抗生素的分离纯化及活性研究进展

1、山西大学研究生学位课程论文（2013 - 2014 学年 第一学期）学院（中心、所）： 生物技术研究所 专 业 名 称： 微生物学 课 程 名 称： 生物活性物分离技术 论 文 题 目： 抗生素的分离提纯及活性研究进展 授课 教师（职称）： 丁国斌 研 究 生 姓 名： 年 级： 2013级 学 号： 201323001002 成 绩： 评 阅 日 期： 山西大学研究生学院2014年1月16日抗生素的分离纯化及活性研究进展摘要：抗生素是一类在微量时就能抑制或杀死其他生物细胞的生理活性物质。本文是一篇综述性文章，主要通过对抗生素的分离提纯及活性研究，在简要说明常用的的分离技术的同时，也对现在的新

2、型方法有较为详尽的介绍。最后对个别特定的抗生素的活性研究进展进行了阐述。关键词：抗生素；分离提纯；活性研究 Abstract: A class of antibiotics are able to inhibit or kill cells in the micro-organisms other physiologically active substances. This article is a review article, mainly through the purification and separation of the activity of antibiotics, in

3、 a brief description of commonly used separation techniques, but also a new approach to now have a more detailed introduction. Finally, the research progress of individual-specific activity of antibiotics against elaborated. Keywords: antibiotics; separation and purification; activity很多食物或者中药中含有丰富的小

4、分子物质，近些年抗生素的使用为人类的健康作出了巨大的贡献。抗生素是一类在微量时就能抑制或杀死其他生物细胞的生理活性物质。为了进一步研究这些小分子性质的活性，首先要对这些活性物质进行提取纯化1。物质的分离和提纯也是科研工作中经常遇到的问题2。物质在分离和提纯中会使用一些物理和化学方法，而对于大分子物质来说，研究的人员较多，且获得了一定的理论基础，小分子物质相比之下方法的介绍还比较少，接下来就抗生素的分离提纯技术从传统到现在所发展使用的技术做一总结和归纳，以及每一种方法的适用范围，并举例加以说明。最后主要针对真菌抗生素的活性研究进展进行阐述。1.抗生素分离提纯的传统技术抗生素在提取前必须初步搞清它

5、的一些性质，如通过纸电泳和纸层析的方法可了解该抗生素是中性、碱性、酸性或两性物质以及在各种溶剂中的溶解情况。常用的抗生素提取方法包括溶媒萃取法、吸附法、离子交换法、沉淀法。针对于抗生素的纯化，上述的萃取、吸附、离子交换法当然也能用于精制，但技术上有所发展。如在精制时采用的不仅是一次萃取或一次吸附，而是多次萃取或多次吸附，即色谱分离的方法等。1.1溶媒萃取法溶媒萃取法的原理是利用抗生素和杂质在溶媒中的溶解度不同，将抗生素选择性地从一种溶剂转移到另一种溶剂中。不同的pH对抗生素的提取效率有一定的影响，如青霉素在pH值为2.7时形成游离酸，此时它能转入乙酸戊酯有机相中，当pH调至中性时，其则能转入水

6、相。溶媒萃取法较适宣分离极性较弱的抗生素，研究人员用带溶剂萃取方法有时也可以将极性较强的抗生素转入有机相中。随着抗生素工业的发展，溶剂萃取技术的研究和应用取得了迅速发展。 1.2吸附法吸附法在许多抗生素的提取和精制中得到应用，特别是一些在溶液中不形成离子因而不能用离子交换荆提取的抗生素，吸附法也用来使抗生素溶液除去色素和其它杂质。常用的吸附剂包括活性炭、氧化铝、大孔网格吸附剂等。活性炭作为吸附剂，其选择性较差，只适合抗生素的初步提取和除去滤液中的色素。用氧化铝柱层析时，抗生素的发酵滤液一般要经过过滤、脱色、浓缩后再上柱层析。大孔网格吸附剂是当前反应性高分子技术领域发展最迅速、最活跃的一个分支，

7、它可适合于吸附各种有机化合物，目前它已逐渐取代活性炭和氧化铝等吸附裁，在抗生素工业中显示出越来越重要的地位。1.3离子交换法离子交换法在抗生素的提取中占有重要的地位。选择合适的树脂是应用离子交换法的关键，选用树脂取决于抗生素的性质。一般来讲，对强酸性抗生素宣选用弱碱性树脂，对于弱碱性抗生素宣选用强酸性树脂：同理，弱酸性抗生素宣选用强碱性树脂，强酸性抗生素宣选用弱碱性树脂，同时树脂的交联度对分离提取效率有很大的影响。1.4沉淀法沉淀法利用了抗生素和某些酸碱形成不溶性的盐而沉淀，且此沉淀在改变条件后，可以使沉淀物重新溶解的特性。对于碱性和两性的抗生素可用不同种类的酸作为沉淀剂，酸性抗生素可和有机碱

8、形成盐而沉淀。1.5色谱法色谱法又称色层法、层析法，是用于分离多组分有机混合物的一种高效分离技术。色谱法是基于混合物各组分在两相(固定相和流动相)之间的不均匀分配进行分离的一种方法。不均匀分配的先决条件，是各个组分对两相亲和力的不用和向两相不均匀分配的可能性。由于混合物中各组分对两相的亲和力有差异，它们穿过固定相的流动速度(或在固定相中的滞留时间)就有不同，从而得到分离。色谱法有两种不同的相：一种为固定相，即固定的位置(可以是固体或者液体)；另一种为流动相，即流动的溶液或气体。以气体为流动相的称为气相色谱，液体为流动相的称为液相色谱。根据各组分在固定相中的作用原理不同又可分为吸附色谱、分配色谱

9、、离子交换色谱、排阻色谱等。根据载体及操作条件的不同，又可分为纸色谱、薄层色谱、柱色谱、高效液相色谱、气相色谱等。1.6结晶与重结晶法固体有机物在溶剂中的溶解度与温度有密切关系。一般是温度升高溶解度增大。若把固体物质溶解在热的溶剂中达到饱和，冷却时由于溶解度降低，溶液变成过饱和而析出结晶。一般来讲，一个固体达到一定的纯度，在一定条件下，就会出现结晶。利用溶剂对被提纯物质及杂质的溶解度不同，可以使被提纯物质从过饱和溶液中析出。而让杂质全部或大部分仍留在溶液中(或被过滤出去)从而达到提纯目的。一般能结晶的物质大部分是比较纯的化合物，有时结晶也是混合物，即使这样，也还是可以和不结晶的部分分开。从不是

10、结晶状物质处理到结晶状，叫结晶。从比较不纯的结晶用结晶方法精制到较纯的结晶称为重结晶。最后的精制成品还需干燥。干燥的方法很多，如真空干燥、冷冻干燥、红外线干燥等。2. 近年发展的新型分离提取和纯化技术2.1液膜分离液膜分离技术是美籍华人黎念之博士1968年首次提出的。该技术的特点是，通过高度分散的微细液 界面的传质。比溶剂萃取和离子交换吸附等传统的分离技术具有传质速度快、选择性高、萃取和反萃同时进行、能耗低等一系列优点。液膜通常由膜溶剂、表面活性剂、流动载体和膜增强添加剂组成3-5。膜溶剂是成膜的基体物质，一般为水或有机溶剂，选择的依据是液膜的稳定性和对溶质的溶解性。表面活性剂能明显降低液体的

11、表面张力或两相的界面张力，对液膜的稳定性、渗透速度、分离效率和膜的重复使用有直接影响。流动载体的作用是选择性迁移指定的溶质或离子，常为某种萃取剂。膜增强添加剂用于增加膜的稳定性，即要求液膜在分离操作时不会过早破裂，在破乳工序中又容易被破碎。朱澄云等6研究了用乳状液膜法从发酵液中 提取青霉素G 时，不同实验条件对提取率的影响。采用最佳实验条件，可达到提取率 76. 5 % 、浓缩比6. 0的效果。 2.2双水相萃取技术 双水相体系萃取技术 (Aqueous Two Phase Extraction，ATPE)是一种高效而温和的生物分离新技术，自1956 年瑞典伦德大学的AlbertsSon7将双

12、水相体系成功用于分离叶绿素到1979年德国GBF的KuLa8等人23将双水相萃取分离技术应用于生物产品的分离，及国内20世纪80年代开始对ATPE技术的研究，ATPE法以其操作方便，分离效率高，不会导致被分离物质的破坏和失活等特性，被广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取9。2.3超临界萃取技术超临界萃取技术(supercritical fluid extraction，SFE)，是近二三十年发展起来的一种新型的分离技术。该技术有许多传统分离技术不可比拟的优点：1、具有较强的溶解能力，流体的表面张力为零。更容易渗透被提取物中；2、溶质在其中扩散系数却与气体相似。提取时间

13、短，提取时间一般只需数10min；3、超临界流体在通常状态下即成为气体，因此萃取后溶剂立即变为气体而逸出，不会有有机溶剂残留。4、过程易于调节，通过改变萃取的条件，如温度、压力等，可以选择性地萃取某些组分。此外，由于CO2：的临界温度只有31.3，临界压力为7390kPa，而且来源丰富、惰性，最常应用的超脑界流体是超临界CO2，所以，超临界流体萃取还有无毒、不会破坏热敏物质、价格低廉等优点。 2.4微波萃取技术 微波萃取是利用微波能来提高萃取率的一种最新发展起来的新技术。微波萃取具有设备简单、适用范围广、萃取效率高、节省时间、节省试剂、污染小等特点。微波萃取技术与传统煎煮法相比较，克服了材料细

14、粉易凝聚、易焦化的弊病。提取时间极短。但这一技术用于天然产物的提取尚属起步，其萃取机理还需进一步研究。2.5薄层色谱法（TLC）薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。采用TLC法队庆大霉素进行分折，具操作简便、分离效果好、测定结果准确，但是重现性较差。TLC法是中药鉴定中最常用且简便、直观、经济的一种色谱法。样品点样展开后，可通过斑点的荧光或显色反应直接鉴定比较，也可通过扫描定性、定量分析，几乎适用于所有的动、植物类药材的鉴定。2.6高效

15、液相色谱(PHPLC)高效液相色谱(PHPLC)，具有产品纯度高、产率高、分离速度快、检测方便、收集 产物准确等优点，成为近年来制备、纯化天然产物的一种很有效的手段，在中医药研究标准品的制备与产品的分离纯化得到广泛的应用10。其中，带有吸附功能基团的反相层析介质表现出优异的分离性能。但因价格昂贵，且需要高压泵输送系统，现有的有修饰基团的反相层析介质几乎都是用作分析为主，较少应用于制备级生产。2.7高速逆流色谱法 (HSCCC)高速逆流色谱法 (HSCCC)，于1982年由美国国立卫生院Ito博士研制开发的一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术11，与其它色谱技术不同的是它不需任何固态载体，因此

16、能避免固相载体表面与样品发生反应而导致样品的污染、失活、变性和不可逆吸附等不良影响。同时它也具有适用范围广、快速、进样量大、费用低、回收率高等优点。因此，己在生物、医药、食品、材料、化妆品和环保等领域获得了广泛的应用，尤其是在天然产物活性成分的分离纯化领域倍受重视。2.8超声提取技术超声提取是一种物理场强化提取技术。与常规的溶剂提取，超声提取时间短、产率高、条件温和；超声波的粉碎、搅拌等特殊作用，可以打破细胞壁，使溶媒更快的渗透到细胞中。溶出其中的化学物质。超声提取技术可用于中草药中生物碱、苷类、蒽醌类等多种的有效成分的提取。因此把超声波作为提取的一种手段，也将适用于食药用菌有效成分提取。黄书

17、铭等(2004)研究提取灵芝中三萜类化合物时。在常规提取方法的基础上，增加超声循环的处理步骤。通过试验对比。发现超声循环提取所需各种溶剂用量减少，提取时间缩短。目的产物提取率提高了40。 2.9酶反应技术利用酶的生物催化添生、专一性等。应用果胶酶、木瓜蛋白酶、纤维索酶等水解酶。分解去除原料中 的果胶、粗蛋白、纤维素、淀粉、脂肪等杂质，酶反应较温和地将组织分解。可以较大幅度提高收率。 3.微生物抗生素活性研究进展发展新型抗微生物抗生素的关键是发现和鉴定致病微生物生物合成或分子作用靶位。现在抗微生物抗生素的研究中已经发现了一些新的作用靶点和新结构类型的先导化合物，为开发新型抗微生物药物展现了广阔的

18、前景。接下来主要对真菌抗生素作用的靶位分为抑制细胞壁的合成、抑制细胞膜的合成、抑制蛋白质合成和抑制电子传递等抗生素。3.1作用于微生物细胞壁微生物细胞壁是微生物特有的一种细胞壁，在维持细胞的生长和正常生理功能中起重要作用。微生物细胞壁的主要成分为甘露糖蛋白、几丁质和葡聚糖，通过抑制或干扰这些成分的合成便能有效地抑制和杀灭微生物。由于哺乳动物的细胞没有细胞壁，细胞壁合成酶抑制剂可选择性作用于微生物，因此对人几乎没有毒副作用。根据其作用机制不同，该类药物可分为以下3种：(1)以细胞壁中甘露聚糖和甘露聚糖蛋白质复合体合成酶为作用靶点：甘露聚糖和甘露聚糖一蛋白质复合体存在于微生物细胞壁中、外层结构。普

19、那米星(Pradimicins)是从本槿马杜拉放线菌中分离出的一组抗微生物抗生素，在钙离子存在时可识别一种甘露糖苷，并与甘露聚糖形成不溶性复合物，从而改变微生物细胞壁结构，影响细胞壁的渗透性，使微生物细胞溶解。该类药物属稠环芳香类抗生素。已经发现的还有Benanomycins也被认为是作用于甘露蛋白的抗微生物抗生素12。(2)以细胞壁中几丁质合成酶为作用靶点：几丁质是N乙酰葡萄糖胺(NGlcNAC)的链状聚合物，是微生物细胞壁的支架结构。几丁质合成酶催化NGlcNAC的聚合，在微生物的细胞分裂和成熟中起了重要作用。微生物体内有3种几丁质合成酶：Chsl，Chs2，Chs3。其中Chsl是修复酶

20、，不是必需的，而Chs2和Chs3非常重要。多氧霉素(polyoxins)和尼可霉素(nikkomycins or neopolyoxins，或称华光霉素，日光霉素)与几丁质的底物UDPN一乙酰葡萄糖结构类似，是几丁质合成酶的竞争性抑制剂，抑制几丁质的合成，导致细胞的死亡。(3)以细胞壁中葡聚糖合成酶为作用靶点：葡聚糖是微生物细胞壁的主要成分。新型脂肽类抗微生物药物棘球白素类似物非竞争性抑制剂，能够抑制葡聚糖的合成，导致细胞壁的缺损，因而造成微生物细胞的溶解。主要作用于念珠菌属、曲霉菌属等。不良反应少，已经研究成功上市的此类药物有卡泊芬净(Caspofungin)、米卡芬净(Micafungi

21、n)、阿尼芬净(aJlidula如ngin)等。3.2作用于微生物细胞膜(1)鞘磷脂类合成酶抑制剂：鞘磷脂是微生物和哺乳动物细胞膜的必要成分，目前其生物合成途径已明确，其借细胞信号传导来控制细胞的分裂、增殖和死亡。而哺乳动物和微生物间的细胞膜鞘磷脂存在很大差别，因此它是抗微生物药物开发极具价值的重要靶点。尽管动物和微生物的鞘脂类生物合成路径包含着许多相似的过程，但有些催化酶只在微生物中出现，这些酶有很大的开发利用价值，可以成为选择性、无毒副作用的抗微生物靶点。磷酸肌醇在肌醇磷酰神经酰胺(IPC)合成酶的催化下形成肌醇磷酸神经酰胺，这是微生物特有的鞘脂合成步骤。铁锈霉素、短柄霉素等通过抑制这一关

22、键酶，便可引起微生物细胞内神经酰胺聚集，使细胞膜的形成受阻，破坏细胞膜结构，从而导致细胞死亡。(2)干扰细胞膜麦角固醇的生物合成：微生物细胞膜固醇结构不同于哺乳动物，其麦角固醇的生物合成有许多有潜力的作用靶位，目前已经发现一些物质可以抑制麦角固醇合成中的必需酶。如一种新型的微生物(Coelomycetes)，其代谢物对麦角固醇合成的关键酶角鲨烯合成酶有强大的抑制作用，并在体外显示较宽的抗菌谱。调血脂药Fluvastatin可以抑制羟甲基戊二酰辅酶。3.3其他可能的抗微生物靶点除了以上的抗微生物靶点以外，还可能存在的靶点的有以下三种：抑制微生物蛋白合成的物质；抑制电子传递的物质；其他13等。参考文献1 林陈强,林戎斌,郑永标,陈济琛,林新坚.食药用菌中的几类小分子活性物质及其提取方法2 武旭芳,吴宁远,王来兵.用物理化学法