蜂巢形棉布载体固定化米根霉产果胶酶的半连续化发酵研究毕业论文

1、蜂巢形棉布载体固定化米根霉产果胶酶的半连续化发酵研究摘 要天然纤维素（如橘皮、烟梗）是一种可再生生物质资源，但由于纤维素、半纤维、木质素和果胶等交织在一起形成紧密复杂的结构，造成微生物利用天然纤维素生产乳酸、乙醇等的困难。米根霉在一定培养条件下能产生降解果胶质的酶系。果胶酶被广泛用于食品、纺织、生物技术等领域，其市场需求量日益增长。本文采用一种研究较少但有产果胶酶能力且富有商业价值的安全菌种米根霉，结合棉布载体固定化细胞的技术进行发酵产果胶酶。采用DNS法测定果胶酶（PEC）酶活力和用粘度法测定聚半乳糖醛酸内切酶（Endo-PG）酶活力。首先从纯果胶发酵产果胶酶出发，考察了固定化发酵与游离发酵

2、差别，优化了纯果胶培养基，优化了培养条件并进行半连续发酵试验，研究了发酵液部分果胶酶酶学性质；然后优化烟梗浸液培养基，优化了培养条件并进行半连续试验，还研究了发酵液中纤维素酶活力变化情况。首先，对纯果胶发酵产果胶酶进行研究。在优化前培养基和培养条件下，固定化和游离发酵相比，固定化发酵48h就达到最大产酶量，缩短发酵时间24h，提高产酶量115%。采用单因素和正交试验法优化培养基，结果表明影响产果胶酶的因素依次为：果胶Tween80Zn2+硫酸铵。发酵培养基为：果胶2.5%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6 mmol/L，Tween80 0.15% ，K2HPO4 0.4%，KH2PO4 0.4

3、%；在此基础上采用单因素法优化培养条件，结果为：果胶2.5%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6 mmol/L，Tween80 0.15% ，K2HPO4 0.4%，KH2PO4 0.4%，转速190r/min、装液量50ml/250ml、发酵温度30C、发酵初始pH 5.0、初始孢子浓度0.75106个/mL，培24h，PEC酶活力和Endo-PG酶活力分别为973.47U/mL和165.08U/mL。通过对粗酶液作用pH和温度的研究，得到PEC和Endo-PG为酸性果胶酶，最适pH为4.5，PEC和Endo-PG最适温度分别为45 C和55 C。半连续发酵试验结果表明，在第5批次出现最高PE

4、C酶活力和Endo-PG酶活力，分别为1253.95U/mL和181.94U/mL，分别比首次提高29.8%和18.3%。然后，对烟梗浸液发酵产果胶酶进行研究。采用单因素和正交试验法优化培养基，结果表明影响产果胶酶的因素依次为：烟梗硫酸铵Zn2+Tween80。发酵培养基为：烟梗10%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6 mmol/L，Tween80 0.05%，K2HPO4 0.2%，KH2PO4 0.2%。在此基础上采用单因素法优化培养条件，结果为：烟梗10%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6 mmol/L，Tween80 0.05%，K2HPO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，发酵初始

5、pH 5.0，初始孢子浓度0.5106，30C，装液量50mL，转速170r/min，培养48h，PEC酶活力和Endo-PG酶活力最高分别为361.27U/mL和49.22U/mL。烟梗浸液发酵96h，出现纤维素酶活力高峰，滤纸酶活力和羧甲基纤维素钠酶活力分别为33.25U/mL和83.13U/mL。半连续发酵试验结果表明，在第2批次出现最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力，分别为430.83U/mL和51.73U/mL，PEC酶活力比首批次提高约22.8%。关键词：米根霉，果胶酶，聚半乳糖醛酸内切酶，固定化，半连续化发酵ABSTRCTNatural cellulose is one of

6、 the renewable resources, such as orange peel and tobacco stem, which are made of cellulose, half fiber, lignin and pectin. The intertwined combination among them leads to form a tight and complex structure, which is hard for microorganisms to digest. Hence, the production of lactic acid or ethanol

7、through using natural cellulose by microorganisms is faced with problems. Rhizopus oryzae has the ability to produce pectinolytic enzymes to degrade pectin.The remove of pectin can make separation of fiber, fiber and lignin easier. There is a growing market demand of pectinolytic enzymes for the fac

8、t that pectinolytic enzymes are widely used in the filed of food, textile, pharmaceutical, paper making, biological technology and so on. Rhizopus oryzae, which owns the ability to degrade pectin and is rich in comercial value, is used to produce pectinolytic enzymes in this research. The immobilize

9、d Rhizopus oryzae with matrix composed of asterisk-configuration fibrous matrices in a honeycomb-shaped, the production of pectinolytic enzymes were carried out from citrus pectin and tobacco stem pectin. Pectinolytic enzymes (PEC) activity was determined by DNS assay and endopolygalacturonase (Endo

10、-PG) activity was measured by viscosity method. Fistly, the pure pectin was selected as the sbustrate for fermentation. Then, the coparison of enzymes production between immobilized cells and free cells was made. After that, optimization of culture medium and growth conditions was investigated throu

11、gh single factor variable analysis and so on. Also, some properties of the enzyme were under reasearch. Finally, optimization of culture medium made from tobacco stem was investigated through single factor variable analysis and orthogonal experiment. Optimization of growth conditions was investigate

12、d through single factor variable analysis. Six batches of semi-continuous fermentation were carried out in shake flasks.First of all, the study of pure pectin was carried out. Immobilized cells had a higher production of PEC over free cells. Immobilized cells had a max production in 48 hours, which

13、saved 24 hours compared with free cells and improved production by 115%. Results of single factor and orthogonal experimental with immobilized showed the order of factors influencing the production of pectinase was: pectin Tween80 ZnSO4(NH4)2SO4.The suitable culture media was composed of pectin2.5%,

14、 (NH4)2SO4 1.5%, ZnSO40.6 mmol/L ,Tween80 0.15%, K2HPO4 0.4%，KH2PO4 0.4%，rotation speed 190 r/min, liquid volume 50 ml/250 ml, temperature 30C, initial pH 5.0, initial spore concentration 0.75106 /mL. After 24 hours, the PEC activity and Endo-PG activity were 973.47U/mL and 165.08U/mL separately. Ef

15、fects of pH and temperature on crude enzymes fluid were carried out.PEC and Endo-PG might be acidic pectinolytic enzymes. The optimum pH was 4.5 for PEC and Endo-PG, optimum temperature was 45Cand 55C respectively. The highest PEC activity and Endo-PG activity were 1253.95U/mL and 181.94U/mL in the

16、5th batch, about 29.8% and 18.3% higher than the 1st batch. Secondly, optimization of culture medium made from tobacco stem was investigated through single factor variable analysis and orthogonal experiment. Results showed the order of factors influencing the production of pectinase was: tobacco ste

17、m (NH4)2SO4ZnSO4Tween80. The suitable culture media was composed of tobacco stem 10%, (NH4)2SO4 1.5%, ZnSO40.6 mmol/L,Tween80 0.05%, K2HPO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，rotation speed 170 r/min, liquid volume 50 ml/250 ml, temperature 30C, initial pH 5.0, initial spore concentration 0.50106 /mL. After 48 hours,

18、 the PEC activity and Endo-PG activity were 361.27U/mL and 49.22U/mL separately. After 96 hours, cellulose enzyme activity reached a peak with filter paper activity of 33.25U/mL and sodium carboxymethyl cellulose activity of 83.13U/mL.The highest PEC activity and Endo-PG activity were 430.83U/mL and

19、 51.73U/mL in the 2nd batch. PEC activity was about 22.8% higher than the 1st batch.Keywords: Rhizopus oryzae, pectinolytic enzymes, endopolygalacturonase, immobilization, semi-continuous fermentation目 录摘 要IABSTRCTII1绪论11.1问题的提出及研究意义11.1.1问题的提出11.1.2研究意义21.2国内外研究现状21.2.1果胶分布、化学结构和分类21.2.2果胶酶分类和作用方式3

20、1.2.3果胶酶生产菌种41.2.4真菌果胶酶的表达调控61.2.5 微生物果胶酶条件优化研究现状71.2.6米根霉产果胶酶研究进展71.2.7固定化细胞产果胶酶的进展81.2.8果胶酶生产过程中的影响因素91.2.9果胶酶的应用111.2.10果胶质原料的研究121.3本课题研究的目的及主要内容121.3.1研究目的121.3.2本课题研究的主要内容121.3.3创新点132.棉布载体固定化发酵产果胶酶的研究142.1前言142.2材料和方法142.2.1菌种142.2.2主要仪器和试剂142.2.3培养基152.2.4载体的制备152.2.5发酵培养方法152.2.6分析方法162.3结果

21、分析182.3.1酶液稀释倍数的确定182.3.2游离发酵与固定化发酵的比较192.4讨论192.4.1酶液稀释倍数对酶活力测定准确性的影响192.4.2游离发酵与固定化发酵192.5小结193固定化发酵果胶酶纯果胶培养基的优化203.1前言203.2材料和方法203.2.1菌种203.2.2主要仪器和试剂203.2.3培养基213.2.4发酵培养方法213.2.5分析方法213.3结果分析223.3.1碳源种类的选择223.3.2果胶浓度选择233.3.3氮源种类选择233.3.4硫酸铵浓度选择243.3.5 Tween80对产酶的影响253.3.6金属离子的对产酶的影响253.3.7发酵培

22、养基的正交实验263.4讨论273.4.1碳源种类及果胶浓度对产酶的影响273.4.2氮源种类及硫酸铵对产酶的影响283.4.3Tween80对产酶的影响283.4.4金属离子对产酶的影响283.4.5正交实验结果分析293.5小结294纯果胶培养基半连续发酵果胶酶304.1前言304.2材料和方法304.2.1菌种、主要仪器和试剂304.2.2培养基304.2.4发酵培养方法314.2.5分析方法314.3结果分析314.3.1转速的选择314.3.2装液量选择324.3.3温度选择324.3.4初始pH的选择334.3.5初始孢子浓度的选择334.3.6生长和产酶的时间曲线344.3.7半

23、连续发酵试验354.3.8粗酶液部分酶学性质364.4讨论374.4.1转速和装液量对产酶的影响374.4.2 pH对产酶的影响374.4.3初始孢子浓度对产酶的影响384.4.4产酶与pH变化的关系384.4.5半连续发酵的稳定性384.4.6粗酶液部分酶学性质384.5小结395. 固定化发酵果胶酶烟梗浸液培养基的优化405.1前言405.2材料和方法405.2.1试剂和设备405.2.2烟梗浸液的制备415.2.3培养基及发酵培养方法415.2.4分析方法415.3结果分析415.3.1两种制备烟梗浸液方法的比较415.3.2烟梗浓度的选择425.3.3硫酸铵浓度的选择425.3.4 Z

24、n2+离子浓度的选择435.3.5 Tween80浓度的选择435.3.6发酵培养基的正交试验445.4讨论455.4.1制备烟梗浸液方法455.4.2培养基的优化455.5小结456. 烟梗浸液培养基半连续发酵果胶酶476.1前言476. 2材料和方法476.2.1试剂和设备476.2.2烟梗浸液的制备476.2.3培养基及发酵培养方法476.2.4分析方法486.3结果分析496.3.1初始pH的选择496.3.2初始孢子浓度的选择496.3.3生长和产酶的时间曲线506.3.4半连续发酵试验516.3.5最优发酵条件下纤维素酶活力516.4讨论526.4.1发酵条件的优化526.4.2生

25、长和产酶的时间曲线526.4.3半连续发酵的稳定性536.4.4发酵过程中纤维素酶活力的变化536.5小结537.结论与展望547.1结论547.2对后续工作的展望55致 谢56参考文献57附 录62蜂巢形棉布载体固定化米根霉产果胶酶的半连续化发酵研究1绪论1.1问题的提出及研究意义1.1.1问题的提出天然纤维素原料如橘皮、烟梗、稻草、玉米秸秆等是被废弃的资源，同时由于其内部纤维素与果胶之间紧密作用造成利用生物技术转化天然纤维素原料时的困难。天然纤维素原料在进行微生物转化过程中，一般需要先进行半纤维素和木质素等预处理过程，然后进行纤维素酶解和微生物发酵产乙醇、丙醇、丁醇、柠檬酸和乳酸等。预处理

26、过程的好坏很大程度上决定了酶解的难易程度，如酶结合性和催化水解率1。果胶质的存在对半纤维、木质素去除的有一定程度的影响，主要表现在增加处理过程中溶液的粘度和溶剂的使用量。米根霉在微生物转化纤维素的众多研究中有着重要的地位。米根霉作为一种公认的安全菌，能产生广泛的代谢物，如酶类（如果胶酶等），有机酸（如乳酸等）以及生物乙醇等，有着极大商业价值2。果胶酶在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等领域都有广泛应用3，这就使得果胶酶的需求量逐年递增。果胶酶生产量占全部工业酶制剂的10%左右4，其中在食品酶的销售额中约占到了25%5。固定化米根霉的形式可视为特殊的生物活性结构单元，它可以将精制原料

27、如淀粉、葡萄糖等或是天然纤维素原料如玉米秸秆、稻草等转换为乳酸、乙醇等，但还未应用于降解果胶质产酶的研究。国内外在米根霉利用果胶质这一领域尚存在诸多空白，为数不多的研究6-12，主要着力在固态发酵产果胶酶酶性质上的研究，如聚半乳糖醛酸酶和聚半乳糖醛酸裂解酶等的性质，未涉及固定化米根霉降解果胶的研究，对产酶培养基和培养条件的研究也不足，因此降解果胶产果胶酶的能力不高。细胞固定化与细胞游离培养相比有许多优势，如细胞密度的增加，细胞产率的提高，细胞分离更加方便从而有利于半连续和连续发酵13-14。真菌细胞的固定可以通过吸附于聚合物载体或者包埋于天然聚合物(海藻酸盐凝胶和合成凝胶)。凝胶颗粒包埋细胞易

28、阻碍物质传输，影响发酵能力，还需要耗费时力制备大量凝胶颗粒。棉布载体固定化细胞的方式由于将细胞吸附于棉布表面，同时金属网状支撑骨架利于物质传输，因此菌体形态和发酵效果好。此外，棉布载体还具有重复使用性好和工业组装方便等特点，具有工业化生产的潜力15。据此，本文设想将棉布载体固定化米根霉这一生物活性单元引入到降解果胶质产酶的研究中，优化生物活性单元产酶的培养基和培养条件，并进行半连续试验，考察载体的重复使用性和稳定性。1.1.2研究意义本文试图将一种研究较少但有产果胶酶能力且富有商业价值的安全菌种-米根霉，结合以棉布载体固定化细胞的技术，用于降解果胶质的研究，有助于天然纤维素生物转换为下游产品如

29、乳酸和乙醇等，同时收获果胶酶粗酶液。1.2国内外研究现状1.2.1果胶分布、化学结构和分类果胶，最早由Bracennot在胡萝卜中提取得到的16。果胶广泛存在于高等植物的根、茎、叶和果实中，水果皮如柑橘、柠檬、柚子等含有约30%的果胶，商品天然果胶多用酸从这些果皮或果渣中提取制得。 果胶，分子式为(C6H10O6)n，相对分子质量5万-30万。果胶在高等植物初生壁和胞间层中存在，在初生壁中与木质纤维的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联作用下，使得细胞组织结构坚固, 维持细胞固有的形态。它是以-1,4糖苷键键合D-半乳糖醛酸形成的多糖主链，同时与带有鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖等中性糖侧链共价键合的聚合

30、物。果胶骨架基本单位是D-半乳糖醛酸，同时还含有如甲醇、乙酸和阿魏酸等非糖成分，其中D-半乳糖醛酸上的羧基可被甲基不同程度的脂化。一般可将果胶的结构分为光滑区和须状区, 主要由三个结构域组成，即HGA、RG-I和RG-II，其中RG-II常为二聚体形式（如图1.1 所示）。果胶有多分子、多分散、多结构，高级空间构象的特点 17。果胶质可分三类，即原果胶（protopectin）、果胶（pectin）和果胶酸（pectic acid）。1944年，果胶术语制定委员会对果胶物质作出明确的定义，具体如表1.1所示18 。表1.1果胶物质的定义Tab.1.1 The definition of pec

31、tic substances分类定义溶解性果胶酸(pectic acid, pectate)完全未甲酯化的聚半乳糖醛酸链，由D-半乳糖醛酸脱水缩合，以-1,4糖苷键连接形成的直链状聚合物微溶于水果胶(pectin, pectinate)羧基不同程度甲酯化和中和的聚半乳糖醛链，分为低酯果胶(LM)和高酯果胶(HM)可溶于水原果胶(protopectin)存在于未成熟果蔬的细胞壁中，与纤维和半纤维结合的甲酯化聚半乳糖醛酸链不溶于水图1.1 果胶的结构简图Fig. 1.1 Schematic representation of the primary structure of pectin1.2.2

32、果胶酶分类和作用方式果胶酶通常分为原果胶酶、酯酶和解聚酶三种类型：原果胶酶将不溶于水的原果胶降解为高度聚合的可溶性果胶；酯酶通过对甲基的去除，促使果胶酯水解；解聚酶打断果胶质中部分D-半乳糖醛酸的-1, 4-糖苷键，有水解酶和裂解酶之分19-20。果胶酶因其最适pH差异，又有酸性和碱性果胶酶之分21 。果胶酯酶（PE）以随机切除甲酯化果胶中的甲基的方式，导致甲醇和游离羧基的产生。这个过程遵循单链机制：即PE沿果胶分子线性切除果胶中的甲基，但去酯化作用不能进行完全，在酯化度约10%时就会停止。PE对果胶的去酯化作用，有助于聚半乳糖醛酸酶（PG）等其它果胶酶对果胶的降解。果胶水解酶，如PG、PMG

33、等均能水解果胶的糖苷键。果胶裂解酶通过消除反应使糖苷键断裂，它攻击果胶的糖苷键并在邻近羧基或酯化的羧基一边发生消除，在半乳糖醛酸的非还原末端形成 C4和 C5不饱和键。解聚酶又分内切酶和外切酶, 内切解聚酶在长链内部随机切断糖苷键, 而外切解聚酶从链的非还原性末端依次切断糖苷键 5,22 。果胶酶的分类和作用方式23，分别如表1.2和图1.2所示。表1.2 果胶酶的分类Tab.1.2 The classification of pectinolytic enzymes分类组成1.原果胶酶protopectinases, PPase2.果胶酯酶pectin esterases, PE3.果胶解聚

34、酶depolymerizing enzymes3.1水解酶pectin hydrolases聚半乳糖醛酸酶 PG内切酶(endo-PG)polygalacturonases(PG) PG外切酶(exo-PG)聚甲基半乳糖醛酸酶 PMG内切酶(endo-PMG)polymethylgalacturonases(PMG) PMG外切酶exo-PMG3.2裂解酶Pectin lyases(PL)聚半乳糖醛酸裂解酶PGL PGL内切酶endo-PGLpolygalacturonate lyases(PGL) PGL 外切酶exo-PGL聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 PMGL内切酶endo-PMGLpolym

35、ethylgalacturonate lyases(PMGL) PMGL外切酶exo-PMGL图1.2 果胶酶的作用方式Fig.1.2. Mode of action of pectinases注：(a) R =H为PG作用，R=CH3 为PMG作用；(b) R =H为PGL，R=CH3为PL。1.2.3果胶酶生产菌种微生物产果胶酶菌种，可分为真菌和细菌果胶酶产生菌，如表1.3所示。当前国内外研究最热的产果胶酶菌种是黑曲霉，多把它当作果胶酶主要来源。果胶酶是一种组合酶系，不同微生物产生的果胶酶种类和性质不同，如表1.4所示21 。米根霉（Rhizopus oryzae）：为根霉属，是接合菌亚门

36、、接合菌纲、毛霉目、毛霉科真菌。它的菌落或疏松或稠密，开始为白色，后变为灰褐色或黑褐色。菌丝体匍匐爬行，有无色、无分隔、多核和分支状的特点。它的假根十分发达，分枝呈指根或根状，呈褐色，它的最适生长温度为37C，因此可在基体表面大量存在，产生不定形菌落。米根霉广泛存在于酒曲、腐烂的植物、动物粪便和土壤等。米根霉利用农业废物，如大麦、木薯、玉米、土豆浆、燕麦和水稻等时，代谢产物为：有机酸、乙醇、水解酶（如聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶等）等，有重要工业应用价值。米根霉在一定条件下可分泌果胶酶代谢果胶质产生聚半乳糖醛酸等小分子物质。因在合适的培养基和培养条件下，米根霉利用果胶物质发酵生成的酶类大部分是果胶

37、酶，所以米根霉是一种潜在的生产果胶酶的菌种。表1.3 产果胶酶微生物分类Tab.1.3 The classification of microbial pectinolytic enzymes分类成员组成真菌主要包括：曲霉属(Aspergillus)：黑曲霉(Aspergiluts niger)米曲霉(Aspergillus oryzae) 黄曲霉(Aspergillus flavus)日本曲霉(Aspergillusjaponica)、酱油曲霉(Aspergillussojae)青霉属 (Penicilum)、镰孢属(Fusarium) 、克鲁维氏酵母(Kluyvermyoes) 其它：灰霉

38、菌(Botrytis cinerea)、镰孢菌(Fusariumspp)青霉菌(Penicilliumaxalicum)、啤酒酵母(Saccharomyces ceroisiae)细菌假单孢菌属(Pseudomonas)、黄单孢菌属(Xanthomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)表1.4 源自微生物的果胶酶的性质Table.1.4 Characterization of microbial pectinolytic enzymes成员种类最适pH最适T(C)来源产酸性果胶酶：Aspergillus niger CH4 En

39、do-pectinase,Exo-pectinase4.5-6.03.5-5.050Acuna-Arguelles et al.,1995Penicillium frequentans Endo-PG4.5-7.550Borin et al., 1996Sclerotium rolfsii Endo-PG 3.5 55Channe and Shewal, 1995Rhizoctonia solani Endo-PG4.8 50Marcus et al., 1986Mucor pusilus PG 5.040 Al-Obaidi et al., 1987Cloctridium thermosac

40、charolyticum PG5.5-7.0 30-40Rijssel et al., 1993产碱性果胶酶：Bacillus sp. RK9 PGL 10.0 Fogarty and Kelly, 1983Bacillus sp. NT-33PG 10.5 75Cao et al., 1992Bacillus polymyxa PG 8.4-9.4 45 Nagel and Vaughn, 1961Bacillus pumilis PATE8.0-8.5 60 Dave and Vaughn, 1971Amucola sp. PAL 10.25 70 Bruhlmann et al., 19

41、94Xanthomonas compestris PATE9.5 25-30 Nasumo and Starr, 1967Bacillus No. P-4-N PG 10-10.5 65 Horikoshi, 1990Bacillus stearothermophillus PATE 9.0 70Karbassi and Vaughn, 1980Penicillium italicum CECT 22941 PL 8.0 50Alana et al., 1990Bacillus sp. DT 7PL8.0 60 Kashyap et al., 2000Bacillus subtilis PAL

42、 8.5 60-65 Chesson and Codner, 1978Pseudomonas syringae pv. Glycinea PAL 8.0 30-40 Magro et al., 19941.2.4真菌果胶酶的表达调控大多数真菌PG是分泌型胞外酶且需要底物诱导，同时菌株要在诱导物存在条件下才能分泌PG，诱导物包括：果胶、聚半乳糖醛酸、低浓度半乳糖醛酸及其寡聚体，而速耗碳源（如葡萄糖等）、较高浓度果胶降解产物（如半乳糖醛酸等）、抗体以及植物PG抑制蛋白会抑制真菌表达PG24。Li 等25在核盘病菌( S1 sclerotiorum)的研究中发现：以1%橘皮果胶作为碳源的培养基中，随

43、着S1 sclerotiorum菌体量的增加，培养液中PG 活力逐步升高；在含有1%半乳糖醛酸的培养基中培养一段时间，虽然能检测到PG酶活力，但比在橘皮果胶的培养基中低，而在以葡萄糖为碳源的培养基中培养，没有检测到明显PG酶活力。Maldonado 等 26 发现Aspergiluts niger产生PG的过程可被葡萄糖完全抑制，但以前的研究已表明葡萄糖并不抑制PG 活性，也就说明培养基中葡萄糖的存在对PG 合成不利。在培养基中的葡萄糖消耗完时，菌株又可在底物的诱导作用下合成PG，这说明葡萄糖对PG产生的抑制是可逆的，进一步研究表明葡萄糖的抑制作用是发生在翻译水平上。Piccol等27发现蔗糖

44、的存在对P . expansum 产生PG 有抑制，该抑制作用发生在转录水平上且可逆。Aguilar 等28 则在曲霉研究中发现，葡萄糖对PG 合成的影响与葡萄糖浓度以及加入培养基的时间有很大关系。为解释不同碳源对合成果胶酶的影响，Ros等29 探究了碳源的不同类型对Rhizopus nigricans产果胶酶的影响，Nair 等30 则研究了不同碳源对6种曲霉产果胶酶的影响。 Stratilova 等31 对Aspergiluts niger的研究表明, 培养基pH和碳源种类可明显影响PG的合成。Geoecze 等32 对P. expansum 的研究表明，培养基中酵母提取物的存在对PG的产

45、生有着不利的影响，PG 酶活力与培养基的pH有一定的关系 ，产酶的高峰出现在培养基显酸性时。在PL的研究中，也发现受到类似调控的情况。真菌PL的产生受到低浓度的半乳糖醛酸诱导。在稳定期，高浓度果胶（5%）产酶较低，表明高浓度的半乳糖醛酸或某一代谢物会产生自我降解物阻遏。在葡萄糖存在的情况下，产酶会降低到基础水平33-35。综上，可认为作为真菌成员之一的米根霉，产果胶酶的过程如下：在果胶、聚半乳糖醛酸、低浓度的半乳糖醛酸及其寡聚体的诱导下，米根霉能较多的分泌胞外果胶酶；在快速消耗碳源如葡萄糖、蔗糖等存在的情况下，可能会抑制米根霉果胶酶的表达，该抑制作用发生在转录水平且可逆，同时添加快速消耗碳源的

46、时间点不同，对果胶酶产生有着不同影响，若在先有果胶底物存在的情况下后加入快速消耗碳源，会使产酶出现停滞和降低，反之，可能受到的影响较小；较高浓度半乳糖醛酸或果胶其它的代谢产物会产生自我降解物阻遏，从而影响产酶；此外抗体、植物PG抑制蛋白等可以抑制米根霉表达PG。1.2.5 微生物果胶酶条件优化研究现状从上个世纪 60 年代起，我国开始从事产果胶酶的微生物筛选、酶学性质、生产工艺及工业应用等方面进行研究，研究主要集中在曲霉属，其中又以黑曲霉为主。在选育菌株工作的同时，进行培养基成分和培养条件优化，以期提高果胶酶酶活力。一些国内外在培养基成分和培养条件的优化方面的研究，如表 1.5 中所示。表1.

47、5 微生物产果胶酶条件优化Table.1.5 Optimization of pectinolytic enzymes production菌种优化方法结果来源嗜碱菌AL-103碳源果胶为碳源时酶活达最高 张鸿雁36霉菌As2接种量接种量为30%时酶活较高全桂静等37曲霉培养基Tween-80 0.15%酶活提高 邬敏辰等38HDDMG05培养基最大产酶量8100 U/mL 蔡柏岩等39Peacilomyces.clavisporus 2A.UMIDA.1温度液体培养产酶温度为30CSouza JVB 等40吉氏芽孢杆菌S-2无机盐离子Ca2+对该酶有明显的激活作用，Mn2+、Cu2+、Zn2

48、+对该酶有强烈的抑制作用张保国等41MHZP-01、MHZP-02pH最适 pH 值均为 5.0 葛菁萍等42Alkalibacterium sp.F26培养基培养条件酶活达 1015 U/mL 李建洲等43黑曲霉培养基培养条件比优化前提高8.7 倍陈勇强44黑曲霉P-6021细胞固定化产酶上升，酶活达664U/mL钟卫鸿等45草酸青霉 L5培养基培养条件是初始酶活的3倍蓝丽精等46黑曲霉 (MTCC: 281).培养基培养条件酶活达6.1U/mLPalaniyappan M等471.2.6米根霉产果胶酶研究进展米根霉的果胶酶基因组的研究表明，富含GH28，13个基因编码Endo-PG和3个基

49、因编码Exo-PG，6个基因编码PME。因此，米根霉降解果胶分泌的最主要酶是PG。Endo-PG作用于果胶光滑区，即同型半乳糖醛酸（HG）长链上，随机水解-1,4-D-半乳糖醛酸；Exo-PG从HG链非还原末端开始水解HG链。丰富的主链降解酶和少量的辅酶存在，导致倾向于降解无支链果胶。PME的数量较多可以表明PG对没有酯化的果胶的亲和力高48。 Saito等7在米根霉利用土豆浆发酵产乳酸和乙醇的研究中，发现米根霉NBRC 4707的PG活力比NRRL 395高1倍，导致NBRC 4707产乳酸和乙醇更加高效，得到在发酵过程中添加果胶酶能提高乳酸和乙醇的产量的结论。经过纯化和分析，测得PG相对分

50、子质量为31kDa，最适pH为4.5，最适温度为45C。Hamdy8-9在米根霉利用橘皮进行固态发酵的研究中，在浸离液中发现高纤维素酶活力和高果胶酶活力，经过纯化和分析，认定该果胶酶为PL：Km为3.87mg/mL，Vmax为297U/mL，Kcat为5.94mgU/min，相对分子质量为37kDa。Kareem等10在米根霉利用橘皮（35%w/v）固态发酵产果胶酶的研究中，得到粗酶液酶活力为1360U/mL，并把其应用于橘子果汁的澄清。Hart等11在米根霉利用橘汁加工过程中的副产物橘子浆固态发酵产果胶酶的研究中，发现其主要产物为PG，极少有PE和PL产生，因此在柑橘工业中显示出潜力。Yos

51、hida等12在米根霉利用果胶液培养基发酵的同时浸渍桑树根，发现只有PG、PGL和PL这三种果胶酶，其中PG在浸渍中发挥主要作用。 综上所述，米根霉的果胶酶基因组的研究表明，米根霉有大量产果胶酶的潜力；米根霉发酵分泌果胶酶的研究表明，研究多集中在酶性质上，缺少对培养基和培养的优化，因此酶活力不高。1.2.7固定化细胞产果胶酶的进展固定化细胞（Immobilized cells）是指固定于非水溶性载体上的细胞，固定后的细胞只能在有限的空间范围进行生命活动。这项技术源自20世纪70年代，它是一种获得酶和代谢产物的方法，是在固定化酶技术的基础之上发展起来的。固定化的细胞能仍能正常的进行生命活动，所以

52、又被称为固定化增殖细胞。微生物（如真菌等）固定化细胞方式依据对细胞作用原理不同，主要有包埋法和吸附法。包埋法是通过多空载体将细胞包埋在其内部的方法，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法，前者的应用较广泛。吸附法是依据细胞（带负电）与吸附剂之间的多种作用如静电、表面张力和粘附力等，从而将其固定在吸附剂表面或内部最终形成生物膜的方法，吸附剂有硅藻土、多孔材料（如陶瓷、玻璃和塑料等）、金属细网、微小载体以及中空纤维等。用于固定化细胞产果胶酶的研究已经设计了众多的载体和方式。表1.6总结可具有代表性的一些研究发现。聚氨酯泡沫(PUF）由于具有化学的稳定性和机械可塑性，故在生物处理过程中的应用较多49。海藻酸

53、盐凝胶珠由于具有化学稳定性好、无毒性、制备过程简单、包埋细胞效率高和原料价格便宜等特点，所以常用它固定化细胞。纤维类材料具有许多适于固定化细胞的物理化学性质，来源广泛且价格便宜。钟卫鸿等45用PFU（0.7g/50ml培养基）固定化Aspergillus niger P-6021发酵产果胶酶，重复5 批次，发酵液酶活达到664U/mL，比游离提高约2.3倍。Kuhad等50在用PUF固定化Streptomyces sp. RCK-SC的研究中，将1gPUF微粒（1cm2/个，密度32 kg/m3，粒径100-500m）放入装有50mL优化后培养基的250mL锥形瓶中，并接入种子培养基，每间隔2

54、4h换入新鲜的培养基，连续培养10天，在第5批次酶活达到最大101U/mL，比游离发酵产果胶酶酶活力提高33%。Kapoor等51的研究表明，利用PFU作为基质固定化Bacillussp.MG-cp-2生产聚半乳糖醛酸酶，重复发酵30天，比游离发酵提高1.5倍（147U/mL）。Edwil等52用海藻酸钙凝胶珠（直径3.5-4.5mm）固定化Aspergillus sp.CC1发酵产PG，经6批次半连续发酵，PG酶活力有所提高，在第4批次达到10.8 U/mL，比游离的提高约1.2倍。Nighojkar等53在对海藻酸钠凝胶珠、戊二醛处理的海藻酸盐凝胶珠和聚乙烯醇-海藻酸盐凝胶珠包埋Asper

55、gillus niger产PG的研究中，发现海藻酸钠凝胶珠（接入比1:4）效果较好，首批次PG活力为95315U/L，半连续发酵使用6个周期内PG下降不大。林绍辉等54以卡拉胶为载体的固定化Aspergillus niger 9. 203产果胶酶，进行5批次的重复产酶，稳定性良好，酶活最高为86.70U/mL。Catarina等55在循环流动的填充床反应器中，用经过碱处理的谷物纤维素为载体固定Kluyveromyces marxianus CCT 3172 细胞进行连续不间断产果胶酶，产率可达0.98UmL-1h-1。Marlia等56在用橘皮固定化Aspergillus niger URM 5162产PG的研究中，得到此橘皮固定床反应器产endo- PG酶活力和 exo-PG 酶活力分别为1.18U/mL和4.11U/mL。Darah等57的研究表明，在100mL优化过的培养基中，加入6个经预处理过的百洁布(scouring pad)方块（1cm3）固定化Aspergillus niger HFD5A-1，在第6天果胶酶活为11.05 U/mL，比游离提高