生物化学实验讲义(最后修改版)

1、-作者xxxx-日期xxxx生物化学实验讲义(最后修改版)【精品文档】生物化学实验讲义生物工程教研室2007. 1实验学时数：32 课程类别：基础课应开实验项目数：8 开课学期：5面向专业：生物工程专业 考核办法：考查实验教材名称：生物化学实验讲义（自编）制定大纲的依据：专业方向及生物化学教学大纲实验课教学目标：验证及巩固课堂基本理论知识，培养学生动手能力和分析问题能力。实验教学基本要求：了解实验目的、原理、方法、步骤、设备结构及仪器的使用方法；要求学生具备对新实验的基本设计能力，准确测定和读取数据，整理数据，最后得出正确的结论。应开实验项目情况实验项目名称计划学时数实验目的、要求每组人数同开

2、组数实验要求实验现状实验性质主要仪器设备双缩脲法测定蛋白质含量4掌握双缩脲法测定蛋白质含量原理和方法；学好使用722型分光光度计，了解仪器基本原理132必开已开验证722型分光光度计（8台）血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳4掌握醋酸纤维素薄膜电泳的实验原理及操作方法；学习电泳仪、电泳槽的使用方法132必开已开验证电泳仪、电泳槽（8套）酶的特异性2了解酶的特异性；掌握检查酶特异的方法和原理132必开已开验证恒温水浴槽（8）离心机（6）pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响2掌握测定酶性质的方法和原理132必开已开验证恒温水浴槽（8）离心机（6）核酸的水解及组成成分的鉴定4掌握核酸的一种水解方法和原理；学习

3、测定核酸的组成成分132必开已开验证恒温水浴槽（8）可调节电炉（8）包埋法固定化酵母细胞4学习和掌握包埋法固定化酵母细胞216必开待开验证电泳仪、电泳槽（8套）维生素C的定量测定（磷钼酸法）4学习掌握维生素C测定方法216必开待开验证722型分光光度计（8台）燕麦水解蛋白的制备和理化性质测定香菇多糖的提取和理化性质测定（二选一）8学习水解蛋白的制备过程及水解蛋白理化性质测定方法学习多糖的提取方发及多糖理化性质的测定方法48必开待开综合GPC高效凝胶色谱分析仪（1台）水浴锅（8个）722型分光光度计（8台）恒温摇床（8台）离心机（4个）目录实验一 双缩脲法测蛋白质含量4实验二 血清蛋白醋酸纤维素

4、薄膜电泳6实验三 酶的特异性（专一性）9实验四 激活剂、抑制剂、pH、温度对酶活性的影响 11实验五 酵母核糖核酸的水解及其组成成分的鉴定 15实验六 包埋法固定化酵母细胞17实验七 维生素C的定量测定（磷钼酸法） 19实验八 综合设计实验（二选一） 21实验一：双缩脲法测蛋白质含量一、 实验目的了解并掌握双缩脲法测蛋白质浓度的原理和方法二、 实验原理具有两个或两个以上肽键（-CO-NH-）的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与形成紫色配合物，此反应和两个尿素分子缩合后生成的双脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红

5、色络合物在540nm处有最大吸收。在一定浓度范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈色反应，但离子容易被还原，有时会出现红色沉淀。三、 实验器材1 试管×15cm 8支。2 试管架：1个3 吸量管：5.0ml 3支、2.0ml 1支、 1.0ml 1支。4 S22pc型分光光度计。四、 实验试剂1 双缩脲试剂：溶解硫酸铜（）和酒石酸钾钠（）于500毫升水中，在搅拌下加入300毫升10氢氧化钠溶液，用水稀释到1升，贮存在内壁涂以石蜡的瓶中。此试剂可以长期保存，以备使用。 2 标准牛血清蛋白溶

6、液：牛血清蛋白溶液浓度为5mg/ml,用0.05N(2g氢氧化钠溶于1升水中)氢氧化钠溶液配置.3 未知液：可用酪蛋白配制，5mg/ml。五、 实验操作1标准曲线的绘制取干净试管6支，分别加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0毫升的标准蛋白溶液（牛血清蛋白溶液），用水补足到2毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂，在室温下（1525）放置30分钟，于540nm波长下用分光光度计比色测定。最后以吸光度为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标准曲线,作为定量的依据。未知样品蛋白质浓度的测定2吸取1毫升待测液，用水补足到2毫升，操作同前，平行做两份，于标准曲线的各管同时比色，比色后以标准曲线中查出其蛋白质浓

7、度。附录：表1 绘制标准曲线编号123456加入蛋白质的量，ml0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 加入水的量,ml2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 浓度,mg/ml0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 双缩脲试剂，ml4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 吸光度参考资料：1陈钧辉，陶力，李俊等·生物化学实验·第三版·北京：科学出版社，2003.4(21世纪高等院校教材)：58六 思考题1如何选择未知样品的用量？2为什么作为标准的蛋白质必须用凯氏定氮法测定纯度？3对于作为标准的蛋白质应有什么要求？实验二：血清蛋白醋酸纤

8、维素薄膜电泳一、 实验目的1、掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作2、定量测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量二、 实验原理 采用醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素，是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸脂。将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸、乙脂等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120微米。醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术。它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。目前，醋

9、酸纤维素薄膜电泳趋向于代替纸电泳。三、 实验试剂和器材1 实验试剂（1）新鲜血清无溶血现象（2）巴比妥巴比妥钠缓冲液（PH8.6,离子强度0.06）：称取巴比妥和巴比妥钠，溶入少量蒸馏水后定容1000毫升。（3）染色液：称取氨基黑1OB，加入蒸馏水40毫升，甲醇50毫升和冰乙酸10毫升，混匀，在具塞试剂瓶内贮存。（4）漂洗液：取95乙醇45毫升，冰乙酸5毫升和蒸馏水50毫升，混匀，在具塞试剂瓶内贮存。（5）透明液：甲液取冰乙酸15毫升和无水乙酸85毫升，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。乙液取冰乙酸25毫升和无水乙酸75毫升，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。（6）0.4N氢氧化钠溶液：称

10、取16克氢氧化钠（分析纯）用少量蒸馏水溶解后定容到1000毫升。2 实验器材（1）醋酸纤维素薄膜2厘米×8厘米（浙江黄岩曙光化工厂等处生产）（2）培养皿（直径910厘米）（3）点样器（自制）（4）直尺和铅笔。（5）镊子。（6）电泳槽。（7）玻璃板（8厘米×12厘米）。（8）普通滤纸。（9）试管和试管架。（10）吹风机。染色液、漂洗液和透明液应在密封的瓶子内贮存。否则，易挥发的成分蒸发，使溶液各组分配比发生改变，从而影响实验结果，在气温较高的季节，更要十分注意，特别是透明液。四、 实验操作1仪器和薄膜的准备（1）醋酸纤维素薄膜的润湿和选择：将薄膜小心地放入盛有缓冲液的培养皿内

11、，使它漂浮在液面。若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等，则为薄厚不匀的薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。因为，纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如，膜厚薄不匀可以造成区带歪扭不齐、各区带界限不清、背景脱色困难、实验结果难于重复等现象。将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面。无光泽面处点样，并向下放置。（2）制作“滤纸桥”：剪裁尺寸合适的滤纸条。取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲

12、液内。然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。（3）平衡：用平衡装置（或自制的平衡管），使两个电极槽内缓冲液的液面彼此处于水平的状态。一般需要1520分钟。注意，平衡后应将平衡装置的活塞关好（或除去平衡管）。此步骤不做处理。2点样在薄膜无光泽面的一面点样。点样区距负极端处。点样时，先用点样器蘸取清水均匀地点样在滤纸上练习，再用点样器蘸取待测血清印在薄膜的点样区内。注意，应使血清均匀地分布在点样区，形成具有一定宽度、粗细均匀的直线，切不可用

13、力过大把薄膜弄破。事先在滤纸上练习点样极为重要，掌握点样技术，这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。3电泳将已点样的薄膜无光泽面向下贴在电泳槽支架的滤纸桥上，参照图，平衡十分钟，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后通电。打开电源开关，调节电压和电流强度，先旋动仪器粗调旋钮，再旋动细调旋钮。调节到薄膜每厘米宽的电流强度为0 .3毫安，通电1015分钟后，在将电压和电流强度提高到薄膜每厘米长度电压为10伏左右，薄膜每厘米宽电流强度为0.40.6毫安。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高或偏低。待电泳区带展开约35厘米时，则关闭电源，一般通电时间约为60分钟左右。4染色电泳完毕立

14、即用镊子取出薄膜，直接浸入装有染色液的培养皿中，染色5分钟，然后，用漂洗液浸洗，每隔10分钟左右换一次漂洗液，连续更换三次，可使背景颜色脱去，将膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。操作中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。（集中倒废液。）5结果判断一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起依次为清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白和球蛋白。6透明将染色后漂洗干净的薄膜用滤纸吸干，再浸入透明液的甲液中，浸泡2分钟后立即浸入透明液的乙液中，浸泡1分钟（要准确），然后迅速取出薄膜，将它紧贴在玻璃板上，不要存留气泡。大约23分钟内薄膜完全透明，放置1015分钟后，用吹风机

15、将膜吹干。在水龙头下将玻璃板上透明的薄膜润湿后，用单面刀片从膜的一角撬起，并划开一端，再用手捏住撬起的膜轻轻撕下，可以容易地从玻璃板上取下透明的薄膜。用书压平薄膜暂时保存好，则成为色泽鲜艳又透明的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱，可长期保存不褪色。7定量（了解原理）未经透明处理的血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱可直接用于定量测定。一般采用洗脱法或光密度计法，测定各蛋白质的相对百分含量。（1）洗脱法：将电泳图谱的各区带剪下，分别浸于盛有0.4N氢氧化钠溶液的试管中，清蛋白管加入4毫升，其余各管各加2毫升，摇匀，放入37恒温水浴中浸提30分钟，每隔10分钟充分摇动一次，以便将色泽完全洗脱下来。该溶液颜色

16、比较稳定，在室温24小时内颜色强度无显著变化。然后在620毫微米波长处比色，测定各管的光密度值为O.D.A O.D. . 2 O.D. O.D. 。按下列方法计算各部分蛋白质所占百分率。先计算光密度值总和（简写为T）：T=2×O.D.A+O.D. 1 +O.D. 2 +O.D. + O.D. 再计算血清各部分蛋白质所占百分率（即相对百分含量）：清蛋白 =（2×T）×100 球蛋白= （O.D. T）×1001球蛋白=（O.D. 1T）×100 球蛋白= （O.D. T）×1002球蛋白=（O.D. 2T）×100正常值：清蛋

17、白 1球蛋白 2球蛋白 球蛋白 球蛋白 五、 思考题1 比较醋酸纤维素薄膜电泳与纸电泳有什么异同点？2 指出醋酸纤维素薄膜用作电泳的支持物有何优点？实验三：酶的特异性（专一性）一、实验目的1. 了解酶的特异性2. 掌握检查酶的特异性的方法及其原理二、实验原理酶是一种生物催化剂，它与一般催化剂最主要的区别是酶具有高度的特异性即专一性。所谓特异性指的是一种酶只能对一种化合物或一类化合物（通常在这些化合物的结构中具有相同的化学键）起一定的催化作用，而不能对别的物质发生催化反应。例如：淀粉酶能催化淀粉水解，但不能催化脂肪水解。而脂肪酶则能催化脂肪水解，却不能催化淀粉水解。本实验以唾液酶（含淀粉酶及少量

18、麦芽糖酶）和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，说明酶的特异性。三、实验试剂1、2% 蔗糖溶液2、0.3%氯化钠的1%淀粉溶液(新鲜配制)3、200倍新鲜唾液4、蔗糖酶溶液5、本尼迪克特试剂四、实验器材1、试管2、吸量管3、烧杯4、竹试管夹5、电热炉6、恒温热水器五、实验操作1、淀粉酶的特异性实验取2支试管，各加入本尼迪克特（Benedict）试剂2毫升，再分别加入1%淀粉溶液或2%蔗糖溶液各4滴。混合均匀后，放在沸水浴中煮23分钟。观察有无红黄色沉淀产生，纯净的淀粉和蔗糖不呈阳性反应。再取2支试管，每管各加入稀释200倍的新鲜唾液1毫升。再分别加入1%淀粉溶液和2%蔗糖溶液各3毫升。混匀，放入37

19、恒温水浴中保温，15分钟后取出。各加本尼迪克特试剂2毫升，摇匀，放在沸水浴中煮23分钟。观察有无红黄色沉淀产生。应该指出，关于新鲜唾液的稀释倍数，一般为200倍。但是，由于不同人或同一人不同时间。采收的唾液内淀粉酶的活性并不相同，有时差别很大，稀释倍数可以是50300倍，甚至超出此范围。因此，应事先确定稀释倍数。另外，要注意除去唾液里的气泡，避免稀释倍数不准确而影响实验结果。稀释好的新鲜唾液用滤纸过滤后待用。2、蔗糖酶特异性实验取2支试管，各加入蔗糖酶溶液1毫升，再分别加入1%淀粉溶液3毫升和2%蔗糖溶液3毫升。摇匀，放入37恒温水浴中保温，10分钟后取出，各加入本尼迪克特试剂2毫升，混匀后放

20、入沸水浴煮23分钟。观察有无红黄色沉淀产生。再取一支试管，加入蔗糖酶1毫升和蒸馏水3毫升，混匀，加入本尼迪克特试剂2毫升，摇匀，再沸水浴中煮23分钟。可以观察到试管内溶液呈现轻度阳性反应，这是由于蔗糖酶溶液本身含有少量还原性杂质的缘故。因此，用此管作为对照，即可解释上述用淀粉作底物的试管内呈现轻度阳性反应的原因。六、思考题1. 什么是酶的特异性?本实验结果为什么能说明酶具有这种性质？2. 为什么用于本实验的蔗糖必须是分析纯的试剂?3. 用煮沸后的蔗糖酶水解淀粉或蔗糖，会产生什么现象？为什么？这种试验与操作二的作法有何区别？试说明酶学实验中安排对照试验的必要性。实验四：激活剂、抑制剂、pH、温度

21、对酶活性的影响第一部分 激活剂和抑制剂对酶活性的影响一、实验目的1. 了解酶促反应的激活与抑制。2. 学习检定激活剂和抑制剂影响酶反应的方法和原理。二、实验原理酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。例如，氯化钠为唾液淀粉酶的激活剂，硫酸铜为其抑制剂。很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。例如，氯化钠达到1/3饱和时就可抑制唾液淀粉酶活性。三、实验试剂1、0.1%淀粉溶液2、稀释100-200倍的新鲜

22、唾液3、1%氯化钠的溶液4、1%硫酸铜溶液5、碘化钾-碘溶液四、实验器材1、试管2、烧杯3、吸量管4、恒温水浴器5、滴管五、实验操作取3支试管，编号。向第一支试管中加入1%氯化钠溶液1毫升，向第2支试管加入0.1%硫酸铜溶液1毫升，向第3支试管中加入蒸馏水1毫升作对照了。再向每支试管加入0.1%淀粉溶液3毫升和稀释的唾液1毫升。摇匀各管内容物，一齐放入37恒温水浴中保温,10-15分钟后取出.冷后,各滴入2-3滴碘化钾-碘溶液,混匀。观察比较3管颜色的深浅，并解释之。如果激活剂或抑制剂的作用不明显，主要原因可能是唾液淀粉酶活性不够高，可以适当延长反应时间或者降低唾液稀释倍数，然后再继续实验。六

23、、思考题1. 激活剂可以分为哪几类？本实验中氯化钠是属于其中哪一类？2. 抑制剂与变性剂有何不同？试举例说明。3. 酶反应的抑制作用有哪些类型？根据什么划分的？它们都有什么特点？第二部分 PH对酶活性的影响一、实验的和要求1 了解pH对酶活性的影响2 学习测定酶的最适pH的方法二、实验原理酶的活性受环境pH的影响极为显著。通常各种酶只有在一定的pH范围内才表现它的活性。一种酶表现其活性最高时的pH值，成为该酶的最适pH。低于或高于最适pH时，酶的活性逐渐降低。不同酶的最适pH值不同，例如，胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5，胰蛋白酶的最适pH为8等。应当指出酶的最适pH受底物性质和缓冲液性质的

24、影响。例如，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适pH为6.4-6.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。三、操作方法取8个50毫升锥形瓶，编号。按下表中的比例，用吸量管添加磷酸氢二钠溶液和柠檬酸溶液，制备pH5.0-8.0的8种缓冲溶液。锥形瓶号磷酸氢二钠（毫升）柠檬酸（毫升）缓冲液pH15.025.80036.0456788.0取9支干燥的试管，编号将8个锥形瓶中不同pH的缓冲液各取3毫升，分别加入相应号码（1-8号）的试管中。然后，再向每支试管中添加0.5%淀粉溶液2毫升。第9号试管与第5号试管的内容物相同。向第9号试管中加入稀释200倍的唾液2毫升，摇匀后放入37恒温水浴中保

25、温。每隔1分钟由第9号试管中取出一滴混合液，置于白瓷板上，滴一滴碘化钾-碘溶液，检验淀粉的水解程度，待结果呈橙黄色时，取出试管，记录保温时间。注意，掌握第9号试管的水解程度是本试验成败的关键之一。以1分钟的间隔，依次向第1至第8号试管中加入稀释200倍的唾液2毫升，摇匀，并以1分钟的间隔依次将8支试管放入37恒温水浴中保温。然后，按照第9号试管的保温时间，依次将各管迅速取出，并立即加入碘化钾-碘溶液2滴，充分摇匀。观察各管呈现的颜色，判断在不同pH值下淀粉被水解的程度，可以看出pH对唾液淀粉酶活性的影响，并确定其最适pH。四、试剂和器材一 试剂0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液（新鲜配制）稀释2

26、00倍的新鲜唾液 磷酸氢二钠溶液柠檬酸溶液 碘化钾-碘溶液（见实验三）二 器材试管和试管架 吸量管（0.5，1.2，5，10毫升）锥形瓶（50，100毫升） 烧杯（100毫升）量筒（100毫升） （6）玻璃漏斗吸量管架 白瓷板恒温水浴 滴管秒表 滤纸五、思考题1 pH对酶活性有何影响？什么是酶反应的最适pH？2 酶反应的最适pH是否是一个常数？它与哪些因素有关？这种性质对于选择测定酶活性的条件有什么意义？3 通过几个酶学实验，你对下面问题如何认识：酶作为生物催化剂具有哪些特性？进行酶的实验必须注意控制哪些条件？为什么？第三部分 温度对酶活性的影响一、实验目的和要求通过检验不同温度下的唾液淀粉酶

27、和脲酶的活性，了解温度对酶活性的影响。二、实验原理酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。通常温度每升高10°C，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。反应速度达到最大值时的温度称为某种酶作用的最适温度。高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。大多数动物酶的最适温度为37°C40°C，植物酶的最适温度为50°C60°C。但是，一种酶的最适温度

28、不是完全固定的，它与作用时间长短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。通常测定酶的活性时，在酶反应的最适温度下进行。为了维持反应过程中温度的恒定，一般利用恒温水浴等恒温装置。酶对温度的稳定性与其存在的形式有关。实践证明大多数酶在干燥的固体状态下比较稳定，能在室温下保存数月以至一年。溶液中的酶，一般不如固体的酶稳定，而且容易为微生物污染，通常很难长期保存而不丧失其活性，在高温的情况下，更不稳定。 三、操作方法唾液淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小分子的糊精及麦芽糖。它们遇碘各呈不同的颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色；糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红

29、色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色。由于在不同温度下唾液淀粉酶的活性高低不同。则淀粉被水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断。取3支试管，编号后各加入淀粉溶液2毫升。将第1、2号试管放入37°C恒温水浴中保温，第3号试管放入冰水中冷却，5分钟后，向第1号试管中加入煮沸515分钟的稀释唾液1毫升，向第2、3号试管加稀释唾液各1毫升。摇匀，20分钟后取出3支试管，各加碘化钾碘溶液2滴，混匀，比较各管溶液的颜色。判断淀粉被唾液酶水解的程度，并说明温度对唾液酶活性的影响。四、试剂和器材试剂（1）0.3氯化纳的0.5的淀粉溶液。 （2）稀释200倍的唾液。（3）碘化钾碘

30、溶液（见实验三）。器材（1）试管和试管架。 （2）吸量管（1、2毫升）。（3）烧杯（500、100毫升）。 （4）锥形瓶（100毫升 ）。（5）玻璃漏斗。 （6）水浴锅。（7）铁三脚架。 （8）煤气灯。（9）恒温水浴。 （10）滤纸。五、思考题1. 什么是酶的最适温度？有何实践意义？2. 为什么可以用碘化钾碘溶液作指示剂检查温度对唾液淀粉酶活性的影响？3. 酶在干燥的状态下与水溶液中，它的活性受温度的影响是否相同？这个性质对酶的保存有何意义？4. 酶反应的最适温度是酶的特征物理常数吗？它与哪些因素有关？ 实验五：酵母核糖核酸的水解及其组成成分的鉴定一、实验目的了解定性鉴定核酸的原理和方法。二、

31、实验原理用硫酸水解RNA时，可以生成磷酸、戊糖和碱基。各种成分以下列反应鉴定：（1） 磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀。（2） 核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，核糖无此反应。（3） 嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤银化物沉淀。三、实验试剂与器材1、试剂（1） 酵母核糖核酸（RNA）（2） 10%硫酸（3） 1N氨水（4）（5） 钼酸铵试剂：将2克钼酸铵溶解在100毫升10%硫酸中（6） 地衣酚试剂：100毫升浓盐酸加入100毫克三氯化铁，摇匀，贮存备用，使用前加入476毫克地衣酚又名甲基苯二酚（7） 二苯胺试剂：将4克二苯胺溶于400毫升冰醋酸中，

32、再加入11毫升浓硫酸（比重1.84）。若冰醋酸不纯，试剂呈兰色或绿色，则不能使用。2、器材（1） 试管及试管架（2） 试管夹（3） 水浴锅（4） 玻璃漏斗（5） 锥形瓶（50毫升）（6） 量筒（10毫升）（7） 滤纸四、实验操作1、提取RNA（1） 称取鲜酵母4克，置于50毫升三角瓶中，加入5%三氯醋酸溶液20毫升，用玻璃棒搅拌酵母碎块，然后将三角瓶放入100水浴中，加热时搅动内容物，时间为15分钟。（2） 将三角瓶中的内容物用滤纸过滤，锥形瓶承接滤液，此滤液为粗提的酵母RNA。2、水解RNA向滤液锥形瓶中加入10%硫酸溶液15毫升。在瓶口上插一个玻璃小漏斗，漏斗上盖一表面玻璃，然后进行30分

33、钟沸水浴，过滤得滤液约10ml，取滤液进行下列实验。3、嘌呤碱基的检查 取1支试管，加入1毫升0.1硝酸银溶液，再逐滴加1N氨水至沉淀消失。然后加入1毫升滤液，放置片刻，观察有无白色嘌呤碱基的银化物沉淀产生。（见光变为红棕色沉淀）。4、磷酸的检查 取2毫升滤液放入1支试管中，加入5滴浓硝酸和1毫升钼酸铵溶液后，进行沸水浴，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀。5、戊糖的检查 取2支试管，各加入1毫升滤液，分别加入等体积的地衣酚试剂和二苯胺试剂，进行1015分钟的沸水浴。比较两支试管的颜色变化，并解释。 五、思考题 1、若用上述方法鉴定DNA的水解液，应如何安排实验？估计会有什么结果？2、现有三瓶未知溶液，

34、已知它们分别为蛋白质、糖和RNA，采用什么试剂或方法进行鉴定？（请自行设计简便的实验） 实验六 包埋法固定化酵母细胞一、 实验目的学习海藻酸钠包埋酵母细胞的方法及蔗糖酶的检测方式二、 原理包埋是细胞固定化最主要的方法，在微生物细胞本身不发生化学反应的情况下，将其包进半透性的多聚物或膜内，小分子底物和产物均可自由出入，而且细胞去不会漏出。常用的包埋材料有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，明胶，角又菜焦及海藻酸钠等。本实验将用海藻酸钠作为包埋材料，海藻酸的组成单位是多糖醛酸，在有Ca2+、Ba2+、Co2+、Cu2+等存在下能形成凝胶，而将予先混合其间的酵母细胞包埋起来而形成固定化细胞。固定化细胞有明显

35、的优点，他免去了破碎细胞提取酶的手段，没在细胞内环境中稳定性高，酶活性损失较少。尤其在需要利用多酶复合体系时，固定化细胞可能将微生物发酵改为连续酶反应，是改革传统发酵工业的一个值得注意的方法。三、 实验器材1、 三角瓶2、 量筒3、 沸水浴器皿4、 吸管5、 漏斗6、 玻璃柱7、 试管及试管架四、 实验试剂1、4氯化钙溶液2、10蔗糖溶液1、 斐林试剂2、 卡氏酵母3、 海藻酸钠五、 操作方法1、称取海藻酸钠加入50ml蒸馏水，沸水浴加热溶解后冷却至30左右，将预先准备好的卡氏酵母的悬液15ml加入混匀，然后用针管滴入盛有80100ml的CaCl2溶液中，制成2-3cm的球形固定化酵母，将此固

36、定化酵母装入柱中，装好柱后由柱上边加入10%蔗糖液，控制一定流速（10-17滴1分钟），先流出去离子水1520ml，后流出水解液，此液即为经固定化酵母细胞水解的蔗糖液，其中含有葡萄糖和果糖。2、蔗糖酶的检验：吸取斐林甲乙液各1ml于试管中，加入水解液1ml，至沸水浴中保温，空白10%蔗糖液作对照，观察颜色反应。实验七：维生素C的定量测定（磷钼酸法）一、 实验目的1、 了解维生素C的测定方法。2、 加深理解维生素C的理化性质。二、 实验原理钼酸铵在一定条件下（有硫酸和偏磷酸根离子存在）与维生素C反应生成蓝色结合物。在一定浓度范围（样品控制浓度在25250ug/ml）吸光度与浓度成直线关系。在偏磷

37、酸存在下，样品所存在的还原糖及其它常见的还原性物质均无干扰，因而专一性好，且反应迅速。HPO2-，H2SO4MoO42-+维生素C Mo（MoO4）2+维生素C （还原型） 钼蓝 （氧化型）三、实验器材1、 松针、绿色蔬菜、橘子、广柑等富含维生素C的生物材料。2、 722型（或7220型）分光光度计。3、 水浴锅。4、 离心机4000r/min。5、 组织捣碎机。6、 吸管0.10ml(×2)，0.20ml (×2)，0.50ml (×2)，1.0ml (×3)，2.0ml (×1)，5.0ml (×1)。7、 试管cm×1

38、5cm(×10)。8、 试管架。9、 吸管架。四、实验试剂1、5%钼酸铵：5g钼酸铵加蒸馏水定容至100ml。2、草酸（0.05mol/L）-EDTA(0.02mmol/L)溶液：称取草酸和EDTA二钠，用蒸馏水溶解后定容至1000ml。3、硫酸（1：19）：取19份体积蒸馏水加入1份体积硫酸。4、冰乙酸（1：5）：取5份体积蒸馏水加入1份体积冰乙酸即可。5、偏磷酸-乙酸溶液：粉碎好的偏磷酸3g，加入48ml（1：5）冰乙酸，溶解后加蒸馏水定容至100ml；必要时过滤；此试剂放冰箱中可保存3天。6、标准维生素C溶液（0.25mg/ml）：准确称取维生素C25mg，用蒸馏水溶解，加适量

39、草酸（0.05mol/L）-EDTA(0.02mmol/L)溶液，然后用蒸馏水稀释至100ml，放冰箱贮存，可用一周。五、实验操作1、制作标准曲线取试管9支，按表51进行操作。30水浴15min后，测定。以吸光度值为纵坐标，维生素C质量（ug）为横坐标作图。表51 维生素C的定量测定标准曲线的制作管号试剂012345678标准维生素C溶液（0.25mg/ml）0蒸馏水/ml草酸-EDTA溶液/ml偏磷酸-乙酸/ml1：19硫酸/ml5%钼酸铵/ml摇匀30水浴15min维生素C质量/ug0255075100125150200250A760nm4 样品测定将所用生物材料如青菜、松针，洗净擦干，准

40、确称取5 00010 000g，加入草酸-EDTA溶液至50ml，组织捣碎机中匀浆2min，取上清液离心（4 000r/min）5min（也可准确称取5 000g，加入研钵内，加入少许草酸-EDTA溶液，研碎，如此反复三次，最后一并倒入100ml容量瓶内，然后用草酸-EDTA溶液定容至100ml，取上清，离心。）取上清液0.5ml，其余按做标准曲线第三步（即加入草酸-EDTA溶液）做起，根据吸光度值查标准曲线。六、计算m0V1m1V2×103m= ×100式中 m：100g样品中含抗坏血酸的质量（mg）； m0：查标准曲线所得维生素C的质量（g）； V1：稀释总体积（ml）

41、； m1：称样质量（g）； V2：测定时取样体积（ml）； 103：g换算成mg。 七、思考题1.制作标准曲线需要注意的问题？2.根据实验过程和结果，举出影响实验结果的几个因素，为什么？ 实验八、综合设计实验（二选一）综合设计实验一：燕麦水解蛋白的制备和理化性质测定一、实验目的：认识碱性蛋白酶和中性蛋白酶的区别学习水解蛋白的制备过程及水解蛋白理化性质测定方法，包括水解度的测定，水解蛋白分子量的测定。二、 原理 蛋白质在蛋白酶的作用下可以水解成不同的多肽分子，不同蛋白酶水解条件各不相同，碱性蛋白酶在PH较高的条件下活性较强，而中性蛋白酶在PH值中性的条件下活性较强。同一种酶不同条件下水解，如水解

42、时间、水解温度和酶量不同时也有很大的不同，导致水解所得多肽的分子量和多肽性质有很大的不同。三、 实验器材PHS3D PH计 上海三信仪表厂JL/5002型电子天平 上海良平仪器仪表有限公司Beckman coulter 高速离心机 Beckman 公司DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器 江苏太仓实验设备厂DHLA电脑恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司HD2核酸蛋白检测仪 上海沪西分析仪器厂有限公司DBS100电脑全自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司3057型便携式记录仪 重庆川仪总厂有限公司执行器记录仪公司电热恒温水浴锅 天津市泰斯泰仪器有限公司752 PC紫外可见分光光度计 上海光

43、谱仪器有限公司四、实验实剂1 原料燕麦麸皮 张家口面粉厂提供 2 酶制剂碱性蛋白酶 Novozymes 公司 中性蛋白酶 Novozymes公司.3 主要试剂氢氧化钠 分析纯 北京化工厂 甲醛溶液 分析纯 北京化学试剂公司磷酸二氢钾 分析纯 北京化学试剂公司磷酸氢二钾 分析纯 北京化学试剂公司乙酸锂 分析纯 上海恒信化学试剂公司乙酸 分析纯 北京化工厂二甲基亚砜 分析纯 北京化学试剂公司水合茚三酮 分析纯 北京化学试剂公司LLys 生化试剂 北京化学试剂公司牛血清蛋白 生化试剂 北京拜尔迪生物公司维生素B12 生化试剂 北京拜尔迪生物公司牛胰岛素 生化试剂 北京拜尔迪生物公司 氧化性谷胱甘肽

44、生化试剂 北京拜尔迪生物公司Sephadex G-15 Fine 生化试剂 北京拜尔迪生物公司六、 实验操作1 燕麦肽制备方法1）.原料处理 取燕麦麸皮，经20-80目过筛，作为水解原料。2）.燕麦肽水解工艺 （1）Alcalase 酶水解工艺在料液比为1：10时，即称取10g燕麦麸皮,量100ml蒸馏水，加入250ml的锥形瓶中。将燕麦麸皮液的pH调至9。在55下摇床进行预处理1小时。之后按5%的量添加Alcalase 酶，即加0.5mL酶于反应体系。使之在摇床中反应一定时间，后在8000r/min的条件下离心15min。所得上清液即为燕麦麸皮的水解液。（2）Protamex酶水解工艺 在料

45、液比为1：20时，即称取10g燕麦麸皮,量200ml蒸馏水，加入500ml的锥形瓶中。将溶液的pH调至6.5。按10%的量加入Protamex酶，使之在摇床中反应一定时间，后在8000r/min的条件下离心15min。所得上清液即为燕麦麸皮的水解液。2 样品检测方法 肽含量的测定（茚三酮法）1）.配置溶液：（1） 1mol/L乙酸锂-二甲基亚砜溶液（pH5.2）：4mol/L乙酸锂用乙酸调pH至5.2，取1份加入3份70%二甲基亚砜溶液。（2） 1%茚三酮溶液：称取1g水合茚三酮（99%纯度），溶于100Ml 1mol/L乙酸锂-二甲基亚砜溶液，置棕色瓶保存。（3） 标准氨基酸溶液（1mmol

46、/L）：如标准赖氨酸溶液：精量称取赖氨酸7.309mg定于50mL重蒸水。2）.检测方法：A:标准曲线的制作：取12支试管分成两组，分别加入0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL标准氨基酸溶液，相当于氨基酸含量0，200，400，600，800，1000nmol.各管加入1%茚三酮溶液0.5mL，充分混匀，用玻璃泡试管将试管口盖住，在100沸水浴中加热15分钟，冷取后用重蒸水稀释至25mL。充分混匀，于570nm处比色。以氨基酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。mol的氨基酸样品溶液，加入1%茚三酮溶液0.5mL，其余按上述方法操作进行比色测定。根据标准曲线查出样品的氨基酸含

47、量（mol），乘以该种氨基酸的相对分子量则为1mL样品中氨基酸的含量水解度的测定（甲醛滴定法）水解度(Degree of hydrolysis,DH)是指蛋白质分子中由于生物或化学的水解而断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例。用公式表示即为：DH=h/htot *100% 式中：h为水解后每克蛋白质被裂解的肽键毫摩尔数（mmmol/g）,htot为每克原料蛋白质的肽键毫摩尔数（mmol/g）。 检测方法的具体操作步骤如下：取水解蛋白液5.00mL于小烧杯中，加入60mL去CO2的蒸馏水并磁力搅拌，用0.1mL滴定至pH=8.2，加入已中和好的甲醛溶液（pH8.2）20mL，记录将其pH值滴至9

48、.2时所耗碱量。同时做空白实验。则水解蛋白液中蛋白质的-NH2含量为：1000*M*(V1-V2)/5.00 (mmol/L)其中：M: 所用溶液的摩尔浓度（mol/L）；V1: 样品滴定耗NaOH体积数（mL）；V2: 空白实验所耗NaOH体积数（mL）。则水解液的中断裂的肽键数（mmol/L）=水解液蛋白质的-NH2含量原蛋白质中游离的-NH2含量 所以水解度 DH= 燕麦肽分子量的测定采用凝胶色谱分析法测燕麦肽的分子量，具体方法如下:1. 凝胶的选择：文献中大豆蛋白等水解后的肽分子量的分布范围都在10005000内，据此可知燕麦肽的分子量也该在此范围。因此，选择可分离范围在10005000的葡聚糖凝胶Sephadex G-25。2. 凝胶的溶胀：称取80克Sephadex G-25 Fine凝胶颗粒，加入洗脱液，即pH=7.0的磷酸盐缓冲液，室温放置6小时以上。用倾斜法将不易沉下的较细颗粒倾去。装柱前最好将处理好的凝胶置真空干燥器中抽真空，以除尽凝胶中的空气。3. 装柱：将层析柱垂直固定，下端连接硅胶管并用弹簧夹夹住。向管中加入约1/3高度的去离子水，由下端排出适量水，将处理好的凝胶调成适当浓度的浆状物，一次到入漏斗中，搅拌几下使凝胶缓慢下沉。4. 柱平衡：将洗脱液装入一个下口瓶中，与层析柱相连，用35倍床体积的洗脱液洗柱，柱床稳定后调整流速至所需大小。新装好的柱需检验其均