实验五原核表达

1、实验五实验五 原核原核表达表达一、原理一、原理v1、 e.colie.coli表达系统表达系统ve.colie.coli是重要的原核表达体系。在重是重要的原核表达体系。在重组基因转化入组基因转化入e.colie.coli 菌株以后，通过菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行目的蛋白质，将表达样品进行sds-sds-page page 以检测表达蛋白质以检测表达蛋白质。v本实验采用异丙基硫代本实验采用异丙基硫代-d-d-半乳糖半乳糖昔（昔（iptgiptg）诱导外源基因表达）诱导外源基因表达2.sds-2.sds-聚丙烯酰胺凝胶电

2、泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-pagesds-page） 使用含有十二烷基硫酸钠（使用含有十二烷基硫酸钠（ sdssds）和还原剂）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸品进行处理（一般煮沸3-53-5分钟），通过加热分钟），通过加热和和sdssds可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。将解离为单亚基。vsdssds是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使和疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分子处于伸

3、展状态。蛋白质分子处于伸展状态。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点结构上的特点 蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。净电荷以及分子大小和形状等因素。加入加入sdssds（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的的分子量，而与原来所带电荷、分子形状分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关。无关。电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒子滞

4、后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子二、试剂二、试剂vlb培养基培养基 vsoc培养液培养液 v50 g/ml ampviptg vsds-page loading buffer sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳：试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳：试剂v30%丙烯酰胺凝胶贮液丙烯酰胺凝胶贮液： 丙烯酰胺30 g， n, n-亚甲双丙烯酰胺 0.8 gv4triscl/sds ph 8.8：18.2 g tris碱溶解于40 ml水中，用1 mol/l的盐酸调ph为8.8后，定容到100 ml，

5、再加0.4 g sds。v4triscl/sds ph 6.8：6.05 g tris碱溶解于40 ml水中，用1 mol/l的盐酸调ph为6.8后，定容到100 ml，再加0.4 g sds。v样品缓冲液：样品缓冲液：1 ml 4triscl/sds(ph 6.8)，1 g sds，2 ml -巯基乙醇，巯基乙醇，1 ml 0.1%溴酚兰，溴酚兰，5 ml 甘油，加蒸馏水定容甘油，加蒸馏水定容到到50 ml。v电极缓冲液：电极缓冲液：0.6 g tris碱，碱，2.88 g甘氨酸甘氨酸，0.1 g sdsv固定液固定液：50%甲醇，甲醇，10%冰醋酸冰醋酸v染色液：染色液：0.05%(w/v

6、)考马斯亮蓝考马斯亮蓝r-250，50%甲醇，甲醇，10%冰醋酸冰醋酸v脱色液：脱色液：7%冰醋酸，冰醋酸，5%甲醇甲醇 三、设备三、设备四、步骤四、步骤v1. e. coli bl21 (de3) 感受态的制备感受态的制备v2. 重组子转化重组子转化bl21v1）在预冷的）在预冷的ep管中加入管中加入1 l质粒质粒dna，加入，加入200 l bl21 (de3)感受态细胞，混匀后在冰浴感受态细胞，混匀后在冰浴上静置上静置30 min。v2） 42水浴热冲击水浴热冲击30 s，冰浴上放置，冰浴上放置10 min，加入加入0.8 ml soc培养液。置于培养液。置于37 振荡培养振荡培养1 h

7、。v3） 取取0.1 ml涂布于加有抗生素的涂布于加有抗生素的lb培养基平板培养基平板（50 g/ml amp）上，）上，37 培养过夜。培养过夜。 3.3.原核表达原核表达v1)挑取上述方法得到的单菌落于挑取上述方法得到的单菌落于2 ml lb液液体培养基体培养基(氨苄青霉素氨苄青霉素50 g/ml)中。同时，中。同时，bl21作为对照（不加抗生素）。于作为对照（不加抗生素）。于37培养培养至至od600为为 0.5. v2)取取20 l菌液接种菌液接种2 ml lb液体培养基液体培养基(氨氨苄青霉素苄青霉素50 g/ml), 37培养培养od600为为 0.5，v3)加入加入iptg最终浓

8、度梯度最终浓度梯度2mm ，18诱导诱导表达表达16h。v4)诱导结束后，用超声波破碎细胞。诱导结束后，用超声波破碎细胞。v5）1ml菌液加入菌液加入100l的的sds-page loading buffer，100煮沸煮沸5min。v6）取）取30l上清样品点样，分析上清样品点样，分析sds-page胶，观察表达结果。胶，观察表达结果。4.sds-pagev1) 1) 按下表配方制备按下表配方制备sds-pagesds-page凝胶，凝胶，加样。先加样。先10 ma10 ma恒流电泳至分离胶，恒流电泳至分离胶，再调为再调为15 ma15 ma恒流到电泳结束。恒流到电泳结束。sds-pagesds-page胶配方胶配方组分组分 12%分离胶分离胶(ml) 3.9%浓缩胶浓缩胶(ml) 丙烯酰胺贮液丙烯酰胺贮液 60.654triscl/sds, ph 8.83.754triscl/sds, ph 6.8 1.25ddh2o5.253.0510%过硫酸铵过硫酸铵 0.050.025temed 0.010.005v2) 考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色v（1）：将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定）：将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定2