enzymology 3b2离子交换色谱

1、电荷差异离子交换法 1 原理概述：离子与固体载体带电基团间的争夺战 2 交换剂：是帶有电荷的长链大分子聚合物 3 缓冲液与层析系统：缓冲液的影响极大 4 管柱操作方法： 如何操作一根离子交换管柱 5 色谱聚焦法： 依蛋白质等电点不同来进行分离.离子交换色谱 通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的方法。主要以两电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。 离子交换剂是一类能显示离子交换的功能高分子材料。 功能基由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，两者所带电荷相反，以静电力结合。 可进行交换的离子称为反离子或抗

2、衡离子，可与溶液中带同种电荷的离子进行交换反应。 离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。 阴离子交换法 Anion Exchange：载体+ +样本分子流动相固定相阳离子基团Counterion阴离子+能与阳离子进行交换反应的称为阳离子交换剂能与阴离子交换的为阴离子交换剂Monobead 各种离子交换剂：StrongWeakWeakStrongResin / Polystyrene Glycan / Cellulose = X Anion Exchanger CationExchangerIRC-150Dowex-50Dowex-1Dowex-2Dowex-3IR-45-NHR2+-SO3-N

3、R3+-COO-X = Sephadex, Sepharose, Sephacel or celluloseCM-XDEAE-XTEAE-X(QAE-X)Phospho-X阴阳强弱分类 -OCH CH NHR222+-NR3+42-PO2-OCH COO选择离子交换剂+Net Charge of a ProteinBuffer pHpI-3456789100阴离子交換阴离子子交換 质子可以吸附或脱离一基团：Proton： 最小且最多的生物粒子，影响酸碱度及分子帶電性质H+lone pair electronsHHH+NHHN胺 基H+羧 基COOHCOO类型：强酸、强碱、弱酸、弱碱等H3+N-

4、R-COOH H2N-R-COOH H2N-R-COO-+H2O 阳离子形式 等电点（R大分子链） 阴离子形态 pH pI 电荷高者离子大者浓度大者阴离子交換法的分离范围：10050257564kDpHJuang RH (2004) ECX操作方式：间歇式分批操作：batch又叫静态处理，将离子交换剂泡于工作液中，达到平衡后，滤出介质进行洗脱。柱式操作：又称动态法，交换、洗脱、再生等步骤均在柱内进行。 树脂的组成与外型：CelluloseSephcelMonobeadPharmacia (1980) Separation News: 5 树脂外型影响流速和分离度Pharmacia (1991)

5、 Ion Exchange Chromatography Principles and Methods p.24 不同树脂的吸附容量有很大差异：DEAE-Sephadex A-25DEAE-Sephadex A-50DEAE-Sepharose CL-6BDEAE-SephacelLactalbuminAlbuminFerritin1911045383110211586214.38.6Buffer: 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0mg / mL gelAdapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography Princi

6、ples and Methods p.64Spin-downAdapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography Principles and Methods p.70离子交換法预备试验：102030405060708090100pHNaClpH = 70.15 MNaClmg/mLprotein50 + Buffer + GelSupIncubationSpinSup + Spindown5.05.56.06.57.07.58.08.59.09.50.000.250.300.350.400.450.507.

7、00.15Capacity 柱的装填方法：缓冲液平衡溫度平衡静置树脂清洗树脂预估体积裝填树脂暂停流出X继续流洗加上 reservoir已堆积沉积中上清加压流洗加上 adaptor紧密堆积檢查好管柱是否畅通12GelGelJuang RH (2004) ECX液相层析柱系统：A缓冲液梯度发生器泵记录器检测器管柱树脂树脂充填分步收集器(1)(2)(3)(4)(5)adapterreservoir转接器Pharmacia 盐梯度的两种方式：連續梯度階段梯度高浓度溶液低浓度溶液两种方式均可，各有特点。减少死体积连续梯度連續梯度分段梯度Dead volume树脂面连续与分段梯度比较0.

8、0.40 50 100 150 2000 50 100 150 200Elution volume连续梯度分段梯度蛋白质浓度Adapted from Pharmacia: Ion Exchange Chromatography Principles and MethodsAdapted from Pharmacia: Ion Exchange Chromatography Principles and Methods盐浓度不同条件比较0 20 40 60 80 1000 20 40 60 80 1000.3蛋白质浓度Elution vol

9、umeNaClAdapted from Pharmacia: Ion Exchange Chromatography Principles and Methods洗脱体积会影响分离度0.5 M0.5 M0.5 M NaClElution volume相对吸光度1005000 100 200 300100500100500分离效果改善但是浓度变稀管柱长短的影响： 0.03 0.04 0.06 0.1 0 0.03 0.04 0.06 0.1 0蛋白质浓度Acetate concentration (M)10 cm cloumn5 cm cloumnABAB 离

10、子交換的梯度分离有浓缩效果：Salt gradient elution beginsSampleappliedAdapted from Scope RK (1987) Protein Purification Principles and Practice p.112 离子交换法操作要点：树脂平衡用过的树脂要 再生完全 平衡在缓冲液洗脱方式通常都以 氯化钠 进行 连续梯度 洗脱直接流出样品亦可直接流出 而 杂质被吸附缓冲溶液使样本分子帶 微弱 正负电荷以便洗脱非专一性缓冲液加 低盐 可洗掉杂质的 吸附浓度体积洗脱液的浓度 及 体积 要适当管柱操作注意管柱装配良好 避免 死体积样品溶液要 平衡

11、在缓冲液 注意树脂容量 大小Juang RH (2004) ECX0.2 M NaClAdapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography Principles and Methods p.127 离子交换法实例： Cellulase0.510020300.510020Retention time (min)Mono Q HR 5/51 mL/min20 mM Tris, pH 7.6Crude cellulase 2.5 mg0.5 M NaClMono S HR 5/51 mL/min20 mM Acetate, pH 3.6Q

12、S-+0NaClJuang RH (2004) ECX离子交换法实例00.4100200300Elution volume蛋白质浓度DEAE Sepharose CL-6BSSSDS-PAGE活性3.3.5 聚焦色谱法 Chromatofocusing其介质也是一种离子交換剂但所使用的 Polybuffer 形成稳定的 pH 梯度Juang RH (2004) ECX+聚焦色谱法的聚焦机制8765+-0+Polybuffer聚焦在等电点超越等电点 (帶负电) 被吸附在低 pH 处帶正电被排斥 聚焦色谱法如何形成 pH 梯度：9876Volume9876Vol

13、umepH69实际結果 无法形成 pH 梯度缓冲作用假如含有許多缓冲分子 Polybuffer 含有连续 pKa 的缓冲分子 (ampholyte) 可形成连续 pH 梯度699876?9876Juang RH (2004) ECX 抹香鲸肌红蛋白 (pI = 8.2) 超过 马肌红蛋白 (pI = 7.4)Pharmacia酶分离纯化的方案设计酶分离纯化的方案设计The following information is known about four proteins: ProteinMrpISubunitsA13,1005.21B14,2009.11C35,5006.21D200,0005.84 id