疟原虫的镜检技术

1、疟原虫的疟原虫的RDT检测检测及镜检技术及镜检技术丰城市疾病预防控制中心丰城市疾病预防控制中心检验科：黄曾检验科：黄曾2014-7-15实验室实验室1.1.病原学诊断：显微镜血涂片检查结果阳性；病原学诊断：显微镜血涂片检查结果阳性；这种镜检确这种镜检确诊最可靠。诊最可靠。2.2.免疫学诊断：（免疫学诊断：（1 1）循环抗原的检测）循环抗原的检测 （2 2）循环抗体的）循环抗体的检测检测3.3.分子生物学技术：分子生物学技术：PCRPCR和和DNADNA探针已应用与疟疾的诊断。探针已应用与疟疾的诊断。 分子生物学、血清学技术发展迅猛，但是确诊分子生物学、血清学技术发展迅猛，但是确诊疟疾疟疾的的“

2、金标准金标准” 仍然是病原学诊断显微镜检查疟原虫。仍然是病原学诊断显微镜检查疟原虫。 快速诊断试纸条可与镜检快速诊断试纸条可与镜检疟原虫相互补充。疟原虫相互补充。 疟原虫抗原检测（一）原理 快速检测试剂是通过在硝酸纤维素膜（NC）试纸条上产生可见的条带来检测抗原的一种“免疫-层析”试剂。染色标记抗体与疟原虫抗原结合，复合物由试剂条检测线上的抗体捕获后，形成一条可见的条带（检测线）。 检测的第一步是将溶血剂与血液混合，破坏血红细胞释放疟原虫蛋白，便于与标记抗体靶蛋白结合；然后将血液与标记抗体的混合液置于硝酸纤维试纸条上，并通过毛细管作用和缓冲液/清洗剂推力，使混合液在试纸条上移动并通过检测线与对

3、照线。OptiMAL IT卡疟疾快速诊断卡疟疾快速诊断试剂盒使用说明书试剂盒使用说明书4.将吸血后的毛细管竖立于凹槽2中，捏出全部血液并与凹槽中稀释液混匀约中，捏出全部血液并与凹槽中稀释液混匀约1分钟。分钟。血膜的制作（取血时间）血膜的制作（取血时间） 采血时间 现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。 疟疾典型的临床表现分前驱期、发冷（寒战）期、发热期、疟疾典型的临床表现分前驱期、发冷（寒战）期、发热期、出汗期和间歇期五期。出汗期和间歇期五期。 间日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性。发冷（寒战）期相当于红内

4、期成熟裂殖体涨破红细胞期，镜检多为裂殖体和环状体。 发热期，发热期，外周血中以环状体（小滋养体）为主，环状体（小滋养体）为主，也可见到裂裂殖体；殖体；出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性。发作后数小时（h），间歇期外周血中以大滋养体大滋养体为主，形态较易辩认，为诊断的有利时机；发作36-48h，可检出裂殖体；发作1-2次后，配子体配子体出现较多。 恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20h内取血，初发患者退热后常查不到原虫。 末梢血血检到恶性疟原虫配子体，是在末梢血出现环状体之后的10天左右。血膜的制作血膜的制作（取血操作）（取血操作） 在采集标本、制作血片前，首先要核在采集标本、制作血片前，首先

5、要核对患者的姓名、年龄和住址。对患者的姓名、年龄和住址。 采血部位和方法：采血部位和方法：采血部位一般人为耳垂，指头；一人一针，常规消毒、采血。 取血部位和血量取血部位和血量 采血部位和取血方法：采血部位和取血方法： 耳垂或无名指（婴幼儿母耳垂或无名指（婴幼儿母趾或足跟），趾或足跟），通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒大米（即火柴头）大小。 血膜的制作血膜的制作用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜薄血膜；一种是血液涂

6、成圆盘，称厚血膜厚血膜。无特殊要求的可厚薄血膜分载玻片涂制。发热病人血片发热病人血片标本片标本片血膜的制作血膜的制作（涂片操作）（涂片操作） 涂制厚、薄血膜的位置涂制厚、薄血膜的位置 通常将厚、薄血膜涂在一张通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法是将载片分为载玻片上。方法是将载片分为6 6等分，第等分，第1 1、2 2格备贴格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第标签及编号用；厚血膜涂在第3 3格中央，薄血膜涂在格中央，薄血膜涂在第第4 4格前缘至第格前缘至第6 6格中部。作为标本的血片每张玻片涂格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各厚、薄血膜各1 1个；门诊和发热病人血片每片个；门诊和发热病人

7、血片每片1 1人，涂人，涂2 2个厚血膜个厚血膜1 1个薄血膜，个薄血膜， 以防血膜脱落而影响检查；以防血膜脱落而影响检查； 标本片发热病人血片标签薄血膜的制作薄血膜的制作 薄血膜 用推片一端边缘的中点从取血部分取约取约11.5微升的血量（相当于微升的血量（相当于1/4火柴头大小），火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成并形成25350夹角夹角，待血液向两侧扩展约 2cm2.5cm宽时宽时，均匀而迅速地从右向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。推制时速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹角大小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相

8、接触而不相互重叠。薄血膜外观：舌状厚薄血膜外观：舌状厚薄均匀，无划痕，薄均匀，无划痕，位于玻片位于玻片1/21/3处【处【左半部左半部分（或第分（或第46份）】份）】 。熟练工作者的推片姿势熟练工作者的推片姿势厚血膜的制作厚血膜的制作 厚血膜 用推片的左下角，从取血部位刮取约约45微升血量（相当于火柴头大小），微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径直径0.81cm大小圆形大小圆形厚血膜厚血膜(厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到510个自细胞为宜)，厚血膜的位置，位于厚血膜的位置，位于玻片右玻片右1/3处处中央偏右（或中央偏右（或6等份

9、中的与贴标签等份中的与贴标签的的1、2份相邻的第份相邻的第3份中部）份中部） 。厚血膜外观：厚血膜外观：圆形厚薄均匀，无划痕。圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求，以油镜视野5-10个WBC为宜。标准的疟疾厚薄血膜位置标准的疟疾厚薄血膜位置各种不同的疟疾血片涂制法：各种不同的疟疾血片涂制法：标准血片标准血片（1人）门诊发热病人血片门诊发热病人血片（1人）居民普查血片居民普查血片（2人）血膜的制作血膜的制作血膜编号 血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的号码，以防差错；待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。染液的种类染液的

10、种类 染液种类：疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是瑞氏（瑞氏（Wright stainWright stain）和吉氏染液（和吉氏染液（Giemsa stainGiemsa stain）。）。这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂多色性染剂。 我们主要用吉氏染液，它具有方便，染色效果稳定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色时间短，但染色效果不如吉氏稳定，主要在门诊量大的门诊实验室使用。染液的种类及染色原理染液的种类及染色原理注意注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染液染液的的pHpH值值7.0-7.27.0-7.2

11、较好。较好。 染液偏酸染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合，使红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞和原虫的胞淋巴细胞和原虫的胞浆着色较差浆着色较差；反之，当染液偏碱染液偏碱时，红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫蓝色，不易观察。姬氏染液母液配置方法姬氏染液母液配置方法 取姬氏粉0.5克置于研钵中，加25ml甘油充分研磨，倒入60或100ml带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液混入瓶内，至25ml甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于5560水浴中或温箱内24h或室温内35天，多加摇动，即成原液。姬氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经久不

12、变。 材料：材料： 1、姬氏粉、姬氏粉0.5克克 2、甘油、甘油25ml 3、甲醇、甲醇25ml 注意事项：注意事项： 1.1.高纯度试剂。高纯度试剂。 2.2.所用器皿绝对无水（伊红在水溶液所用器皿绝对无水（伊红在水溶液内遇到美蓝或天青即可互相化合而产内遇到美蓝或天青即可互相化合而产生沉淀，从而失去染色力）。生沉淀，从而失去染色力）。 3.3.边加边磨，充分研磨；整个染色液边加边磨，充分研磨；整个染色液配制时间不能少于配制时间不能少于5 5个小时。个小时。 姬氏染液的染色方法姬氏染液的染色方法 先用甲醇或无水酒精固定薄血膜,再用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后再进行染色。 注意：吸取母液时，不

13、要晃动瓶子吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色以免沉淀物泛起影响染色效果效果. 成批血片染色成批血片染色：将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（根据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。 单张血片染色单张血片染色：将处理好的血膜，加姬氏母液1-21-2滴滴，加中性蒸馏水15-3015-30滴滴，染色30分钟左右，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。 较理想的染色结果是红细胞为淡红或

14、淡紫红色，疟原虫的胞质呈蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。操作操作1 （快染）（快染） 配制配制5%染液，（每张血片约需染染液，（每张血片约需染液液2ml）：量筒内量：量筒内量2ml缓冲液或新鲜凉开水，缓冲液或新鲜凉开水，直接滴加吉氏原液直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干，清水细缓冲洗，晾干镜检。镜检。（一般配制（一般配制5%-10%，染色时间短，一定掌握好时间。），染色时间短，一定掌握好时间。）操作操作2 (慢染慢染)配制配制3%染液：在染色量筒内量染液：在染色量筒内量2ml蒸馏蒸馏水或新鲜凉开水，

15、水或新鲜凉开水， 再滴加吉氏原液再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴，混匀，滴入待染标本上，染色滴入待染标本上，染色3040min。清水细缓冲。清水细缓冲洗，晾干镜检。洗，晾干镜检。（一般配制（一般配制2.5%-3%染液，染色效果稳定。）染液，染色效果稳定。）吉氏染液浓度吉氏染液浓度门诊染色门诊染色血片制作与染色注意事项血片制作与染色注意事项 使用前载玻片一定要清洁，否则会影响血片制作和镜检结果。 厚血膜干燥时勿加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果。 配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量。 固定薄血膜时勿将甲醇触碰到厚血膜。 冲洗染液时，水流轻缓，勿冲走厚血膜。1.在学习镜检疟原虫之前，必

16、须先对正常厚薄血膜中各种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。2.镜检疟原虫，首先学看薄血膜，在基本上掌握薄血膜中疟原虫形态后，再学习镜检厚血膜。3.镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类时参考和血片编号之用。4.镜检疟原虫须用油镜头配合5X低倍目镜镜检，当发现疑难问题时再调换10X目镜进行观察。5.检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下，自左至右（或由右至左），一行接一行，一个视野稍叠一个视野顺序地查完整个血膜。 一般情况下，厚血膜四周（稍薄些）疟原虫数量较厚血膜四周（稍薄些）疟原虫数量较多，且形态较清楚，镜检时不要忽略。每张厚血膜检多，且形态较清楚，镜检时不要忽略。每张厚血

17、膜检查时间最少不低于查时间最少不低于2020分钟。分钟。血片的镜检血片的镜检薄血膜中常见的血液成分薄血膜中常见的血液成分中性粒细胞嗜酸性粒细胞血小板单核细胞淋巴细胞红细胞薄血膜疟原虫形态薄血膜疟原虫形态间日疟间日疟 环状体环状体感染的红细胞：感染的红细胞：胀大胀大不明显，基本正常。不明显，基本正常。虫体大小：虫体大小：较大，约较大，约为红细胞直径为红细胞直径1/3。胞浆：胞浆：环状，浅蓝色。环状，浅蓝色。核：核：红色，一个，偶红色，一个，偶有二个。有二个。疟色素：疟色素：无。无。 约占寄生红细胞的约占寄生红细胞的1/31/3，很少见到一个红细胞，很少见到一个红细胞寄生寄生2 2个环状体和一个环

18、状体有个环状体和一个环状体有2 2个核。个核。 薄血膜疟原虫形态薄血膜疟原虫形态间日疟间日疟 环状体环状体感染的红细胞：感染的红细胞：胀大胀大不明显，基本正常。不明显，基本正常。虫体大小：虫体大小：较大，约较大，约为红细胞直径为红细胞直径1/3。胞浆：胞浆：环状，浅蓝色。环状，浅蓝色。核：核：红色，一个，偶红色，一个，偶有二个。有二个。疟色素：疟色素：无。无。薄血膜疟原虫形态 恶性疟恶性疟环状体环状体感染的红细胞：大小正常,颜色较深。虫体大小：较小，约为红细胞直径1/5-1/6。胞浆：蓝色，环状纤细,有时位于红细胞的边缘。常见多个原虫同寄生于一红细胞的现象。核：红色一个,常有二个。疟色素：无。

19、恶性疟原虫恶性疟原虫-环状体环状体环纤细,约为RBC直径的1/6，RBC不胀大核1个，但2个常见，红细胞常含2个以上原虫薄血膜间日疟大滋养体形态薄血膜间日疟大滋养体形态感染的红细胞：感染的红细胞：胀大褪色，胀大褪色，出现形状大小相等、分出现形状大小相等、分布均匀、数目较多、鲜布均匀、数目较多、鲜红色的薛氏小点。红色的薛氏小点。虫体大小：虫体大小：较大。较大。胞浆：胞浆：不规则，浅蓝色，不规则，浅蓝色，出现阿米巴伪足，有空出现阿米巴伪足，有空泡。泡。核：核： 红色，一个。红色，一个。疟色素：疟色素：有，细小杆状，有，细小杆状，黄褐色，分布不均匀。黄褐色，分布不均匀。间间 日日 疟疟 大大 滋滋

20、养养 体体 虫体不规则，较大；虫体不规则，较大；阿米巴样空泡明显；阿米巴样空泡明显；疟色素细小，黄褐色。疟色素细小，黄褐色。 间日疟大滋养体间日疟大滋养体恶性疟大滋养体恶性疟大滋养体受感染红细胞：受感染红细胞：大小正常，颜色较深，可出现较粗、大小不一、分布不匀、数目较少红色茂氏小点。虫体大小：虫体大小：较小。胞浆：胞浆：蓝色，圆形，坚实，体积小。核：核：一个，红色。疟色素：疟色素：较细的黑褐色颗粒，常集成块。 恶性疟大滋养体红细胞：胀大，褪色，可有薛氏小点。胞浆：较不规则，空泡小或消失，浅蓝色。核： 红色，分裂为二个以上。色素：黄褐色，分布不均匀。间日疟间日疟未成熟裂殖体未成熟裂殖体薄血膜疟原

21、虫形态薄血膜疟原虫形态间间日日疟疟未未成成熟熟裂裂殖殖体体 恶性疟未成熟裂殖体红细胞：红细胞：大小正常，颜色较大小正常，颜色较深，可有茂氏小点。深，可有茂氏小点。大小：大小： 较小。较小。胞浆：胞浆：规则，圆形或卵圆形，规则，圆形或卵圆形，蓝色。蓝色。核：核：分裂为二个以上，红色分裂为二个以上，红色。色素：色素：黄褐色颗粒，常集成黄褐色颗粒，常集成黑褐色团块。黑褐色团块。间日疟间日疟成熟裂殖成熟裂殖体体红细胞红细胞：胀大，褪色，可见：胀大，褪色，可见薛氏小点。薛氏小点。大小大小：个体较大。：个体较大。胞浆和核胞浆和核：裂殖子：裂殖子1224个，个，通常为通常为1618个，排列不规个，排列不规则

22、，核红色，胞浆浅蓝色。则，核红色，胞浆浅蓝色。疟色素疟色素：黄褐色，常集于疟：黄褐色，常集于疟原虫的一边。原虫的一边。间日疟裂殖体间日疟裂殖体恶性疟恶性疟成熟裂殖体成熟裂殖体红细胞红细胞：大小正常，颜色大小正常，颜色 较深，可见茂氏小点。较深，可见茂氏小点。大小大小：虫体较小。虫体较小。胞浆和核胞浆和核：裂殖子裂殖子832 个，通常为个，通常为818个，个， 排列不规则，核红色，排列不规则，核红色，胞浆蓝色。胞浆蓝色。色素色素：黑褐色，集中于中黑褐色，集中于中央或一侧。央或一侧。恶性疟成熟裂殖体恶性疟成熟裂殖体 裂殖子裂殖子8 83232个，通常个，通常8 81818个，个，排列不规则排列不规

23、则疟色素集中成团块状疟色素集中成团块状虫体占红细胞体积的虫体占红细胞体积的2/32/3至至3/4 3/4 薄血膜间日疟雌（大）配子体形态薄血膜间日疟雌（大）配子体形态形状大小形状大小：圆形或椭圆形，较大。胞浆胞浆：深蓝色。核核：一个，较小，深红色，常偏于一边，核周可见明显不染色带。疟色素疟色素：黄褐色，均匀散在，数目较多。间日疟原虫雌配子体间日疟雄（小）配子体形态形状大小形状大小：圆形，虫体较大。胞浆胞浆：浅蓝色。核核：一个，较大，疏松，位于中央，浅红色，周围有明显不着色带。疟色素疟色素：黄褐色，散在分布。间日疟原虫雄配子体恶性疟恶性疟雌（大）配子体雌（大）配子体形态形态形状形状：新月形，两端稍尖。胞浆胞浆：深蓝色。核核：一个，较小，致密，深红色，位于中央，核周可见透明不染色带。疟色素疟色素：黑褐