RNAi干扰技术

1、RNA Interference (RNAi) RNA干扰（干扰（RNA interference, RNAi）是指将外源双链RNA导入细胞后引起与其序列同源的特异基因mRNA降解导致基因表达抑制的现象，属于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)的一种形式。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义 。定义：RNAi的发现 1995年，Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达。 设计： 反义RNA特异性阻断par-1基因的表达； 正义RN

2、A以期观察到基因表达的增强。 结果： 二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。RNAi的提出 1998年2月，Fire A 和Mello C将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异阻断相应基因的表达。 他们证实，Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference, 简称RNAi）RNAi广泛存在于自然界 随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、

3、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物钟。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。RNAi作用机制作用机制 RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物或线虫细胞内，与 Dicer酶 (dsRNA-specific endonucleaes, Dicer ) 的 C末端结构域结合产生 21-23nt siRNAs 片断( small inte

4、rfering RNA, 即siRNA ) 。每个片断的3端都有 2nt 核苷酸突出。 在效应阶段， Dicer酶通过 PAZ结构域与含有 PAZ结构域的 Argonaute蛋白互相作用， 核酸内外切酶、解旋酶与 Argonaute蛋白相连进而与siRNA一起形成具有多个亚单元的核糖核苷酸蛋白复合物 ( RNA-inducing silencing complex, RISC ) 。 RISC中的解旋酶应用 ATP解开 siRNA双链 ，使其反义链互补结合到靶向mRNA上与之相匹配的特异性序列， RISC中的核酸酶降mRNA ， 降解的 mRNA随后迅速地被细胞其他的RNA酶所降解。从而使 目

5、的基因沉默，产生 R N A i 现象。 如何进行RNAi实验？ RNAi的设计 RNAi目标序列的选取原则、阴性对照 siRNA的制备化学合成 、体外转录、RNase III 消化长片断双链RNA、体内表达 、siRNA表达载体、siRNA表达框架 RNAi转染磷酸钙共沉淀、电穿孔法 、机械法 、DEAE-葡聚糖和polybrene 、阳离子脂质体试剂RNAi目标序列的选取原则目标序列的选取原则(1)从转录（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。 (2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较

6、，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。 (3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 阴性对照阴性对照 一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。siRNA的制备方法及特点优点缺点适用不适用化学合成方便质量高价格高定制周期长 已找到最有效的siR-NA的情况下，需大量siRNA进行研究筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素 体外

7、转录 性价比高、快规模受到限制 筛选siRNAs，特别是制备多siRNAs，化学合成的价格成为障碍时 实验需大量且特定的siRNA长期研究 用RNasc消化长片断双链RNA跳过检测和筛选siRNA序列的步骤，节省时间和金钱可能引发非特异的基因沉默的表型 快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 需长时间研究或需一个特定的iRNA进行研究，特别是基因治疗 siRNA表达载体 唯一可进行长期研究的方法 耗时长，工作繁琐 可用于长期研究 筛选siRNA序列 siRNA表达框架 直接由PCR得到，速度快，操作简便 PCR产物很难转染到细胞中 筛选siRNA序列，在克隆到载体前啼选最佳启动子 长期抑制研究

8、 比较项目化学合成体外转录RNase III降解dsRNAsiRNA表达载体PCR表达框材料需求材料需求 21-mer RNAoligos(一对一对)29-mer DNA oligos(一对一对)转录模版转录模版 (200-1000bp，两侧带，两侧带T7 启动子启动子)55-60-mer DNA oligos(一对一对) 50-mer DNA oligos(一对一对)全部制备全部制备/合成时间所需合成时间所需时间时间4天天2周周24 小时小时 + DNA oligo合合成时间成时间1 天天 + 转录模版制转录模版制备时间备时间5天以上天以上 + DNA oligo合成时间合成时间 6 小时小

9、时 + DNA oligo合成时间合成时间个人所需操作时间个人所需操作时间几乎不需要几乎不需要*中等中等中等中等多多中等中等是否需要验证和寻找最是否需要验证和寻找最有效有效siRNA需要需要需要需要不需要不需要需要需要需要需要能否标记能否标记siRNA (例如例如用于荧光显微镜分析用于荧光显微镜分析siRNA进入细胞过程或进入细胞过程或者在细胞中的定位）者在细胞中的定位）能能能能能能不能不能不能不能转染的相对难易程度转染的相对难易程度好好好好好好差差差差可筛选性可筛选性 (例如抗生素例如抗生素筛选筛选) 不可以不可以不可以不可以不可以不可以可以可以不可以不可以能否用于长效抑制能否用于长效抑制不

10、可以不可以不可以不可以不可以不可以可以（抗生素筛可以（抗生素筛选）选）不可以不可以能否大规模制备能否大规模制备可以可以有限有限有限有限可以可以有限有限检测总体转染效率检测总体转染效率不可以不可以不可以不可以不可以不可以可以可以不可以不可以每个基因的相对费用每个基因的相对费用高高中等中等低低中等中等中等中等*取决于合成后是否包含纯化、去保护，以及厂家提供的是已经退火的即用型双链还是冻干的单链取决于合成后是否包含纯化、去保护，以及厂家提供的是已经退火的即用型双链还是冻干的单链RNAi转染将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下五种： 磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉

11、淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。电穿孔法电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴

12、随高水平（50%或更高）的毒性。 DEAE-葡聚糖和葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。机械法机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。阳离子脂质体试剂阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水

13、中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。RNAi的应用前景的应用前景 研究基因功能的新工具研究基因功能的新工具 已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基

14、因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。 研究信号传导通路的新途径研究信号传导通路的新途径 联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系，Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得

15、了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果,在此基础上分析了DSH3PX1与DACK之间的关系, 证实了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点， 因此认为RNAi技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。 开展基因治疗的新策略开展基因治疗的新策略 RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止自私基因序列过量增殖等作用，因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物，并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。 肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可