环境监测实验：分光光度法

1、分光光度法分光光度法主要内容主要内容 光谱分析法光谱分析法 1 分光光度计分光光度计 2 实验步骤和要求实验步骤和要求3 目的要求 掌握：分光光度法原理；可见分光光度计的掌握：分光光度法原理；可见分光光度计的 波长校正。波长校正。熟悉：血红蛋白及衍生物吸收光谱测定；光熟悉：血红蛋白及衍生物吸收光谱测定；光 谱分析技术的分类及常用方法。谱分析技术的分类及常用方法。2009年年3月月2009年年3月月v 罗怕特罗怕特-威廉威廉-本生光谱分析法的发明者本生光谱分析法的发明者 v 1811年3月31日出生在德国哥廷根 ，他的发现用氢氧化铁作为砷中毒的解毒药的办法。v 1859年本生和基尔霍夫研究加热的

2、金属的放射光谱。完善了汽灯，发明了本生灯。此灯的温度可达230OC，且没有颜色一、概述一、概述v 利用利用各种物质所具有的发射、吸收或散射的特性各种物质所具有的发射、吸收或散射的特性以确定以确定物物质的结构和化学成分的分析方法质的结构和化学成分的分析方法称为称为光谱分析法光谱分析法。 v 英文为英文为spectral analysis或或spectrum analysis。各种结各种结构的物质都具有自己的特征光谱构的物质都具有自己的特征光谱，光谱分析法就是利用特，光谱分析法就是利用特征光谱研究物质结构或测定化学成分的方法。征光谱研究物质结构或测定化学成分的方法。 可见、紫外分光光度法可见、紫外

3、分光光度法吸收光谱吸收光谱 原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 红外分光光度法红外分光光度法发射光谱发射光谱 荧光分析法荧光分析法 火焰发射光谱法火焰发射光谱法散射光谱散射光谱 比浊法比浊法v 分光光度法（分光光度法（Absorption Photometry）是一种）是一种基于物质对光的基于物质对光的选择性吸收选择性吸收而建立起来的一种分析方而建立起来的一种分析方法。包括可见吸光光度法、紫外法。包括可见吸光光度法、紫外-可见吸光光度法和可见吸光光度法和红外光谱法等。红外光谱法等。分光广度法的优点：分光广度法的优点：v灵敏度高灵敏度高v测定简便快速，仪器设备简单。测定简便快速，仪器设备简单。

4、v不破坏样品不破坏样品(1) 光的基本性质:电磁波的波粒二象性c真空中光速真空中光速 2.99792458108m/s3.0 108m/s波长，单位：波长，单位：m,cm,mm, m,nm, 1 m=10-6m, 1nm=10-9m, 1=10-10m频率，单位：赫芝（周）频率，单位：赫芝（周）Hz 次次/秒秒V= c / 光的传播速度光的传播速度: c = X 波动性波动性h h普朗克普朗克(Planck)(Planck)常数常数 6.6266.6261010-34-34JsJs 频率频率E E光量子具有的能量光量子具有的能量 单位：单位：J(J(焦耳焦耳) )，eV(eV(电子伏特电子伏特

5、) ) V = E / h光量子，具有能量光量子，具有能量。 E=hvE=hv光的光的微粒性波粒二象性波粒二象性V=c / v = E / hc / = E / hE=hc/ 结论结论: :一定波长的光具有一定的能量，波长越一定波长的光具有一定的能量，波长越 长长( (频率越低频率越低) )，光量子的能量越低。，光量子的能量越低。单色光单色光：具有相同能量：具有相同能量( (相同波长相同波长) )的光。的光。混合光混合光：具有不同能量：具有不同能量( (不同波长不同波长) )的光复合在的光复合在 一起。一起。v 将光（电磁波）按波长（或频率）顺序排列，即得电磁波将光（电磁波）按波长（或频率）顺

6、序排列，即得电磁波谱。谱。 200 200nm 400nm 760nm 1mmnm 400nm 760nm 1mm 紫外线紫外线 可见光可见光 红外线红外线 不同波长的光具有不同能量，不同波长的光具有不同能量，波长越长波长越长（频率越低频率越低），），能量越小能量越小。可可 见见 光光三、吸收光谱与分光光度法三、吸收光谱与分光光度法1 1、吸收光谱（、吸收光谱（Absorption spectrumAbsorption spectrum） 原子吸收光谱原子吸收光谱 分子吸收光谱分子吸收光谱 当光辐射通过某种物质时，组成该物质当光辐射通过某种物质时，组成该物质的分子与光子发生的分子与光子发生“碰

7、撞碰撞”，光子的，光子的能量能量就就转转移移至分子上，使它们由至分子上，使它们由基态基态( (低能态低能态) )跃迁到跃迁到激发态激发态( (高能态高能态) )。吸光光度法基本原理光谱名称波长范围X射线0.110nm远紫外光10200nm近紫外光200400nm可见光400760nm近红外光0.762.5um中红外光2.55.0um远红外光5.01000um微波0.1100cm无线电波11000m当光子的能量与分子的当光子的能量与分子的 E匹配时，匹配时，就会吸收光子就会吸收光子 E=hu u=hc/l l完全吸收完全吸收 完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光物质的颜色与光的关系物质的颜色与光

8、的关系 对溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由于对溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点溶液中的质点(分子或离子分子或离子)选择性的吸收某种颜选择性的吸收某种颜色的光色的光所引起的。如果各种颜色的光透过程度所引起的。如果各种颜色的光透过程度相同，这种物质就是无色透明的。如果只让一相同，这种物质就是无色透明的。如果只让一部分波长的光透过，其他波长的光被吸收，则部分波长的光透过，其他波长的光被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色，也就是溶液呈现溶液就呈现出透过光的颜色，也就是溶液呈现的是与它吸收的光成互补色的颜色。例如的是与它吸收的光成互补色的颜色。例如硫酸硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈

9、蓝色；铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈蓝色；2 2、光吸收的基本定律（、光吸收的基本定律（Lamber-BeerLamber-Beer定律）定律） 单色光通过吸光溶液后，吸光度与溶液单色光通过吸光溶液后，吸光度与溶液的浓度和厚度之间呈正比关系。的浓度和厚度之间呈正比关系。入射光透射光bI0I1C CI a 被物质吸收的光t （1 1）LambertLambert定律：定律： 说明吸收与溶液液层厚度间的关系说明吸收与溶液液层厚度间的关系L2入射光透射光L L2 2 L L1 1 ，I I1 1 I I2 2I0I2入射光透射光L1I0I1vLambertLambert定律：定律：当一适当波长的单

10、色光通过一固当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其透射光强度随液层厚度的增定浓度的溶液时，其透射光强度随液层厚度的增加而成指数函数减少，即加而成指数函数减少，即I It t=I=Io o* *1010-k-k1 1b bv其吸光度与光通过的液层厚度成正比。其吸光度与光通过的液层厚度成正比。v式中式中b b为液层厚度，为液层厚度，k k1 1为比例系数，它与被测物为比例系数，它与被测物质性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度及温度有质性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度及温度有关，关，LambertLambert定律对所有的定律对所有的均匀介质均匀介质都是适用的。都是适用的。 （2 2）BeerB

11、eer定律：定律： 说明吸收与溶液浓度间的关系说明吸收与溶液浓度间的关系c c1 1C2入射光透射光入射光透射光透射光C C1 1 C C2 2， I I2 2 I I1 1 I0I1I0I2v BeerBeer定律：定律：当一适当波长的单色光通过溶液时，若液层厚当一适当波长的单色光通过溶液时，若液层厚度一定，透射光的强度随着溶液浓度的增加而成指数函数度一定，透射光的强度随着溶液浓度的增加而成指数函数减少，即减少，即 I It t=I=Io o* *1010-k-k2 2c cv 其吸光度与溶液浓度成正比。其吸光度与溶液浓度成正比。 v 式中式中c c为物质的量浓度为物质的量浓度( (或质量浓

12、度或质量浓度) )，k k2 2为与吸光物质种为与吸光物质种类、溶剂、入射光波长、液层厚度和溶液温度有关的常数。类、溶剂、入射光波长、液层厚度和溶液温度有关的常数。BeerBeer定律仅适用于定律仅适用于单色光。单色光。 如果同时考虑溶液浓度如果同时考虑溶液浓度C C 和液层厚度和液层厚度b b对光吸收的影响，将对光吸收的影响，将LambertLambert和和BeerBeer定律合并，用定律合并，用a a取代取代k1k1和和k2 k2 两个常数则可以推两个常数则可以推出出 I It t=I=Io o* *1010-k-k1 1b b I It t=I=Io o* *1010-k-k2 2c

13、c I It t=I=Io o.10.10-abc-abc a a为吸光系数，与入射光的波长和溶液的性质有关，为常数；为吸光系数，与入射光的波长和溶液的性质有关，为常数； b b为液层厚度；为液层厚度； c c为溶液浓度。为溶液浓度。 透射光强度透射光强度I It t 与入射光强度与入射光强度I Io o之比称为之比称为 吸光度用吸光度用T T表示表示则则 T= I T= It t / I / Io o =10 =10-abc-abc T T的负对数值定义为的负对数值定义为吸光度用吸光度用A A表示表示则则 A =-lgT =lg I A =-lgT =lg Io o/I/It t=abc=a

14、bc A A（absorbanceabsorbance） 表示吸光率（或吸光度）表示吸光率（或吸光度） T T（transmittancetransmittance）表示透光率（或透光度）表示透光率（或透光度）分光光度法利用物质的吸收光谱进行分析分光光度法利用物质的吸收光谱进行分析吸收光谱（吸收光谱（absorption spectrumabsorption spectrum）所谓所谓吸收光谱吸收光谱就是用各种不同波长光线测定物质溶液的吸光就是用各种不同波长光线测定物质溶液的吸光度，然后按其结果描出度，然后按其结果描出吸光度与波长关系的曲线吸光度与波长关系的曲线。吸收光谱是吸收光谱是物质的特征

15、性曲线物质的特征性曲线，一种物质，一种物质在一定的在一定的PHPH、温度、温度、浓度等条件下，具有的一定形状浓度等条件下，具有的一定形状的吸收光谱曲线的吸收光谱曲线 吸收光谱吸收光谱v 吸收光谱曲线，吸收光谱曲线，v 在浓度一定的条件下，以波长在浓度一定的条件下，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标，为横坐标，以吸光度为纵坐标，所绘制的曲线。所绘制的曲线。v 曲线上吸光度最大的地方称为曲线上吸光度最大的地方称为最大吸收峰，它所对应的波长最大吸收峰，它所对应的波长称为最大吸收波长，用称为最大吸收波长，用1max表示。表示。最大吸收波长处测定吸最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高光度，则灵敏度最高v

16、 溶液浓度愈大，吸收光谱的峰溶液浓度愈大，吸收光谱的峰值愈高，两者成正比关系。值愈高，两者成正比关系。 KMnO4吸收光谱曲线v吸收光谱体现了吸收光谱体现了物质的特性物质的特性，是进行，是进行定性、定定性、定量分析的基础量分析的基础。l lmaxmax是是定性分析定性分析的依据，而溶的依据，而溶液的浓度愈大，则吸光度液的浓度愈大，则吸光度A A愈大，是进行愈大，是进行定量分定量分析析的依据。的依据。 主要内容主要内容 光谱分析法光谱分析法 1 分光光度计分光光度计 2 实验步骤和要求实验步骤和要求30.200.208 8分光光度计分光光度计紫外紫外- -可见分光光度计的基本结构示意图可见分光光

17、度计的基本结构示意图 v 光源光源： 可见和紫外分光光度计装有两种光源灯泡：可见和紫外分光光度计装有两种光源灯泡： 钨丝灯，产生可见光；钨丝灯，产生可见光； 氢弧（氘）灯，产生紫外线。氢弧（氘）灯，产生紫外线。 由于玻璃吸收紫外线，所以氢弧灯的灯管多用石英制成，由于玻璃吸收紫外线，所以氢弧灯的灯管多用石英制成，或在灯管上设有石英窗。或在灯管上设有石英窗。 色散元件（棱镜或光栅）色散元件（棱镜或光栅）v单色器单色器： 光狭缝光狭缝单色器的作用是将混合光分解（色散），并单色器的作用是将混合光分解（色散），并可根据需要使一定波长的单色光投射至比色可根据需要使一定波长的单色光投射至比色槽。槽。v比色杯

18、比色杯： 形状大多为矩形。形状大多为矩形。 比色杯的光径（溶液厚度）愈大，吸收的光能比色杯的光径（溶液厚度）愈大，吸收的光能愈多，灵敏度愈高。愈多，灵敏度愈高。v光电元件：光电管或光电倍增管光电元件：光电管或光电倍增管 作用：将光能转变成电能。作用：将光能转变成电能。 光电管产生光电流的大小，与光强度和波长有关。光电管产生光电流的大小，与光强度和波长有关。 光电管对弱光的灵敏度大，光照过强或长时间曝光灵敏光电管对弱光的灵敏度大，光照过强或长时间曝光灵敏 度显著下降，即度显著下降，即“疲劳疲劳” 现象。现象。 温度对光电管的灵敏度有影响。温度对光电管的灵敏度有影响。 电子放大器电子放大器v读数单

19、元读数单元 读数元件读数元件定量测定定量测定1、利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（各管吸光度（A A）为纵坐标，各管的浓度（）为纵坐标，各管的浓度（C C）为横坐标，在方格坐标纸上作）为横坐标，在方格坐标纸上作图。图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质测定

20、时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 标准曲线标准曲线(浓度浓度-吸光度曲线）吸光度曲线）对末知浓度物质测定时对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的线上即可求得测定物的浓度。浓度。 0.20.80.40.6AC对比法： 将标准品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度： As = abCs；Ax = abCxCx=Cs Ax / As 由于测定体系温度、厚度及入射光波长一致，故标准与待测样品a&b值相等，可用下式比较计算待测

21、样品浓度：主要内容主要内容 光谱分析法光谱分析法 1 分光光度计分光光度计 2 实验步骤和要求实验步骤和要求3 722型分光光度计型分光光度计722722型分光光度计操作步骤型分光光度计操作步骤1 1、开机，打开盖板，、开机，打开盖板，预温预温3030minmin；2 2、将转换旋钮转至将转换旋钮转至“T T”，用用“0 0”旋钮以旋钮以“空白空白”调调透光度至零透光度至零；3 3、盖上盖板，光路自动打开，用、盖上盖板，光路自动打开，用“100100”旋钮调旋钮调透光度至透光度至100%100%， 若不能若不能调至调至100%100%，可调节灵敏度旋钮；，可调节灵敏度旋钮；4 4、将转换旋钮转

22、至、将转换旋钮转至“A A”，此时吸光度此时吸光度A A应为零，若非零，调节应为零，若非零，调节“消光零消光零”旋钮至零；旋钮至零；5 5、拉动横杆，读取吸光度。、拉动横杆，读取吸光度。实验一实验一 可见分光光度计波长校正可见分光光度计波长校正v原理原理：镨铷玻璃是一种含有稀有金属镨和铷的镨铷玻璃是一种含有稀有金属镨和铷的玻璃制品，在玻璃制品，在可见光波长范围内可见光波长范围内，具有，具有特征性特征性的吸收光谱的吸收光谱，吸收峰的波长固定，可作为校对，吸收峰的波长固定，可作为校对仪器波长正确性的一个依据。仪器波长正确性的一个依据。v操作步骤：操作步骤： 用镨铷玻璃与空白光路作对照，每隔用镨铷玻

23、璃与空白光路作对照，每隔2 2nmnm，在在529529nmnm附近每隔附近每隔1 1nmnm，以以波长为横坐标，吸光波长为横坐标，吸光度为纵坐标度为纵坐标，测出波长从，测出波长从524524nmnm538nm538nm的镨铷的镨铷玻璃吸收吸光度，查找吸收峰的极值。玻璃吸收吸光度，查找吸收峰的极值。实验二实验二 血红蛋白及衍生物吸收光谱测定血红蛋白及衍生物吸收光谱测定v原理：血红蛋白在不同条件下可以形成不同的衍生物，原理：血红蛋白在不同条件下可以形成不同的衍生物，如血红蛋白溶液在空气中与氧气充分接触可形成氧合血如血红蛋白溶液在空气中与氧气充分接触可形成氧合血红蛋白红蛋白HbOHbO2 2v，与

24、一氧化碳反应则会合成碳氧血红蛋白，与一氧化碳反应则会合成碳氧血红蛋白HbCO HbCO ，高铁高铁氰化钾能使血红蛋白中的二价铁氧化成三价铁，形成高氰化钾能使血红蛋白中的二价铁氧化成三价铁，形成高铁血红蛋白（铁血红蛋白（MHb）。）。HbOHbO2 2HbCO HbCO 组成成分不同组成成分不同 分子结构不同分子结构不同MHb MHb 特有吸收光谱特有吸收光谱v 操作步骤操作步骤： 1. 1. 样品的制备样品的制备 5 ml H 5 ml H2 2O + Hb (2O + Hb (2滴滴) ) 5 ml H 5 ml H2 2O + Hb (2O + Hb (2滴滴)+ )+ 铁氰化钾（铁氰化钾

25、（1 1滴）滴） （棕色（棕色) ) 2. 2. 测定：测定：470nm-650nm470nm-650nm范围内，每隔范围内，每隔20nm20nm测吸光度一次，测吸光度一次，接近高峰时，每隔接近高峰时，每隔2nm2nm测波长一次，测波长一次，绘制绘制HbHb和和MHbMHb吸收光谱吸收光谱曲线。曲线。 注注: :每次调节波长，必须重新校正零点！每次调节波长，必须重新校正零点！2009年年3月月吸收光谱曲线绘制吸收光谱曲线绘制v 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，描出所有测量的点以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，描出所有测量的点，用曲线连接，用曲线连接v 在坐标轴上标出在坐标轴上标出 波长、吸光度以及单位波长、吸光度以及单位v 标出最大吸收峰处的波长及吸光度标出最大吸收峰处的波长及吸光度v 在上方注明曲线的名称在上方注明曲线的名称 “血红蛋白及其衍生物吸收光谱曲线血红蛋白及其衍生