不可忽视的细血液基因组提取PPT课件

1、pDNADNA提取的原则提取的原则p基因组提取方法基因组提取方法p样本保存和前处理样本保存和前处理p基因组提取流程基因组提取流程pDNADNA保存及检测方法保存及检测方法p试剂选择原则试剂选择原则 内容内容第1页/共27页没有严格要求没有严格要求: PCR Southern Blots RFLP严格要求片段长度严格要求片段长度: 构建文库构建文库 PFGE(脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳)DNA LengthDNA提取原则提取原则1：DNA片段长度片段长度第2页/共27页没有严格要求没有严格要求 常规常规PCR严格要求产物纯度严格要求产物纯度 存档、产物长期保存存档、产物长期保存 Souther

2、n杂交杂交 荧光定量荧光定量PCR SNP Microarray CGH (比较基因组杂交比较基因组杂交) DNA提取原则提取原则2：DNA产物纯度产物纯度第3页/共27页pDNADNA提取的原则提取的原则p基因组提取方法基因组提取方法p样本保存和前处理样本保存和前处理p基因组提取流程基因组提取流程pDNADNA保存及检测方法保存及检测方法p试剂选择原则试剂选择原则 内容内容第4页/共27页基因组提取方法基因组提取方法p溶液盐析法：溶液盐析法：无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高p硅胶膜吸附法：硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸利用硅胶膜特异吸

3、附核酸的原理来纯化核酸p磁珠法：磁珠法：独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目的。条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目的。p传统酚氯仿法：传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害身传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害身体健康。体健康。第5页/共27页pDNADNA提取的原则提取的原则p基因组提取方法基因组提取方法p样本保存和前处理样本保存和前处理p基因组提取流程基因组提取流程pDNADNA保存及检测方法保

4、存及检测方法p试剂选择原则试剂选择原则 内容内容第6页/共27页样本保存和前处理样本保存和前处理抗凝血液抗凝血液p保存保存 柠檬酸、柠檬酸、EDTAEDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用作用, ,采血时如没有特殊要求采血时如没有特殊要求, ,请使用柠檬酸或请使用柠檬酸或EDTAEDTA处理血样。处理血样。加入抗凝剂混匀后加入抗凝剂混匀后2-82-8保存一周；保存一周；2020保存一个月；保存一个月；7070长期保存。长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。尽可能保证样本不经过反复冻融。p样本前处理样本前处理p 1.

5、1. 冻存的抗凝血液使用前溶解应在冻存的抗凝血液使用前溶解应在3737水浴迅速溶解。水浴迅速溶解。2. 2. 抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。第7页/共27页样本保存和前处理样本保存和前处理非抗凝血非抗凝血p保存保存 非抗凝血即血凝块。非抗凝血即血凝块。-20-20保存一个月；保存一个月；-70-70长期保存。尽可能保证样本长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。不经过反复冻融。p样本前处理样本前处理1.1. 冻存的血凝块使用前应在冻存的血凝块使用前应在3737水浴溶解，轻柔颠倒混匀。水浴溶解，轻柔颠倒混匀。 2. 2. 血凝块取

6、出后先采取机械破碎的方法（例如：放入无粉橡胶手套中捏血凝块取出后先采取机械破碎的方法（例如：放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越容易！血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越容易！第8页/共27页样本保存和前处理样本保存和前处理白膜层白膜层p保存保存 全血分离得到的白膜层放置全血分离得到的白膜层放置-20-20或或-70-70长期保存。尽可能保证样本不经长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。过反复冻融。p样本前处理样本前处理p 1. 1. 白膜层是将全血离心取中

7、间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解红细胞后得到的沉淀。裂解红细胞后得到的沉淀。2. 2. 冻存的白膜层使用前应在冻存的白膜层使用前应在3737水浴溶解，轻柔颠倒混匀。水浴溶解，轻柔颠倒混匀。 3. 3. 虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液 还是必要的，但用量减半。还是必要的，但用量减半。p 4. 4. 采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行操作。即：进行操作。即：1ml1m

8、l全血得到的白膜层提取时需要加入提取全血得到的白膜层提取时需要加入提取1ml1ml全血的试剂全血的试剂量。量。第9页/共27页样本保存和前处理样本保存和前处理血清血清/ /血浆血浆p保存保存 现在很多科研者使用血清现在很多科研者使用血清/ /血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。分离得到的血清分离得到的血清/ /血浆放置血浆放置-70-70保存。尽量避免样本反复冻融。保存。尽量避免样本反复冻融。p样本前处理样本前处理1.1. 冻存的血清冻存的血清/ /血浆使用前溶解应在血浆使用前溶解应在3737水浴溶解，轻柔颠倒混匀。水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.

9、2. 血清血清/ /血浆核酸提取时无需红细胞裂解。血浆核酸提取时无需红细胞裂解。3. 3. 只需只需100-200ul100-200ul样本，基本能满足下游常规样本，基本能满足下游常规PCRPCR或荧光定量或荧光定量PCRPCR检测。检测。第10页/共27页样本保存和前处理样本保存和前处理微量血液微量血液/ /干血点干血点/ /羊水羊水/ /胸水胸水p保存保存 微量血液：抗凝血液微量血液：抗凝血液-20-20或或-70-70保存；保存；干血点：干燥后室温或干血点：干燥后室温或44保存；保存；羊水：羊水： -20-20或或-70-70保存。保存。p样本前处理样本前处理1.1. 微量血液处理同抗凝

10、血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。2. 2. 干血点加入缓冲液直接进行提取。干血点加入缓冲液直接进行提取。3. 3. 羊水羊水/ /胸水提取时先离心得到沉淀，再进行裂解提取核酸。胸水提取时先离心得到沉淀，再进行裂解提取核酸。第11页/共27页样本保存和前处理样本保存和前处理口拭子口拭子/ /漱口水漱口水p保存保存 口拭子：干燥后室温保存口拭子：干燥后室温保存漱口水：漱口水：44保存或离心得到沉淀保存或离心得到沉淀-20-20或或-70-70保存保存p样本前处理样本前处理1. 1. 拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提

11、取。拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提取。2. 2. 有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心得到沉淀再进行核酸提取。得到沉淀再进行核酸提取。3. 3. 漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸提取。漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸提取。第12页/共27页pDNADNA提取的原则提取的原则p基因组提取方法基因组提取方法p样本保存和前处理样本保存和前处理p基因组提取流程基因组提取流程pDNADNA保存及检测方法保存及检测方法p试剂选择原则试剂选择原则 内容内容第13页/共27页基因组提取流程基因组提取流程

12、加入吸附柱缓冲液漂洗DNA洗脱收集样本裂解纯化去蛋白沉淀核酸洗涤去盐溶解DNA沉淀样本裂解溶液法（盐析法）溶液法（盐析法）吸附柱法吸附柱法第14页/共27页红细胞裂解红细胞裂解 哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞对核酸提取非常重要。红细胞裂解有两种方式：对核酸提取非常重要。红细胞裂解有两种方式：p采用红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照采用红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照3 3倍全血体积加倍全血体积加入进行裂解入进行裂解).).采用细胞裂解液进行裂解（采用细胞裂解液进行裂解（TIANG

13、ENTIANGEN的细胞裂解液的细胞裂解液CLCL是按照是按照倍全血体倍全血体积），细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞，得到的为细积），细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞，得到的为细胞核沉淀，更方便基因组胞核沉淀，更方便基因组DNADNA的提取。的提取。红细胞裂解充分的现象：红细胞裂解充分的现象：得到的沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进得到的沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进行两次裂解，注意第二次加入裂解液后需要将沉淀行两次裂解，注意第二次加入裂解液后需要将沉淀votexvotex彻底混匀。彻底混匀。第15页/共27页核细胞裂解核细胞裂解p如果有裂红的步骤，

14、请尽量将上清去除再加入裂解液。如果有裂红的步骤，请尽量将上清去除再加入裂解液。p加入裂解液（如：加入裂解液（如：TIANGENTIANGEN试剂盒中的试剂盒中的GBGB或或FGFG）和蛋白酶）和蛋白酶K K需要彻底混匀。需要彻底混匀。将沉淀打散混匀后再进行水浴。将沉淀打散混匀后再进行水浴。p水浴时看到溶液变清，没有粘稠物或沉淀时即可进行下步操作，通常水浴水浴时看到溶液变清，没有粘稠物或沉淀时即可进行下步操作，通常水浴时间时间10-30min.10-30min.p若采用有机（酚若采用有机（酚/ /氯仿）抽提时应充分混匀，动作要轻柔。离心分离两相氯仿）抽提时应充分混匀，动作要轻柔。离心分离两相时，

15、应保证一定的转速和时间，且吸取上清时注意不要吸取到中间层及有时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时注意不要吸取到中间层及有机相。机相。第16页/共27页核酸吸附或沉淀核酸吸附或沉淀p硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法1. 1. 加入乙醇颠倒混匀后可能会出现絮状沉淀，动作要轻柔。加入乙醇颠倒混匀后可能会出现絮状沉淀，动作要轻柔。2. 2. 将裂解的溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱里，此时的溶液应是高盐将裂解的溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱里，此时的溶液应是高盐低低pHpH值的。通过硅胶膜特异吸附核酸的特性将裂解溶液中的核酸吸附到硅值的。通过硅胶膜特异吸附核酸的特性将裂解溶液中的核酸吸附到硅胶膜上。胶膜上。

16、p溶液法溶液法1. 1. 当沉淀时间有限时，用预冷的异丙醇沉淀，沉淀会更充分。当沉淀时间有限时，用预冷的异丙醇沉淀，沉淀会更充分。2. 2. 加入异丙醇颠倒混匀后应出现丝状沉淀，动作要轻柔，避免基因组因加入异丙醇颠倒混匀后应出现丝状沉淀，动作要轻柔，避免基因组因过于猛烈的外力而降解。过于猛烈的外力而降解。3. 3. 分离沉淀的方法：分离沉淀的方法：a.a.用枪头小心地将丝状沉淀挑出；用枪头小心地将丝状沉淀挑出；b.b.离心分离，应离心分离，应保证一定的转速和时间。保证一定的转速和时间。第17页/共27页核酸洗脱或溶解核酸洗脱或溶解p硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法1. 1. 用去蛋白液、漂洗液将膜上的

17、核酸漂洗后，将不加溶液的吸附柱离心用去蛋白液、漂洗液将膜上的核酸漂洗后，将不加溶液的吸附柱离心以去除残留的液体及挥发乙醇成分。加入适量洗脱液以去除残留的液体及挥发乙醇成分。加入适量洗脱液TB bufferTB buffer（或自己（或自己配制的配制的bufferbuffer）后放置）后放置5-10 min5-10 min后再进行离心得到基因组后再进行离心得到基因组DNADNA。p溶液法溶液法1. 1. 使用使用70-7570-75乙醇对核酸沉淀进行洗涤。溶解乙醇对核酸沉淀进行洗涤。溶解DNADNA前需要室温或前需要室温或3737放放置几分钟晾干核酸（使乙醇挥发），然后再加入适量的置几分钟晾干核

18、酸（使乙醇挥发），然后再加入适量的TB bufferTB buffer（或自（或自己配制的己配制的bufferbuffer）溶解）溶解DNADNA。第18页/共27页pDNADNA提取的原则提取的原则p基因组提取方法基因组提取方法p样本保存和前处理样本保存和前处理p基因组提取流程基因组提取流程pDNADNA保存及检测方法保存及检测方法p试剂选择原则试剂选择原则 内容内容第19页/共27页 浓度：100100300ng/ul300ng/ul 纯度：任何杂质都可能导致DNADNA在储存过程中的降解，因此要确保纯化得到的核酸的纯度。 温度：纯化得到基因组DNADNA之后需将DNADNA溶液分装保存到

19、-20-20，反复冻溶会导致DNADNA的降解。 溶解DNA BufferDNA Buffer：纯化得到的基因组DNADNA最好溶解在TB Buffer TB Buffer (TIANGEN) (TIANGEN) 或者TrisTris缓冲液里，因为大片段的基因组DNADNA在酸性水溶液中不稳定，易水解。核酸保存核酸保存第20页/共27页 纯度（纯度（ OD260-320 /OD280-320 OD260-320 /OD280-320 ） 紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在之间，通常离心柱法稀释45倍；溶液裂解法稀释2030倍）OD260-320 /OD280-32

20、0 1.9 说明有部分降解或有RNA污染 得率得率 紫外分光光度计进行测量YieldYield OD260OD26050ng/ul50ng/ul稀释倍数DNA检测方法检测方法紫外分光光度法紫外分光光度法第21页/共27页Tiangen 产品提取得率产品提取得率产品详细细节请直接点击产品名称样本样本处理量处理量DNA/RNA得率得率（g）推荐试剂盒推荐试剂盒哺乳动物全血哺乳动物全血100l2DP327-磁珠法基因组提取试剂盒磁珠法基因组提取试剂盒DP316- -微量样品基因组微量样品基因组DNADNA提取试剂盒提取试剂盒200l 4-12DP318-血液基因组提取试剂盒血液基因组提取试剂盒(0.

21、1-1ml)600l12-2012-201ml4-304-30DP319-血液基因组提取试剂盒血液基因组提取试剂盒(0.1-20ml)5ml100-20020ml300-700禽类、两栖类全血禽类、两栖类全血5-205-40DP318-血液基因组提取试剂盒血液基因组提取试剂盒(0.1-1ml)血凝块血凝块200-500ul1-81-8DP318/ DP319500-1000ul8-158-15DP318/ DP3191ml-5ml5-150DP319口腔拭子口腔拭子1个个0.5-3.5DP322-口腔拭子基因组提取试剂盒口腔拭子基因组提取试剂盒第22页/共27页DNA检测方法检测方法电泳检测电泳检测取2l 洗脱液1% 琼脂糖凝胶电泳, 检测DNA分子大小，纯度以及完整性TIANamp TIANamp 血液基因组DNADNA提取试剂盒提取相同血样不同起始体积的DNADNA电泳图 电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，影响正确判断。 如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。 若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明书基因组DNADNA有降解。第23页/共27页TIANampTIANamp微量样本基因组DNADNA提取试剂盒样本来源一致，分