异，通过向溶液中引入一，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使定数量的中性盐，使目的物目的物或或杂蛋白杂蛋白以沉淀以沉淀析出析出，达到，达到纯化目的的方法。纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高，要除盐缺点

2、：分辨率不高，要除盐3两种现象：两种现象：盐溶盐溶：低盐情况，盐离：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白子强度的增高，蛋白质溶解度增大质溶解度增大盐析盐析：高盐，盐离子强：高盐，盐离子强度增加，蛋白质度增加，蛋白质溶解溶解度减小度减小42.52.01.51.00.50-0.5-1.0-1.51 2 3 4 5 6logSS0蛋白质盐析 向蛋白质溶液中加入一定浓度的无机盐(NH4)2SO4或Na2SO4溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。这样析出的蛋白质仍可以溶解在水中，而不影响原来蛋白质的性质。因此，盐析是一个可逆的过程。利用这个性质，可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白

3、质。 蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。 蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。 由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏

4、，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。 盐析法简单方便，可用于蛋白质抗原的粗提、丙种球蛋白的提取、蛋白质的浓缩等。盐析法提纯的抗原浓度不高，只用于抗原的初步纯化。81.形成形成离子对离子对，部分中和了蛋白质的电性，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。2.中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了去了水化膜水化膜，使其沉淀。，使其沉淀。9loglogS S= = - -K Ks s S S蛋白质溶解度蛋白质溶解度，g/Lg/L； 盐离子强度盐离子强度, , C Ci ii i离子浓度，离子浓度，

5、mol/Lmol/L；Z Zi ii i离子化合价；离子化合价； 常数常数, ,为纵坐标上的截距为纵坐标上的截距; ;K Ks s盐析常数盐析常数。102.52.01.51.00.50-0.5-1.0-1.51 2 3 4 5 6logSS0 、 K KS S 是外推截距是外推截距 KSKS是盐析常数是盐析常数KsKs盐析法盐析法盐析法盐析法11（一）、无机盐的种类（一）、无机盐的种类 盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子高价阴离子更为明显。更为明显。 PO4

6、3-SO42CH3COOClNO3I NH4+K+Na+Li+ 盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵12血 纤 维蛋 白 原碳 氧 血红 蛋 白血 清 白蛋 白拟 球 蛋 白碳 氧 肌红 蛋 白0.500-0.50-1.000 2 4 6 8 10log S1314-d dSP10987654321040 50 60 70 80P30g/L 3g/L 温度的变化会影响温度的变化会影响 值。值。 在无盐或稀盐溶液中，在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，随温度升高而增大的，但在但在高盐溶液中常相反高盐溶液中常相反15210

7、log S2 3 4 250pH6.616卵清蛋白碳氧血红蛋白765432103 4 5 6 7 8pH(六六) 盐的饱和度盐的饱和度 不同蛋白质的盐析要求的盐的饱和度不一样； 分段盐析法。18192021 222324一、基本原理一、基本原理2526（一）有机溶剂种类及用量（一）有机溶剂种类及用量 常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。 （二）（二）pHpH的影响的影响 许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低，溶液许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低，溶液pHpH应在应在等电点附近等电点附近，还须考虑蛋白质的稳定性。，还须考虑蛋白质的稳定性。27（三）温度（三）温度（低温

8、沉淀低温沉淀） 有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著地减小。度随温度降低而显著地减小。（四）无机盐的含量（四）无机盐的含量 低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变性。防止变性。 高盐高盐：增大蛋白质在有机溶剂：增大蛋白质在有机溶剂水溶液水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。中的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。2829（五）某些金属离子的助沉淀作用（五）某些金属离子的助沉淀作用（六）样品浓度（六）样品浓度303132蛋白质等电点沉淀 在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时

9、蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤。34二、成盐沉淀法二、成盐沉淀法353637吸附人造沸石盐析45%饱和硫酸铵沉淀TCA透析383940酸性酸性多糖多糖414243 结晶的方法一般有2种：一种是蒸发溶剂法，它适用于温度对溶解度影响不大的物质。沿海地区“晒盐”就是利用的这种方法。另一种是冷却热饱和溶液法。此法适用于温度升高，溶解度也增加的物质。如北方地区的盐湖，夏天温度高，湖面上无晶体出现；每到冬

10、季，气温降低，石碱(Na2CO310H2O)、芒硝(Na2SO4 10H2O)等物质就从盐湖里析出来。在实验室里为获得较大的完整晶体，常使用缓慢降低温度，减慢结晶速率的方法。 晶体在一定条件下所形成的特定晶形，称为晶习。向溶液添加或自溶液中除去某种物质(称为晶习改变剂)可以改变晶习，使所得晶体具有另一种形状。这对工业结晶有一定的意义。晶习改变剂通常是一些表面活性物质以及金属或非金属离子。指溶质自动从指溶质自动从过饱和溶液过饱和溶液中析出形成新相的过程中析出形成新相的过程。 C C2 2 小晶体的溶解度小晶体的溶解度；C C1 1 普通晶体的溶解度；普通晶体的溶解度； 晶体密度；晶体密度；M M

11、 晶体质量；晶体质量； 晶体与溶液间的界面张力；晶体与溶液间的界面张力； 2 2 小晶体的半径小晶体的半径； 1 1 普通晶体的半径；普通晶体的半径；46)11(2ln1212rrRTMCC47 晶核生成（成核）和晶体生长两个阶段，两个阶段的推动力都是溶液的过饱和度（溶液中溶质的浓度超过其饱和溶解度之值）。晶核的生成有三种形式：即初级均相成核、初级非均相成核及二次成核。在高过饱和度下，溶液自发地生成晶核的过程，称为初级均相成核；溶液在外来物（如大气中的微尘）的诱导下生成晶核的过程，称为初级非均相成核；而在含有溶质晶体的溶液中的成核过程，称为二次成核。二次成核也属于非均相成核过程，它是在晶体之间或晶体与其他固体（器壁、搅拌器等）碰撞时所产生的微小晶粒的诱导下发生的。4950515253545556575859（二）、晶体形状（二）、晶体形状 改变晶体外形，可用改变晶体外形，可用: :选择不同的溶剂、选择不同的溶剂、控控制过饱和度、制过饱和度、结晶温度结晶温度、调节溶液的、调节溶液的pHpH和有和有目的地加入某种能改变晶形的杂质等。目的地加入某种能改变晶形的杂质等。 （三）、晶体纯度（三）、晶体纯度 由于由于晶体表面具有一定的物理吸附能力晶体表面具有一定的物理吸附能力，因此表面上有很多母液和杂质黏附在晶体上。因此表面上有很