动物细胞融合与单克隆抗体(1)

1、动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液10代细胞代细胞50代细胞代细胞传代培养传代培养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液加培养液（分解弹性纤维）（分解弹性纤维）原代培养原代培养胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。比老比老龄动物的组织龄动物的组织细胞增殖能力强，细胞增殖能力强，有丝有丝分裂旺盛分裂旺盛。分分化程度化程度越越低，低，增殖增殖能力越强，越能力越强，越容易容

2、易培养。培养。用用胰蛋白酶胰蛋白酶分散分散细胞，说明细胞细胞，说明细胞间的物质主要是间的物质主要是蛋白质蛋白质。动物细。动物细胞培养适宜的胞培养适宜的PH为为7.27.4，此环境下胃蛋白此环境下胃蛋白酶（酶（2.0）没有）没有活性，而胰蛋白活性，而胰蛋白酶酶(7.2-8.4)的活的活性较高。性较高。贴壁生长接触抑制胰蛋白酶胰蛋白酶分瓶培养分瓶培养10代以内，保持正常二倍体核型代以内，保持正常二倍体核型细胞增殖缓细胞增殖缓慢，核型可慢，核型可能变化能变化细胞株细胞株遗传物质遗传物质未改变未改变细胞系细胞系遗传物质遗传物质改变改变动物细胞培养动物细胞培养不能最终培养不能最终培养成生物体成生物体动物

3、细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体提问：提问：哪种植物细胞工程技术可以突破不同生物之哪种植物细胞工程技术可以突破不同生物之间的生殖隔离障碍，培育出新的作物类型？间的生殖隔离障碍，培育出新的作物类型？植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术你能回忆出植物体细胞杂交的过程吗？你能回忆出植物体细胞杂交的过程吗？杂杂种种植植株株筛选融筛选融合合AB的原生的原生质体质体再再生生出出细细胞胞壁壁脱脱分分化化愈愈伤伤组组织织再再分分化化植物细胞的融合植物细胞的融合植物组织培养植物组织培养植物细胞植物细胞A原生质体原生质体B原生质体原生质体A杂种杂种细胞细胞AB去去 壁壁去去 壁壁人人工工诱诱导导方法？

4、方法？促进融合促进融合的方法？的方法？融合融合完成完成的的标志标志植物细胞植物细胞B植物体细胞杂交技术过程植物体细胞杂交技术过程原理？原理？原理？原理？动物细胞与植物细胞的差别：无细胞壁全能性受限制，不能发育成杂种动物动物细胞杂交与植物细胞杂交的不同：不需去除细胞壁不能发育成新的动物个体如果将牛的细胞与植物细胞杂交，得到绿色的小奶如果将牛的细胞与植物细胞杂交，得到绿色的小奶牛，那岂不是只要晒晒太阳就可以挤出牛奶啦！牛，那岂不是只要晒晒太阳就可以挤出牛奶啦！动物细胞也能融合吗？动物细胞也能融合吗？一、动物细胞融合1、动物融合的过程请同学们阅读课本P52动物融合问题讨论问题讨论动植物细胞在结构上有

5、何区别？这与它们杂交或融合过程动植物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？有什么影响？ 4、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？ 什么原理？什么原理？不同不同DNADNA的两个细胞的两个细胞灭活病毒诱导细胞融合灭活病毒诱导细胞融合融合后的细胞融合后的细胞进行有丝分裂进行有丝分裂1、动物细胞融合过程动植物细胞在结构上有何区别？这与它们动植物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？杂交或融合过程有什么影响？问题讨论问题讨论动物细胞无细胞壁，动物细胞融合过程中动物细胞无细胞壁，动物细胞融合过程中不须去

6、除细胞壁和再生出细胞壁。不须去除细胞壁和再生出细胞壁。问题讨论问题讨论、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？原理是否相同？相同，都是细胞膜的流动性相同，都是细胞膜的流动性问题讨论问题讨论突破了有性杂交方法的局限，突破了有性杂交方法的局限，使远源杂交成为可能。使远源杂交成为可能。一、动物细胞融合（细胞杂交）1、概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。2、结果：形成单核的杂交细胞3、原理： 细胞膜的流动性4、诱导方式物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活的病毒5、过程：动物细胞A 动物细胞B诱导，融合2个完整的杂

7、交细胞AB有丝分裂（膜融合、细胞融合的实质质融合、 核融合）单核细胞注意：动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细胞主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株用途用途物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振动、电刺激）动、电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导方法使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合的方法细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性

8、植物细胞全能性原理原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比植物、动物细胞融合的比较较6、意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。7、应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段 特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体二、单克隆抗体二、单克隆抗体回顾回顾主要分布在血清中。主要分布在血清中。“克隆克隆”从英文从英文“clone”clone”音译而来，是指从一音译而来，是指从一个共同祖先，通过个共同祖先，通过无性繁殖无性繁殖的方法产生出来的一的方法产生出来的一群群遗传特性相同遗传特性相

9、同的的DNADNA分子，细胞或个体。在细分子，细胞或个体。在细胞水平指胞水平指动物细胞培养动物细胞培养. .自主阅读自主阅读P52P52：抗体的传统生产方法及缺陷抗体的传统生产方法及缺陷是什么？是什么？ 抗原抗原 动物体动物体刺激刺激浆细胞浆细胞 抗体抗体抗原不纯抗原不纯抗体不纯抗体不纯B B淋巴细胞特点淋巴细胞特点每一个每一个B B淋巴细胞只能产生一种抗体。淋巴细胞只能产生一种抗体。B B淋巴细胞受抗原刺激后，可以淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。产生抗体。动物体内的动物体内的B B淋巴细胞可以产生淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特

10、异性免疫作用。的抗原具有特异性免疫作用。二、二、单克隆抗体单克隆抗体 由单个由单个B B淋巴细胞经过无性繁殖（克淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单克隆抗体称为单克隆抗体。1 1、概念、概念: :怎样才能大量生产单克隆抗体？怎样才能大量生产单克隆抗体？提示提示1 1：仅用细胞培养技术可行吗？：仅用细胞培养技术可行吗？提示提示2 2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？提示提示3 3：有什么方法能使：有什么方法能

11、使B B细胞产生抗体的能细胞产生抗体的能 力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？大量生产大量生产单克隆抗体思路单克隆抗体思路 B淋巴细胞具产生抗体的功能淋巴细胞具产生抗体的功能 骨髓瘤细胞具无限增殖的特性骨髓瘤细胞具无限增殖的特性 利用利用细胞融合的技术细胞融合的技术将两种细胞融将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和骨髓瘤细胞合获得具有淋巴细胞和骨髓瘤细胞特性的特性的杂交瘤细胞杂交瘤细胞 利用利用动物细胞培养技术动物细胞培养技术大量培养杂大量培养杂交瘤细胞交瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞注射特定注射特定抗原蛋白抗原蛋白骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞融

12、合融合（只考虑两两融合）（只考虑两两融合）培养液中细胞有几培养液中细胞有几种类型？融合细胞种类型？融合细胞几种几种类型类型？骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞- B- B淋巴细胞淋巴细胞B B淋巴细胞淋巴细胞-骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞多种多种杂交细胞杂交细胞在具有筛选作用的培养基上培养在具有筛选作用的培养基上培养专一抗体检验阳性专一抗体检验阳性克隆上述杂交细胞克隆上述杂交细胞分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞检验阳性细胞单克隆抗体单克隆抗体注射到小鼠体内注射到小鼠体内体外培养体外培养 该细胞继承该细胞继承双亲细胞双亲细胞的遗传

13、特性，既能的遗传特性，既能产生专产生专一抗体一抗体又能又能无限增殖无限增殖。杂交瘤细胞有何特点？杂交瘤细胞有何特点？特异性强，灵敏度高特异性强，灵敏度高免疫小鼠免疫小鼠培养骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞融合融合骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞注射特定注射特定抗原蛋白抗原蛋白选择培养基上培养选择培养基上培养专一抗体专一抗体检验阳性检验阳性专一抗体专一抗体检验阳性检验阳性注射到小鼠体内注射到小鼠体内体外培养体外培养单克隆抗体单克隆抗体克隆杂交细胞克隆杂交细胞分开不同杂交细胞，克隆分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞专一抗体，检验阳性细胞多种杂交细胞多种杂交细胞杂交瘤细胞有何特点？杂交瘤

14、细胞有何特点？本过程利用的那些技术？本过程利用的那些技术？动物细胞融合技术动物细胞融合技术动物细胞培养技术动物细胞培养技术是否注射抗原是否注射抗原（只考虑两两融合）培（只考虑两两融合）培养液中细胞有几种类型？养液中细胞有几种类型？几种融合细胞？几种融合细胞？2 2、单克隆抗体制备过程、单克隆抗体制备过程与传统制备的抗体相与传统制备的抗体相比具有什么特点？比具有什么特点？ 单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速（导向作用，导向作用，作为载体，作为载体，生物导弹生物导弹=单克隆抗体单克隆抗体+药物，药物，治疗肿瘤）治疗肿瘤）两个过程两个过程动物细胞融合过程动物

15、细胞融合过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程三个三个“一一”一个诱导细胞融合的新方法一个诱导细胞融合的新方法一个新细胞一个新细胞一个优势一个优势课堂课堂小结小结灭活的病毒灭活的病毒杂交瘤细胞杂交瘤细胞单克隆抗体特异性单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势强、灵敏度高的优势2 2、单克隆抗体制备过程、单克隆抗体制备过程B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞诱导诱导融合融合B-BB-B细胞细胞B-B-瘤细胞瘤细胞瘤瘤- -瘤细胞瘤细胞选择培养选择培养杂交瘤细胞杂交瘤细胞（ B-B-瘤细胞）瘤细胞）克隆化培养克隆化培养抗体检测抗体检测产生所需产生所需抗体的杂抗体的杂交瘤细胞交瘤细胞体外培养体外

16、培养小鼠腹腔内增殖小鼠腹腔内增殖单克隆抗体单克隆抗体课堂课堂小结小结5、过程：动物细胞A 动物细胞B诱导，融合2个完整的杂交细胞AB有丝分裂（膜融合、 质融合、 核融合）单核细胞单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合细胞融合杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选筛选，继续培养，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体（选择性培养基）（选择性培养基）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞B淋巴细胞淋巴细胞B-B细胞细胞B-瘤细胞瘤细胞瘤瘤-瘤细胞瘤细胞

17、筛选筛选比较项目第一次筛选第二次筛选原理在选择性培养基中添在选择性培养基中添加某种药物，特异性加某种药物，特异性杀死骨髓瘤细胞和骨杀死骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞自身融合的髓瘤细胞自身融合的细胞细胞抗原抗原抗体的特抗体的特异性结合异性结合目标杂交瘤细胞杂交瘤细胞既能无限增殖，既能无限增殖，又能产生特异性又能产生特异性抗体的杂交瘤细抗体的杂交瘤细胞胞【堂堂清【堂堂清】1.单克隆抗体的优点是单克隆抗体的优点是_特异性强、灵敏度高、可大量制备特异性强、灵敏度高、可大量制备2.单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的原因是原因是_每一种每一种B B淋巴细胞只能分泌一种特异性抗体淋

18、巴细胞只能分泌一种特异性抗体3.产生抗体的细胞是产生抗体的细胞是_ 产生单克隆抗体的细胞是产生单克隆抗体的细胞是_效应效应B B细胞（浆细胞）细胞（浆细胞）杂交瘤细胞杂交瘤细胞4.杂交瘤细胞的特点杂交瘤细胞的特点:_既能无限增殖，又能分泌特异性抗体既能无限增殖，又能分泌特异性抗体5.首次筛选是为了获得首次筛选是为了获得_ 第二次筛选时为了获得第二次筛选时为了获得_杂交瘤细胞杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞第一步：从一只小鼠体内提取第一步：从一只小鼠体内提取T T淋巴细胞，然后与骨髓淋巴细胞，然后与骨髓瘤细胞诱导融合。瘤细胞诱导融合。第二步：再用普通培养基进