3.1-NA_tech-ISOLATION

1、 第三章第三章核酸研究技术核酸研究技术1 u 核酸电泳技术核酸电泳技术u核酸的分离和纯化技术核酸的分离和纯化技术u DNA限制酶切和连接技术限制酶切和连接技术u遗传转化遗传转化u PCR技术技术u 分子杂交技术分子杂交技术 u 核酸序列的测定核酸序列的测定2第一节第一节核酸的分离和纯化核酸的分离和纯化31、供体的核酸分离、供体的核酸分离 供体细胞供体细胞/组织组织 收集收集(菌体菌体)细胞细胞 细胞破碎细胞破碎 分离分离总总DNA 分离细胞器分离细胞器 分离分离总总RNA 分离分离细胞器细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性特异性RNA 染色体染色体DNA(组建基因组文库组建基因组

2、文库)一一.一般程序一般程序4 载体载体DNA 感染或转染细胞（病毒型）感染或转染细胞（病毒型） 转化细菌细胞（质粒型）转化细菌细胞（质粒型） 分离病毒颗粒分离病毒颗粒 培养转化细胞、收集菌体培养转化细胞、收集菌体 病毒载体病毒载体DNA分离与纯化分离与纯化 破碎细胞破碎细胞 质粒质粒DNA分离与纯化分离与纯化 3. DNA片段的分离片段的分离 DNA 限制酶切限制酶切 凝胶电泳分离凝胶电泳分离 特定特定DNA 片段的回收片段的回收2.载体载体DNA分离分离5 1) 凝胶电泳凝胶电泳: 2) 光密度值测定光密度值测定: A260/A280=1.8 3) 限制酶切分析限制酶切分析:4. 质量评估

3、质量评估6 1. 酶法酶法 利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使原生质体裂解。原生质体裂解。 1) 细菌：溶菌酶细菌：溶菌酶 2) 酵母：蜗牛酶、酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase 等等 3) 丝状真菌：丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶、溶壁酶、纤维素酶 4) 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满足酶的最佳反应条件。

4、满足酶的最佳反应条件。二二.细胞裂解细胞裂解7 1) 压力剪切法：压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌（芽孢和压力机，酵母细胞，细菌（芽孢和G+球球菌除外）菌除外） 2) 射击破碎法：射击破碎法：Braun破碎机，搅切器（破碎机，搅切器（blender），混合器），混合器（mixer），），0.1-0.45mm玻璃球玻璃球 3) 固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（0.10.45mm）同时致）同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4) 反复冻融法反复冻融法 2. 机械法机械法81.供体供体DNA的分离与纯化的分离与纯化 要求：

5、尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。 1) 基因组大小基因组大小：染色体染色体细菌细菌 33004200kb酵母酵母 15,000 kb果蝇果蝇 1.28x105 kb人人 3x106 kb植物植物 2x1051x108 kb 天花病毒天花病毒 288 kb痘病毒痘病毒 196 kb质体质体 几几100以上以上kb线粒体线粒体 藻类藻类 线状线状 15 kb酵母酵母 环状环状 1978 kb植物植物 环状环状 100150 kb动物动物(扁虫到人扁虫到人)环状环状 1518 kb锥虫锥虫 网状网状 6000 kb(幼体幼体)短膜虫短膜虫 网状网状

6、30,000 kb(幼体幼体)三三. DNA的分离与纯化的分离与纯化9 细胞裂解细胞裂解离心去除细胞碎片离心去除细胞碎片 苯酚抽提苯酚抽提 乙醇沉淀乙醇沉淀 RNA去除去除(如有必要如有必要, 可用可用CsCl密度密度梯度离心进一步纯化梯度离心进一步纯化DNA)裂解依赖于细胞特点裂解依赖于细胞特点,如酶法如酶法,机械破碎等机械破碎等.此外在抽提此外在抽提缓冲液中通常加入去垢剂等缓冲液中通常加入去垢剂等上清液用水饱和苯酚上清液用水饱和苯酚/氯仿抽提氯仿抽提23次次, 再用氯仿抽至再用氯仿抽至界面无蛋白变性物界面无蛋白变性物上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀, 沉淀物用沉淀物

7、用70%冷乙醇洗涤冷乙醇洗涤,干燥干燥加入加入RNAase处理除去处理除去RNA2) DNA分离纯化过程分离纯化过程10 在在DNA上清液中加入上清液中加入固体固体CsCl与与EtBr溶液溶液, 超超速离心速离心(45,000rpm)1624 h, 穿孔取出穿孔取出DNA(320nm), 最后用异丙醇抽提溴乙锭最后用异丙醇抽提溴乙锭,透析去除透析去除 CsCl, 乙醇沉淀乙醇沉淀 DNA, 离心离心,洗涤洗涤,干燥干燥. *CsCl法操作步骤少法操作步骤少, 分离分离DNA分子量大分子量大, 耗财多耗财多,且需超速离心机且需超速离心机.。 苯酚法耗时少苯酚法耗时少, 不需昂贵仪器不需昂贵仪器,

8、 但操作步骤多但操作步骤多, 易使易使DNA分子断裂。分子断裂。 若小若小 心操作心操作, 所获所获DNA亦符合要求亦符合要求.*CsCl密度梯度离心密度梯度离心11 植物组织植物组织用核分离缓冲液匀浆用核分离缓冲液匀浆, 过滤过滤, 离心离心(2000g, 10,4) 核缓冲液使核裂解核缓冲液使核裂解(含含0.5%Triton X-100), 抽提抽提DNA 植物组织植物组织用细胞器缓冲液匀浆用细胞器缓冲液匀浆, 离心离心(100g, 10,4)除去细胞除去细胞核核, 离心离心(1800g, 10,4)分离叶绿体分离叶绿体; 离心离心(10,000g, 10,4)分离线粒体分离线粒体, DN

9、ase除去细胞器外除去细胞器外DNA, 加入加入EDTA使使DNase失活失活 , 纯化细胞器纯化细胞器, 细胞器裂解细胞器裂解, 提取提取DNA 3) 细胞器细胞器DNA的分离的分离122. 载体载体DNA的分离与纯化的分离与纯化 1) 质粒载体质粒载体DNA的分离的分离 关键：关键：如何使质粒如何使质粒DNA与宿主染色体与宿主染色体DNA分开分开 原理：原理：质粒质粒DNA比染色体比染色体DNA 小得多小得多, ,在在DNA抽提过程中，染抽提过程中，染色体色体DNA断裂成小片段断裂成小片段(线状线状), 质粒质粒DNA仍保持超螺旋构型仍保持超螺旋构型 方法：方法：. 超速离心：利用两种超速

10、离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型分子的大小和空间构型 . 变性法：在变性条件下使染色体变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链变为单链, 而质而质粒粒DNA仍保持环状结构仍保持环状结构, 当变性条件发生迅速变化时当变性条件发生迅速变化时, 前者仍不能前者仍不能复性复性, 而后者又可回复到天然构型而后者又可回复到天然构型. (变性条件可采用加热煮沸法变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法或碱变性法)13 2) 噬菌体载体噬菌体载体DNA的分离的分离 纯净病毒颗粒纯净病毒颗粒, 病毒载体病毒载体DNA M13mp载体可采用质粒载体可采用质粒DNA的分离方法的分离方法 质质 粒粒DNA 的的

11、分分 离离14 1. 制备制备RNA的关键的关键防止内外源防止内外源RNase的作用的作用 1) RNase的特点：抗酸抗碱的特点：抗酸抗碱,具很广具很广pH作用范围作用范围; 抗高温严寒抗高温严寒(065均具活性均具活性);抗变性剂抗变性剂 2) 解决办法：外源解决办法：外源RNase高温高温,焦磷酸二乙酯焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有溶处理所有溶液液(TrisHCl除外除外)和器皿和器皿, 操作者带手套操作者带手套. 内源内源RNase高温抽提高温抽提,强蛋白质变性剂强蛋白质变性剂,RNase抑制剂抑制剂,蛋白酶蛋白酶K等等. 四四. RNA的分离与纯化的分离与纯化15 根据所用蛋白质变

12、性剂种类不一样分为以下三种制备方法：根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法： 1）热苯酚抽提法）热苯酚抽提法 2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法尿素法其中以胍盐法最好其中以胍盐法最好, ,对于从那些对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中含量很高的组织（胰脏）中提取提取RNA特别有效特别有效, ,可使可使RNase迅速变性迅速变性, ,制备的制备的RNA有较高翻译活有较高翻译活性性. .在在RNA制备中制备中, ,细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的. .2. 总总RNA的制备的制备16 1) 多聚核

13、糖体的分离多聚核糖体的分离 超速离心法（超速离心法（30-40万万g，离心，离心2-3 h） 镁盐沉淀法（镁盐沉淀法（0.1 M Mg+） 分级分离法分级分离法分离特异性多聚核糖体分离特异性多聚核糖体 3.多聚核糖体多聚核糖体RNA的制备的制备17 i. 结合与游离核糖体的分离，这种方法可避免溶酶体破裂。结合与游离核糖体的分离，这种方法可避免溶酶体破裂。 ii. 核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的 多聚核糖体多聚核糖体 iii.核糖体免疫沉淀法核糖体免疫沉淀法 (可分离到含量仅为可分离到含量仅为1%的的mRNA, 依赖于依赖

14、于抗体纯度等抗体纯度等) *直接免疫沉淀法直接免疫沉淀法 新生肽链新生肽链+抗体抗体 蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心 * * *间接免疫沉淀法间接免疫沉淀法 新生肽链新生肽链+ +抗体抗体+ +抗抗- -抗体（二抗）抗体（二抗） 不不 可可溶复合物溶复合物 离心分离离心分离 *免疫亲和层析法免疫亲和层析法 新生肽链新生肽链-抗体复合物抗体复合物 不溶交联抗原基不溶交联抗原基 质亲和层析柱吸附质亲和层析柱吸附 洗脱洗脱182) 多聚核糖体多聚核糖体RNA的分离的分离纯化多聚核糖体纯化多聚核糖体+SDS 蔗糖密度梯度离心或蛋白酶蔗糖密度梯度离心或蛋白酶K-苯酚抽提苯酚抽提 19 1) 分子量大小

15、分级分离分子量大小分级分离 i. 蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心 ii. 凝胶电泳凝胶电泳 2) 核酸序列分级分离核酸序列分级分离 i. 分子杂交法：适用于同源性很高的分子杂交法：适用于同源性很高的RNA的分离的分离 DNA分子变性分子变性, 结合到结合到NCF, RNADNA杂交杂交, 洗涤洗涤, 洗膜洗膜, 乙醇沉淀乙醇沉淀 ii. 亲和层析法：亲和层析法： 低聚低聚dT纤维素纤维素: 用于用于poly(A)较长的较长的mRNA； 多聚多聚U琼脂糖琼脂糖: 用于用于poly(A)较短的较短的mRNA（20A） RNA进样吸附进样吸附, 洗涤洗涤, 洗脱洗脱, 收集收集260 nm处吸收峰

16、样品处吸收峰样品, 乙醇沉淀乙醇沉淀 iii. 无无poly(A) mRNA的分离的分离 纯化多聚核糖体纯化多聚核糖体, 核糖体亚基核糖体亚基+mRNP, mRNP, 蛋白酶蛋白酶K , mRNA, 低聚（低聚（dT）纤维素层析纤维素层析, 洗出液洗出液, 乙醇沉淀（无多聚乙醇沉淀（无多聚A mRNA）4. RNA的分级分离的分级分离20 1) 光密度值测定法光密度值测定法 A260/A280=2.0 2) 凝胶电泳凝胶电泳 3) 体外蛋白质翻译体外蛋白质翻译 5. RNA的质量评估方法的质量评估方法21细胞裂解物细胞裂解物 胍盐法胍盐法 总总RNA 分子杂交法分子杂交法 特异特异RNA分子分

17、子 热苯酚法热苯酚法 凝胶电泳凝胶电泳 围围RNA大小分级分离大小分级分离 大小范大小范蔗糖密度蔗糖密度梯度离心梯度离心 一定一定 LiCl/ 核酸序列核酸序列 尿素法尿素法离心离心 分级分离分级分离 亲和层析法亲和层析法 poly（A）RNA分子分子 高速离心法高速离心法 全部多聚核糖体全部多聚核糖体 上清液上清液 镁盐沉淀法镁盐沉淀法蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心结合与结合与游离多聚核糖体游离多聚核糖体分级分离法分级分离法 蔗糖连续密度蔗糖连续密度一定范围大小核糖体一定范围大小核糖体多聚核糖体多聚核糖体RNA免疫沉淀法免疫沉淀法特异性多聚核糖体特异性多聚核糖体 22 五五. 核酸的试剂盒

18、分离与纯化核酸的试剂盒分离与纯化 GeneBallTM Genome Preparation Kit使用经特殊处理的小珠GeneBall，可以从全血或培养细胞中简便、快速提取高纯度的基因组DNA。具有以下特点：1. 操作快速、简便。GeneBall直径为6.5 mm，DNA和GeneBall结合后，可以很容易利用重力和液体分离，整体操作只需在一个离心管中进行。从 1 ml全血中抽提基因组DNA只需约1小时左右。2. 高性能。一次可以处理1 ml的全血或106的培养细胞。3. 收率高、完整性好、纯度高。从1 ml的EDTA处理全血中可以提取3060 mg的完整性较好的基因组DNA，DNA的OD2

19、60/OD280=1.82.1。4. 使用安全。无需使用有害溶剂。23Blood Genome DNA Extraction Kit试剂盒含有GenTLE Solution I、II、III三种溶液。GenTLE Solution I中的阳离子表面活性剂在破坏血细胞的同时，与核酸形成电中性复合体。将该复合体离心收集并用GenTLE Solution II 清洗后，在沉淀中加入GenTLE Solution III，将DNA分离出来后再加入异丙醇将DNA沉淀回收。整个操作只需40分钟左右，便可提取高纯度DNA，操作十分简单方便。由于GenTLE Solution I具有破坏菌体和病毒粒子的作用，

20、对于处理有可能发生病源菌等污染的样品非常有利。适用于尚未凝固的全血，又适用于经各种抗凝剂处理过的全血，无论经过哪种抗凝剂处理，每100 ml人的血液都能得到1 mg以上的 DNA，其纯度A260/280可达1.8 2.0。提取的DNA可用于PCR扩增和限制酶酶切等。24血细胞血细胞/培养细胞基因组培养细胞基因组DNA小量纯化试剂盒小量纯化试剂盒TaKaRa MiniBEST Blood & Cultured Cell Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2.0用于血细胞/动物培养细胞基因组DNA小量纯化。试剂盒采用了独特的细胞裂解系统，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组

21、DNA，然后使用特殊的相分离法除去杂质，再结合DNA制备膜技术纯化基因组DNA。具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需1小时。可从10 200 ml的全血（含抗凝剂）或从1103 5106的培养细胞中纯化得到1 10 mg的高纯度基因组DNA（OD260/OD280= 1.8 2.0)。此基因组DNA可用于各种分子生物学实验。25细菌基因组细菌基因组DNA小量纯化试剂盒小量纯化试剂盒TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2.0 用于细菌基因组DNA小量纯化。采用独特的细胞裂解系统，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DN

22、A，然后使用特殊的相分离法除去杂质，再结合DNA制备膜技术纯化细菌基因组DNA。具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需1小时。可从 1 4 ml过夜培养菌中得到1 10 mg高纯度基因组DNA（OD260/OD280 = 1.8 2.0)。可用于各种分子生物学实验。26动物组织基因组动物组织基因组DNA小量纯化试剂盒小量纯化试剂盒TaKaRa MiniBEST Animal Tissue Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2.0用于动物组织基因组DNA小量纯化。可从1 20 mg动物组织中纯化得到1 10 mg的高纯度基因组DNA（OD260/OD280= 1.

23、8 2.0)。此基因组DNA可用于PCR反应、Southern杂交以及RAPD、AFLP、RFLP分析等各种分子生物学实验。 27植物基因组植物基因组DNA小量纯化试剂盒小量纯化试剂盒TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2.0用于植物基因组DNA小量纯化。可从 10 150 mg植物组织或1103 1107的植物培养细胞中纯化得到1 10 mg的高纯度基因组DNA（OD260/OD280=1.8 2.0)。此基因组DNA可用于PCR反应、Southern杂交以及RAPD、AFLP、RFLP分析等各种分子生物学实验。28Ca

24、trimox-14TM RNA Isolation Kit Ver. 2.11Catrimox-14TM是一种阳离子表面活性剂，有抑制血液中RNase的作用，能从少量血液中简单、高效地提取总RNA。Catrimox-14TM也适用于动物培养细胞中的总RNA的提取。Catrimox-14TM能在破坏血细胞和其他动物培养细胞的同时，和核酸形成电中性复合体，很容易从血液和其他动物培养细胞中提取RNA。将少量血液直接与Catrimox-14TM混合、离心收集，再使用氯化锂法或异硫氰酸胍法，便能高效地提取RNA。Catrimox-14TM同时具有破坏菌体和病毒粒子的作用，这对提取被病原菌等污染的样品时非

25、常有利。从培养细胞中提取的RNA的纯度为OD260/OD2802.0；进行RT-PCR反应时也显示出极高的纯度。Catrimox-14TM特别适用于从RNA含量低于100 mg的少量样品中提取RNA。29病毒颗粒高效浓缩试剂盒病毒颗粒高效浓缩试剂盒TaKaRa High Efficiency Virion Enrichment Kit使用Solution A、B、C三种溶液，可以方便快速地从数毫升乃至数十毫升的各种临床样本中高效浓缩病毒颗 粒 ， 全 套 操 作 仅 需 3 0 分 钟 。Solution A可对溶液中的病毒颗粒进行盐析，加入Solution B后液体形成相分离，此时病毒颗粒与样本中的蛋白质一起将会形成凝集物集中于溶液的上下相间，加入Solution C消除相分离后离心分离收集病毒凝集物。由于浓缩病毒所使用的试剂可以灭活病毒和抑制RNase活性， 所以能够避免病毒污染，防止RNA的降解。30病毒病毒RNA/DNA快速