新一代测序技术的原理（课堂PPT）

1、Next-generation sequencing technology overview2Agenda 测序技术简史 第一代测序技术 第二代测序技术 第三代测序技术31950196019701980199020002010Development of Sanger Sequencing(1977)Invention of Automated FluorescentSequencer(1985)Invention of CapillarySequencer(1996)Invention of Applied BiosystemsSolid System(2007)Invention of I

2、llumina Genome Analyzer System(2006)Invention of 454 GS 20 Sequencer(2005)chemical degradation method by Maxam-Gilbert method(1977)Chemical degradation method by Whitfield (1954)Invention of Heliscope single molecular sequencerInvention of Single molecule real time(SMRT) DNA sequencingInvention of N

3、anopore single molecular sequencing (Oxford Nanopore corporation)Invention of personal genome machineInvention of optical mappingsystem4 1977年，英国人Fred Sanger 发现，如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。 不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。 由此诞生了以Sanger命名的测序原理即双脱氧链终止法测序原理。5ONHHO HHO HHC H2OPO

4、 HOO H（ H ）ONHHO HHO HHC H2OPO HOO H（ H ）ONHHO HHO HHC H2OPO HOO H（ H ）ONHHO HHO HHC H2OPO HOO H（ H ）（H）ONHHOHHOHHCH2OPOOHOONHHOHHHCH2OPOHOOH（H）5 磷酸磷酸3 羟基羟基3 ,5 -磷酸二磷酸二酯键酯键核苷酸形成3,5-磷酸二酯键示意图核酸序列形成的基础67TemplatePrimerdNTPPolymeraseTerminatorCGTA终止物标记方法因为颜色不同，4种终止物可以在一起进行反应。89103730 xl Sequence Map11200

5、520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche 454Genome Analyzer/Hiseq 2000ABI SOLiDNext-generation sequencing/Deep sequencing technology main platforms12454测序原理 测序反应以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板，在每一轮测序反应中，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入，每次只进入一个碱基。如果这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释

6、放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光。 通过检测荧光信号释放的有无和强度，确定被测分子的序列。光信号由CCD摄像机检测并反应为峰。每个峰的高度（光信号）与反应中掺入的核苷酸数目成正比。 反应结束后，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。13454测序流程14待测DNA文库的构建将基因组DNA/cDNA片段打断至400-800bp，将用于后继的扩增测序的接头A和一段含有生物素的接头B连接到DNA片段上，会产生含有接头AA、AB、BB、BA四种DNA片段，然后与可结合生物素的磁珠结合

7、，其中片段AA被洗脱掉，片段ABBABB结合到磁珠上，通过变性处理回收含有接头A和接头B的单链DNA。15Emulsion PCR将这些ssDNA分别单独与水油包被的直径大约28 m的磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增, 扩增产物仍可以结合到磁珠上。反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步测序反应所需的模板量。16测序 将携带DNA的磁珠与其他反应物混合物

8、，放入PTP板中进行测序。 PTP板上含有很多直径约为44 m的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法固定每个磁珠的位置以监测接下的测序反应。17454的特点 较高的测序通量，每个循环能产生总量为400-600 Mb的序列。 提高测序读长，长度达到400 bp，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。 主要缺点是无法准确测量同聚物的长度。例如当待测序列中出现Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。因此454技术主要的错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。18200520062007BirthdayPrinc

9、iplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche 454Genome Analyzer/Hiseq 2000ABI SOLiDNext-generation sequencing/Deep sequencing technology main platforms1920n=degenerate bases z=universal bases21222324252627282930SOLiD的特点 通量大 成本低 序列短 Ligase的方式虽然能一定程度避免phasing/pre-phasing，但增加的复杂

10、度也降低了效率 灵活性差，对小数据量测序不适用 Two-base coding31200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche 454Genome Analyzer/Hiseq 2000ABI SOLiDNext-generation sequencing/Deep sequencing technology main platforms323334CTAGCTA5-3-5GT合成第一个碱基合成第一个碱基Cycle 1:按顺序加入反应试剂按顺序加入反应试

11、剂清除未反应的碱基和试剂清除未反应的碱基和试剂激发碱基荧光并收集荧光信号激发碱基荧光并收集荧光信号 去除阻断基团和荧光基团去除阻断基团和荧光基团Cycle 2-n:重复前面的步骤重复前面的步骤G TCTA GT CTGCTAGA35 制备芯片制备芯片模板杂交模板杂交桥式桥式PCR扩增扩增测序引物准备测序测序引物准备测序2 测序测序测序测序生成生成 base calls3 数据分析数据分析拍照图片拍照图片IntensitiesReadsAlignments4DNA打断打断末端修复末端修复加加A加接头加接头纯化纯化 文库制备文库制备136 37Fragment DNA535+355+53351.E

12、nd repair T4 polymerase , DNA Pol 1 (Klenow fragment)35po4po453PhosphorylationT4 polynucleaotide kinase, ATP3.Ligation of adaptors3Apo45A35po42.Add 3 Adenosine with Klenow (3exo- ) and dATP+DNA insert5533SBS oligoP7 反向互补序列反向互补序列3T5po435SBS oligoP7反向互补序列反向互补序列38PCR enrichment5533555533331st round PCR

13、P7P5SBS oligoP7 反向互补序列反向互补序列P7339PCR enrichment (cont.)5533535353532nd round PCRInsertP7P5SBS oligoP7 反向互补序列反向互补序列P5Cluster templateSBS oligoP7404142Cluster 生成步骤:固定扩增线性化 阻断引物杂交Cluster 生成化学步骤cBOT43进样孔出样孔44OHFlow Cell接头diol P7 P5 dioldiol模板杂交dioldiol 延长dioldiol 变性45dioldiol1st cycle 变性1st cycle 退火diol

14、diol1st cycle 延长dioldioldioldiol2nd cycle 变性2nd cycle 退火dioldioldioldioldioldiol2nd cycle 延长n=35总数46线性化线性化OH用ddNTP ( )阻断阻断Cluster 扩增扩增完成完成OHdioldiolOHPrimer加测序引物加测序引物OHNaIO44748YX49123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T 503.3 测序 Single ReadPaired End51Template Hybridization模板杂交UUOHOH Grafted f

15、lowcell芯片上的接头U P7 P5 Initial extension 第一链的延长UU Denaturation 变性UU521st cycle denaturation 变性n=25totalUU1st cycle annealing退火UU1st cycle extension延长UU2nd cycle denaturation再变性UU2nd cycle annealing退火UUU2nd cycle extension延长UUU53Cluster Amplification扩增后的簇UUP5 Linearization(USER)线性化Block with ddNTPs阻断Primer加测序引物54SBS进行测序Sequencing First Read第一端测序Denaturation and De-Phosphorylation(PNK)变性与去磷酸化OHOHResynthesi