分子生物学5 分子生物学研究方法(上)——DNA RNA 蛋白质操作技术

1、第五章 分子生物学研究方法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术重点：1. DNA操作技术2. 基因克隆的主要载体系统难点：1. DNA操作技术2. 基因克隆的主要载体系统课时分配：8学时第一节 重组DNA技术史上话一、二十世纪分子生物学的三大成就（1）20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；（2）50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了自我复制和世代交替问题；（3） 50年代至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。二、基因工程1、基因操作 gen

2、e manipulation 主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 2、基因工程 genetic engineering 将外源DNA，通过具有复制能力的载体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋白质。是核酸操作技术 的一部分。3 工具 基因的剪刀限制性内切酶基因的针线DNA连接酶 基因的运输工具载体 4 基本步骤 提取目的基因 目的基因与载体结合 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测和表达 三、DNA 重组技术 recomb

3、inant DNA technique 其核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。四、重组DNA技术史上的主要事件1973 Cohen第一例成功的克隆实验1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公

4、布人类基因组基本信息五、生物技术工程： 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程第二节 DNA操作技术一、DNA的分离，提取 1. 材料的选择：物种、组织的选择 2. 组织匀浆：细胞分散、破碎(EDTA:乙二胺四乙酸；Tris-Hcl: 三羟甲基氨基甲烷) 3. 破碎细胞： SDS表面活性剂 4. 除蛋白： 蛋白酶K、酚、氯仿抽提 5. 除RNA： RNA酶6. DNA回收： 乙醇、异丙醇沉淀7. 质量鉴定： （1） 琼脂糖凝胶电泳，常用溴化乙锭（EB）染色，紫外灯下观察和照相。自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析重组DN

5、A分子及蛋白质与核酸相互作用的重要手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制性内切酶作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。原理： 带有电荷的分子在电场作用下的迁移速度，叫电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，在无反应活性的稳定的支持介质中，与分子的摩擦系数成反比。也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数越多，分子越小，其迁移的速度越快，反之越慢。因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所携带的净电荷数的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分分离开来。核酸带负电荷，放置在

6、电场中，会向正极方向迁移。相同碱基数量的双链DNA分子几乎带有等量的净电荷，能以同样的速度向正极方向迁移。在一定电场强度下，电泳的迁移率取决于核酸分子大小和构型，可以通过电泳将核酸分子混合物中大小不同的片段分离开来。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海澡产物琼脂中提取出来。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度由琼脂糖的浓度决定。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力就随之减弱。 B.检测量：可达ug，ng级 C.检测信息：DNA的有无、 DNA的大小、 构象、 纯度（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳，常

7、用二甲苯青（F.F）染色，白光灯观察和照相（3）两种方法比较 凝胶的分辨能力同凝胶的浓度和类型有关。 琼脂糖凝胶的分辨范围：0.250kb 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围：11000bp 溴化乙锭染色。在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05ug的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把含有DNA分子的凝胶浸泡在溴化乙锭的溶液中，或是将溴化乙锭直接加到D

8、NA的凝胶介质中，此种染料便会在一切可能的部位与DNA分子结合，然而却不能与琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶相结合，因此，只有DNA分子能吸收溴化乙锭并发出荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的大小或数量成正比。8. 纯度检测： 紫外吸收法（260nm） OD260 - 决定DNA的量 OD280 - 决定Protein的量 （1）纯度： 1.8 OD260/280 < 2.0 纯样品 < 1.8 不纯 2.0 RNA（纯）（2）浓度（ug/ml 或ng/ul ）： OD260 X 50 X 稀释倍数五、 细菌转化 1、细菌转化transformation 是指一种细菌由于捕获

9、了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫供体菌株，接受转化DNA的菌株则被称为受体菌株。2、基本过程大肠杆菌是细菌转化实验这的常用材料。将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，并与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。立即将该体系转移到42下作短暂的热处理，复合物并会被细胞所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化因子。利用噬菌体颗粒能够有效地将DNA注入寄主细胞中这一特点，科学家又发明了重组体DNA分子的体外包装法。经包装的基因工程噬菌体能够借助细菌

10、表面的噬菌体接受器位点将DNA注入受体细菌，并在这些细胞中得到繁殖和表达。细菌转化常用的方法有CaCl2法和电击法。CaCl2法是制备大肠杆菌感受态最常用的方法。三、聚合酶链式反应技术（PCR技术） 1. 定义 又称体外基因扩增法，在体外（试管、反应管中）将要研究的目的基因或DNA片段在短时间内扩增上百万倍，称为DNA聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction technology，PCR ）2. 发展简史 1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想： “经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 1985

11、年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 发明了聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中进行DNA的体外合成。 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR 。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应

12、2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。 在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。3. 基本原理 第一步 “加热变性”：高温下使DNA的双链解开成为两条单链DNA分子； 第二步 “退火” ：引物附着到模板DNA两侧； 第三步 “延伸”：DNA聚合酶在适当的反应温度下促使核苷酸依次按与模板碱基互补配对原则，在引物3端一个个地连接上去，直至形成一个完整的DNA分子。（图5-16）：

13、（a）起始材料，双链DNA；（b）反应混合物加热后发生链分离，降温使引物结合到待扩增靶DNA区段两端的退火位点上；（c）Taq DNA聚合酶以单链DNA为模板在引物的引导下利用反应混合物中的dNTPs合成互补的新链DNA；（d）将反应混合物再次加热，使旧链和新链分开；（e）重复（b）；（g）重复（c）4. PCR反应所需成分： （1）DNA模板： 100-200ng （2）引物（前、后）:10-20uM （3） dNTP（dATP、 dTTP 、dCTP 、dGTP ）:4ul（4）反应缓冲液:5ul （5）Mg2+ :作用：促进靶序列与引物结合，Mg2+过量易形成非特异性扩增，不足易使产量降

14、低 （6）DNA聚合酶:0.5ul 反应要求引物的量远远大于模板的量， Why？ 保证引物与模板配对的可能性大于模板与模板配对的可能性。5. 特点： （1） 扩增产物的长度及位置由引物确定； （2）特异性（取决于引物的特异性） （3）灵敏性（扩增效率） 理论上: 2n （230=109） 实际 : 106 107（为什么？）退火时，除了引物与模板的结合，还有模板与模板的结合6. 应用： （1）PCR产物的克隆； （2）检测（疾病、突变、育种、法医鉴定、生物进化、分类等） （3）多态性分析 7. 常见问题： 污染（试剂、实验室、样品） 酶活性及种类 四、实时定量PCR 1、概念 实时定量PCR（

15、real time quantitative PCR ）：利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。实时定量PCR在带透明盖的饲料小管中进行，激发光可以直接透过管盖，激发荧光探针。荧光探针事先混合在PCR液中，只有与DNA结合后，才能被激发生荧光。 2、非序列特异性的荧光探针SYBR Green I 是最简单的非序列特异性荧光探针，仅能与双链DNA结合，被激发出绿色荧光，其荧光强度反映PCR产物的产量。随着新合成的DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光也相应增加。 3、与DNA序列

16、特异结合的荧光探针 利用SYBR Green I可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA，但不能区分不同的双链DNA。为了进一步确保荧光检测的就是靶DNA序列，人们又设计了仅能与目的DNA序列特异结合的荧光探针，如TaqMan探针。TaqMan探针是一小段被设计成与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA（一般为50-150bp），并且该单链DNA的5端或3端带有短波长和长波长两个不同荧光基团。这两个荧光基团由于距离过近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生了荧光淬灭。PCR开始后，随着双链DNA变性产生单链DNA, TaqMan探针结合到与之配对的靶DNA序列上，并被具有外切酶活性的Taq

17、DNA聚合酶逐个切除而降解，从而解除荧光淬灭的束缚，荧光基团在激发光下发出荧光，所产生的荧光强度直接反映了被扩增的靶DNA的总量。4、应用 （1）用实时定量PCR法分析未知样品靶DNA的绝对表达量下面以简单的荧光染料SYBR Green I为例，分析实时定量PCR绝对定量的结果。为确保实验数据的有效性，每次实验都应设阴性对照和4个以上的标准品，每个样品至少平行做3个重复。通常以10-15个循环的荧光值作为阈值或基线，也可以阴性对照荧光值的最高点作为基线。图5-13A显示随着扩增反应循环数增加，代表扩增产物含量的荧光强度增加。图5-13B中的标准曲线标准样品浓度的1g值和其相对应的Ct值所组成。

18、Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待测靶DNA的绝对含量。 （2）实时定量PCR对不同样品中目的cDNA的相对定量通过实时定量PCR，以正常或野生型样品为参考标准，可以对处理或突变样品中基因表达的变化多少进行相对定量。5、数据处理 五、重亚硫酸盐测序技术 1、表观遗传学（epigenetics）：又称“拟遗传学”、“表遗传学”、“外遗传学”以及“后遗传学”，在生物学和特定的遗传学领域，研究的是在不改变DNA序列的提前下，某些机制所引起的可遗传的基因表达或细胞表现型的变化 。 2、DNA甲基化（DNA methylation）：指生物体在DNA甲

19、基转移酶 （DNA methytransferase, DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体将甲基转移到特定的碱基上的过程。 主要形式：5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤 作用：抑制基因表达3、检测甲基化的常用方法 甲基化敏感限制性内切核酸酶法、重亚硫酸盐测序法、甲基化特异性的PCR、DNA微阵列法、甲基化敏感性斑点分析法4、重亚硫酸盐测序法的主要过程（182页）六、基因组DNA文库的构建1、基因组DNA文库：把某种生物的DNA切成适当大小，分别于载体连接，导入微生物细胞，形成克隆。基因组中所有DNA序列克隆的总汇被称为基因组DNA文库。2、构建方法：机械切割

20、法或限制性内切核酸酶切割法3、常用载体：噬菌体4、基本过程第三节 RNA操作技术一、总RNA的提取1、总RNA包括： mRNA、rRNA、tRNA以及一些小RNA(sRNA)2、提取方法：异硫氰酸胍-苯酚抽提法(着重防RNA酶污染) Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA的专用试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质基质及核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。 提取RNA时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含RNA的水相，通过异丙醇沉淀，获得