第二章 生化制药工艺技术基础

1、2021-9-241第二章第二章 生化制药技术工艺基础生化制药技术工艺基础2021-9-242l天然生物材料制备生化药物的过程大体为： 原料的选样和预处理；原料的粉碎；提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程；纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程；干燥及保存；制剂，即原料药经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂等供临床应用的各种剂型。2021-9-243l原料选择的基本原则 要选择有效成分含量高的新鲜材料； 来源丰富易得； 制造工艺简单易行； 成本比较低； 经济效果要好。 2021-9-244l一、 机械法 粉碎少量原料时，

2、可使用高速组织捣碎机(10000rmin)、匀浆器、研钵等。工业生产上一般常用的粉碎设备有电磨机、球磨机、万能粉碎机，绞肉机、击碎机等。 二 、物理法 1反复冻融法 ； 2冷热交替法 ； 3超声波处理法；4加压破碎法 。 2021-9-245l三三 、生化和化学方法、生化和化学方法 1自溶法自溶法 2溶菌酶处理法溶菌酶处理法 3. 表面活性剂处理法表面活性剂处理法 2021-9-246l分固-液、液-液提取l提取条件的选择：溶剂、PH值、温度l影响提取的因素：被提取物质溶解度的大小、 扩散作用的影响、分配作用的影响l超临界流体萃取： 2021-9-247 主要应用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法

3、、pI沉淀法、膜分离法、层析法、凝胶过滤法、离子交换法等。一、盐析法 1.盐析及方法 利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中，溶解度不同程度的降低来进行分离纯化的方法。有Ks法和法。 2.特点 对设备和条件要求低，安全，应用范围广泛。在高浓度盐存在下，蛋白质不易发生变化，一般可在室温下进行操作。 分辨率低， Ks法多用于提取液的前期分离工作。 2021-9-248l一、盐析法 3.常用的中性盐和加入方式 常用中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸纳、氯化钠、磷酸钠等。硫酸铵的盐析能力强，饱和溶液浓度大，溶解度受温度影响小，一般不会使蛋白质变性，缺点是缓冲能力差，pH常在4555之间。但价廉易得，分段分离效果也

4、比其他盐类好。 加入方式：分步固体盐或饱和溶液 2021-9-249l一、盐析法 4.盐析时应注意的问题 (1) 盐饱和度的影响；(2) pH的选择； （3）蛋白质浓度的影响；（4）温度的影响； （5）盐析沉淀物的脱盐； 2021-9-2410l二、有机溶剂沉淀法 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称有机溶剂沉淀法。乙醇和丙酮是最常用的有机溶剂。 有机溶剂沉淀法比盐析法分辨力强，沉淀也好过滤，但对有些生物活性物质能引起失活和变性。应用时还应注意防止溶剂挥发和火灾等。 2021-9-2411l有机溶剂沉淀时应注意的问题 1 控制工艺过程的温度； 2 防止溶剂局部浓度过

5、高； 3 及时处理沉淀物； 4 pH值的选择; 5 比盐析法条件严格; 2021-9-2412l三、等电点沉淀法 l等电点： 2021-9-2413l三、等电点沉淀法 利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同的等电点的特性进行分离的工艺过程，称等电点沉淀法。由于各种蛋白质在等电点时，仍有一定的溶解度而沉淀不完全，多数蛋白质的等电点又都十分接近，所以单独使用效果不理想，分辨力差，多用于提取后除杂蛋白，实际生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法联合使用。2021-9-2414l四、膜分离法 膜分离技术包括超滤、反渗透析、电渗析、微孔过滤、气体渗析和超精密过滤等，其中超滤、反渗透析、微孔过滤

6、和超精密过滤在医药领域中的应用较为常见。1超滤 在液压（氮气或真空）驱动下，分离粒子的范围，一般为0001一001m（溶剂和小分子透过），适用于酶和蛋白质类生化药物的分离、浓缩、脱盐、提纯、除菌、除病毒和热原等。 2021-9-2415l四、膜分离法 1超滤2021-9-2416l四、膜分离法 1超滤 参数：膜（纤维素硝酸酯或醋酸酯、芳香酰胺纤维等）；水的流速；相对分子质量的截止值(截留分子量)。 超滤设备：管式、多层板式、卷式和中空纤维型等。国外发展较快的是一种内压式中空纤维型。 2021-9-2417l四、膜分离法 2.反渗透 溶剂从溶液浓度高的一侧传递到浓度低的一侧，称反渗透。 分离介质

7、：高分子透过性薄膜 ； 设备：与超滤相仿 应用：美国Millipore设计的反渗透装置，已有100多套，生产符合美国药典的纯水或注射用水，还用于氨基酸、激素的浓缩等 2021-9-2418l四、膜分离法 3微孔滤膜 由高分子材料制成的薄膜过滤介质，可以过滤一般介质不能截留的细菌和微粒。膜的微孔径在02一l0m之间。过滤器有板式和管式两种。广泛应用于滤除微粒和微生物，如滤除大输液和水针剂中的污染微粒；还有热敏性药物的除菌，如胰岛素、C0A、ATP、血清蛋白、丙种球蛋白、激素等。 2021-9-2419l四、膜分离法 4超精密过滤 以聚乙烯醇为主体的中空多孔滤膜，分级性能在超滤膜与微孔滤膜之间，为

8、00102m。用于水的精制(脱除铁质、菌和微粒)、循环水的净化、除悬浮固体离子以及糖液、酶液的精制等。 2021-9-2420l五、离子交换法（离子交换层析 ） 1、基本原理 离子交换树脂 ：载体、功能团、平衡离子 载体：树脂（苯乙烯型、丙烯酸型、酚醛型）、 纤维素、葡聚糖凝胶。 功能团：磺酸根、磷酸根、羧基；季胺盐、伯仲叔胺基；CM、DEAE等。 平衡离子：氢离子、钠离子、氢氧根离子、2021-9-2421l五、离子交换法（离子交换层析 ） 2、树脂种类 第一类 强酸性阳离子交换树脂； 第二类 弱酸性阳离子交换树脂； 第三类 强碱性阴离子交换树脂 ； 第四类 弱碱性阴离子交换树脂； 2021

9、-9-2422l五、离子交换法（离子交换层析 ） 3、影响交换速度的因素 2021-9-2423l五、离子交换法（离子交换层析 ） 3、影响交换速度的因素 树脂颗粒大小、搅拌和流速、离子浓度、离子的水合半径、酸碱性的强弱和溶液pH值、交联度的大小、有机溶剂、交换容量。 2021-9-2424l五、离子交换法（离子交换层析 ） 4、离子交换操作方法（1）树脂的选择 当目的物具有较强的碱性和酸性时，宜选用弱酸性和弱碱性的树脂； 氨基酸多用强酸树脂；蛋白质、酶和其它生物大分子的分离多采用弱碱或弱酸性树脂，以减少生物大分子的变性，有利于洗脱，并提高选择性。 另外因素：孔径、化学稳定性、机械性能等202

10、1-9-2425l五、离子交换法（离子交换层析 ） 4、离子交换操作方法 （2）树脂的处理和再生 （3）基本操作方法 操作方式：静态和动态 洗脱方式：静态和动态；洗脱液分酸、碱、盐、溶剂等。2021-9-2426l六、凝胶层析 定义：指混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，因其各种物质分子大小不同而被分离的技术。又称凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。也称阻滞扩散层析、排阻层析等。 特点：设备简单，操作方便，分离效果好，回收率高，分离条件缓和，不致引起生物活性物质变性和失活，凝胶可重复使用无需繁复的再生处理。缺点是分离速度较慢。广泛应用于分离氨基酸、多肽、蛋白质、酶及多糖等生化物质

11、。 2021-9-2427l六、凝胶层析 1基本原理 2021-9-2428l六、凝胶层析 2几种常用凝胶 葡聚糖凝胶 （Sephadex G ）是一种非离子型的无定形或称珠状颗粒物质，化学性质比较稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液。含有少量的羧基，故对阳离子有轻微的吸附作用。 聚丙烯酰胺凝胶（生物凝胶P ）在pH2一11范围内使用。它由碳碳骨架构成，完全是惰性的，适宜作为凝胶层析的载体。缺点是不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团。 2021-9-2429l六、凝胶层析 2几种常用凝胶 琼脂糖凝胶（瑞典sepharose美国称BioGelA，英国称Sagavac等。）是

12、一种天然凝胶，不是共价交联，是以氢键交联的。不同孔隙程度是以改变琼脂搪浓度而达到的。化学稳定性不如葡聚糖凝胶。 疏 水 性 凝 胶 常 用 的 为 聚 甲 基 丙 烯 酸 酯(Polmethacrylate)凝胶或以二乙烯苯为交联剂的聚苯乙烯凝胶(如Styroge1及BioBeadsS)。 2021-9-2430l六、凝胶层析 2几种常用凝胶2021-9-2431l六、凝胶层析 3.影响凝胶层析的因素 (1)凝胶的选择（考虑凝胶特性以及分离目的和样品的性质）； (2)洗脱液流速（约在30200m1/h ）； (3)离子强度和pH值； (4)分离液体积通常为凝胶床总体积的5-10； (5)柱的长

13、度和直径（长径之比通常为10：1或7：1 ）；（6）V0和Vi （ 装填良好的柱，V0和Vi的值的比率应为40%-60% ）。 2021-9-2432l六、凝胶层析 4、凝胶层析的应用（1）脱盐；（2）分子量测定；（3）去热原和分离纯化；2021-9-2433l七、亲合层析 1基本原理 定义：利用生物大分子的特异亲和力而设计的层折技术。 特点：从粗提液中，通过一次简便处理便可获得高纯度的活性物质，既可分离一些生物材料中含量极微的物质，又能分离一些性质十分相似的物质。具有设备要求不高，操作简便，适用范围广，特异性强，分离速度快，效果好，条件温和等优点。但亲合吸附剂的通用性较差，洗脱条件较苛刻。

14、2021-9-2434七、亲合层析1基本原理配基：可逆结合的特异性物质。载体：与配基结合的层析介质。配体： 2021-9-2435l七、亲合层析 2几种常用载体 （1）琼脂糖凝胶 Sepharose 2B、4B和6B(Pharmacia)和U1trogelsA一2，A4，A一6(LKB)。这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快，非专一性吸附少; Sepharose CL是用2，3二溴丙烷处理的交联琼脂糖，它的稳定性明显增加，能在pH3一14中应用，扩大了亲和柱制备时化学反应选用的范围，并能经受比较剧烈的洗脱条件。 2021-9-2436l七、亲合层析

15、 2几种常用载体 其他的还有葡聚糖凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶 、多孔玻璃珠 等。 3. 配基 特殊配基：底物、抑制剂、辅因子（酶）；抗原、病毒、细胞（抗体）；互补的碱基顺序、组蛋白、核酸聚合酶（核酸）。 通用配基：蛋白质A- Sepharose CL-4B（IgG及其系列）、ConA- Sepharose (-D-呋喃葡萄糖、 -D-呋喃甘露醇)等。2021-9-2437l七、亲合层析 4 影响吸附剂亲和力的几个因素 (1)配基浓度（配体浓度）； (2)空间障碍（特别是亲合力低或分子量大而配基为小分子）； (3)配基与载体的结合位点； (4)载体孔径； (5)微环境 ； 5洗脱条件 2021

16、-9-2438l浓缩 手段：蒸发、沉淀 蒸发浓缩装置：薄膜蒸发浓缩 、减压蒸发浓缩 、吸收浓缩（最常用的吸收剂有聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、凝胶等 ） 等。2021-9-24392021-9-2440l结晶 一般生化药物结晶的条件：纯度 、浓度、pH 、温度、时间以及晶种等。 2021-9-2441l干燥 干燥是从湿的固体生化药物中除去水分或溶剂而获得相对或绝对于燥制品的工艺过程。通常包括原料药的干燥和制成的临床制剂的干燥。 最常用的方法：常压干燥、减压干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等，其干燥设备主要有：厢式干燥器、真空干燥器、冷冻干燥器、管式气流干燥器、沸腾干燥器、喷雾干燥器等等。 2021-9-2442l一、喷雾干燥 将液体通过喷射装置喷成雾滴后，在一定流速的热气流中，迅速蒸发干燥的方法。实验表明：把含水量为80左右的1L溶液，喷成直