农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用

1、农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用论文导读：农杆菌是一种土壤习居菌，在自然条件下可以通过病斑或伤口进入寄主组织，刺激寄主在侵染部位形成冠瘿瘤，引发根癌病。以真菌菌株作对照。关键词：农杆菌，真菌，遗传转化一、农杆菌介导真菌遗传转化的现实意义真菌在自然界具有重要的地位，它是不同生态环境中的最初分解者之一。真菌在工业、农业、食品行业和医药等领域应用十分广泛。例如，在生物技术领域，可以利用真菌生产对人类有益的次级代谢产物抗生素、紫杉醇等；在植物病理学研究领域，许多真菌本身就是人类、动物及植物的病原菌；一些真菌可作为生防剂控制病虫害的发生。构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和粗糙链孢霉（

2、Neurospora crassa）由于结构比较简单，一般作为模式生物用于基础性的分子生物学及遗传学的研究1。但从自然界直接分离的菌株和通过常规育种得到的菌株在多种性状上并不能满足人们的需要，而通过常规方法用真菌生产异源蛋白更难以实现2。论文检测。而农杆菌介导的真菌遗传转化具有效率高，成本低，操作方便和重复性好等特点3,4 ，大大提高了真菌的转化效率，增加了转化子的稳定性，为研究真菌基因功能，分离克隆相关基因提供了一条崭新的途径。二、农杆菌介导真菌遗传转化的分子基础农杆菌是一种土壤习居菌，在自然条件下可以通过病斑或伤口进入寄主组织，刺激寄主在侵染部位形成冠瘿瘤，引发根癌病。冠瘿瘤的生成，是由于

3、农杆菌染色体外遗传物质Ti质粒上的一段DNA(T-DNA)转移到植物细胞，整合进染色体组并进行表达的结果。T-DNA整合到真菌基因组的方式分为两种，一种为同源重组，另一种为异源重组。对丝状真菌而言，当T-DNA中存在与宿主基因组同源的序列时，可实现同源重组（Gouka等，1999）。Gouka等发现当T-DNA上含有与泡盛曲霉基因组同源的序列时，T-DNA可以通过同源重组多拷贝的整合到受体的基因组序列上。论文检测。Bundock等（1996）研究发现同源重组比非同源重组的转化效率高200倍。当宿主中没有T-DNA的同源序列时，T-DNA主要以异常重组的形式整合到真菌基因组上（de Groot，

4、1998）。Mullins等（2001）用TAIL-PCR的方法也证明了T-DNA在尖孢镰刀菌基因组上随机整合的性质5。三、农杆菌介导真菌遗传转化的过程该技术基本的转化过程依次为构建二元载体、活化农杆菌、准备真菌分生孢子和共转化。具体的转化过程包括：（1）根据实验目的构建二元载体，在载体T-DNA两边界间插入适当的选择性标记，并将该载体导入农杆菌中。目前大部分采用潮霉素抗性标记，也有一些研究采用gus、ura3、NAT、BLE等基因进行标记。（2）然后接种含双元载体的农杆菌工程菌株到含有合适抗生素的MM培养液中培养，离心收集菌体，用适量的乙酰丁香酮IM液体培养基重悬菌体，并将菌体浓度适中留做备

5、用。（3）用灭菌蒸馏水从培养好的丝状真菌PDA平板上洗下孢子，血球计数板计数，然后用IM液体培养基稀释至孢子浓度适中。取已活化的农杆菌菌液和稀释好的真菌孢子悬液按照一定比例混合后涂布在共培养平板中的滤膜上，然后共培养。（4）将共培养的滤膜转到 PDA培养基(含选择剂和头孢霉素)上，其中用一定浓度头孢霉素杀死农杆菌、适量选择剂(如潮霉素)用于筛选转化子，再继续培养至菌落出现(de Groot，1998)，并且根据稀释倍数计算出转化效率。最后将抗性菌落转移至新鲜含有适宜抗生素的培养基上培养6。四、农杆菌介导真菌遗传转化的鉴定随机挑选抗性菌落转接到含一定浓度潮霉素B的 PDA平板上，培养至产孢。挑少

6、量孢子分别在PDA培养基上进行稀释涂平板，待平板上长出肉眼可以看到的菌落时，从各稀释板中各挑取一个菌落到新的PDA平板上，培养至产孢后，重复上述单孢分离和挑单孢培养过程2-4次，进行最后一轮单孢分离之后从各菌株的单孢分离板上随机挑取单孢点接到含一定浓度的潮霉素B的PDA平板上培养，观察各板上单孢分离菌块的生长情况，若所有菌块都生长则说明该转化子稳定，反之则表明该菌株不具有遗传稳定性，若部分菌块生长则表明T-DNA插入存在分化现象。以真菌菌株作对照。挑取野生型真菌菌株和假定转化子菌株分别接种在PDA培养基和选择性培养基上培养至产孢，向平板中加入适量灭菌水洗下分生孢子，吸取适量孢子液接种到盛有PD

7、A培养基的三角瓶中震荡培养。培养结束后，将培养物利用真空抽滤泵收集菌体，收集的菌体用灭菌蒸馏水、灭菌ddH2O各抽洗两次，以除去色素等杂质，然后收集菌丝体转至灭菌离心管中，-76冷冻备用7。真菌基因组DNA的提取，进行PCR检测，结果分析。五、农杆菌介导真菌遗传转化的应用真菌的大部分还是功能未知基因，利用基因敲除方法却可为研究基因功能提供最直接最有力的证据1。论文检测。插入突变是另一个反向遗传学的研究方法。当 T-DNA 中不存在与受体染色体同源序列时，T-DNA主要以异源重组形式整合进染色体基因组中。因此可利用T-DNA 标签法产生插入突变从而分离克隆真菌相关基因 1。我们可以根据我们的实验

8、目的构建二元载体，在载体T-DNA两边界间插入适当的选择性标记，并将该载体导入农杆菌中，再去侵染我们所要改造的真菌并使其具有该基因片段，这样我们就可以用改造的具有优良性状的真菌进行工业化的大生产，至此达到我们的目的。六、展望农杆菌介导的真菌遗传转化因具有操作简便，转化效率高，容易得到单拷贝随机插入的转化子，并且转化子稳定等特点而成为近年来真菌遗传转化的主要研究手段之一。相信随着对农杆菌介导真菌遗传转化各个因素的进一步深入研究和探讨，更多的真菌将会利用该方法成功地实现遗传转化，农杆菌介导的遗传转化也将成为研究真菌基因功能、分离标记基因的更加有效的手段1。参考文献：1迟彦，周东坡，平文祥等.根癌农

9、杆菌介导的真菌遗传转化及其应用J.菌物学报,2005,24(4):612-6172方卫国，张永军，杨星勇等.根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究进展J.中国生物工程杂志,2002,10(4):403BundockPaul,Amkeden,AliceGM,etal.Trans2kingdomT2DNAtransferfromAgrobacteriumtumefacienstosaccharomycescerevisiaeJ.TheEMBOJournal,1995,14(3):320632144GoukaRobinJ,GerkCasper,HooykaasPaulJJ,etal.TransformationofAspergillusawamoribyAgrobacteriumtumefaciens2mediatedhomologousrecombitionJ.NatureBiotechnology,1999,17:5986015黄亚丽.农杆菌介导哈茨木霉转化系统优化及突变体分析6E.D.Mullins,X.Chen,P.Romaine,etal.Agrobacterium-MediatedTransformatio