纤化及研究方法-木素

1、植物纤维化学及研究方法植物纤维化学及研究方法 梁 辰 College of light industry and food engineering, GXU content l植物纤维化学 l木素 l木素的分离方法 l木素的化学结构研究方法 l木素-碳水化合物复合体 植物纤维化学植物纤维化学 J. Phys. Chem. C. 2010, 114, 1869318697 Chem. Rev. 2010, 110, 35523599 化学组成分析化学组成分析 l水分 l灰分 l抽出物 l综纤维素 l纤维素 l半纤维素 l木素 /biomass/analytic

2、al_procedures.html 国标GB 木（质）素木（质）素 lignin G S H l制浆漂白过程 l化学改性 l生物质精炼 l羟基 l羧基 l醚键 l酯键 J. Am. Chem. Soc., 2011, 133 (50), pp 2027720287 木（质）素木（质）素 lignin 木（质）素木（质）素 lignin l木素结构鉴定的基本步骤 l分离木素，并尽量使木素不发 生变化 l木素样品的元素分析（定量） l木素样品的功能基分析 l三种结构单元的比例分析 l木素的温和降解，获得二聚体、 三聚体等，分析结构单元之间 连接键类型及比例 木素的分离方法木素的分离方法 Brau

3、ns木素BNL 酶-弱酸解木素EMAL 水解（降解）木素 Bjorkman木素MWL 酶解木素CEL(EIL) Bjorkman提出，但含有太 多碳水化合物 Lundquist利用液-液萃取， 去除碳水化合物 得率低，代表性差(25%)， 产生的化学变化不可预测 Pew & Weyna提出 Chang利用高酶活的纤维 素酶和半纤维素酶 得率高，但碳水化合物多 过程复杂 木素的分离方法木素的分离方法 l利用含有半纤维素酶的纤维素酶，降 解大部分的碳水化合物，提高木素的 可溶性 l含水二氧六环溶解木素，弱酸条件下 部分木素与碳水化合物之间的键接 l得率在总木素的35%50% l应避免蛋白质干扰，尽

4、量降低酶用量， 使用高酶活的纤维素酶必要时测氮 含量 酶-弱酸解木素EMAL 木素的分离方法木素的分离方法样品处理样品处理 lPulp/chips was ground to pass a 20 mesh screen in a Wiley mill lSoxhlet extracted with acetone for 48 h. lpowder was air-dried lstored in a desiccator under vacuum. l特殊情况化学浆的EMAL 纸浆/原料 风干 extractive-free powder 过20目筛 抽提 磨粉 先用丙酮抽提先用丙酮抽提 4

5、8h48h，最后阶段最后阶段 再加入再加入10%10%水水 先用苯醇抽提先用苯醇抽提 48h48h，再用乙醇，再用乙醇 抽提数天抽提数天 置于真空干燥器，置于真空干燥器， 加干燥剂（五氧加干燥剂（五氧 化二磷）化二磷） 冷冻干燥（先冷冷冻干燥（先冷 冻过夜）冻过夜） 木素的分离方法木素的分离方法样品处理样品处理 lExtractives l苯-乙醇 l丙酮 l二氯甲烷 l甲醇 l风干 l挥发溶剂之后 才能放入干燥 器或冻干室 extractive-free powder Gutirrez, A. Journal of Chromatography A. 1998, 823( 12): 4494

6、55 木素的分离方法木素的分离方法MWL l旋转式球磨罐中加入的球磨珠占总体积的18%、振 动式的32% l球磨珠（玻璃or钢）与extractive-free wood powder的质量比为16.6 l使用甲苯作为分散体，加入量约为罐体的80%（V） l球磨时间 2 to 96 h（4872），温度低于35C. Ball milling Extract lDioxane/water(96:4,v/v)用量5-10mL/g l慢速搅拌、萃取24h l离心分离出清液，残渣重复上述步骤两次 l三次清液合并，旋转蒸发除去溶剂 l残渣可用于制备LCC 离心去离心去 除甲苯除甲苯 后干燥后干燥 Pur

7、ify 木素的分离方法木素的分离方法MWL Ball milling Extract 离心去离心去 除甲苯除甲苯 后干燥后干燥 Purify 溶于醋酸溶于醋酸/水（水（9/1） 不溶物 搅拌下，滴入水中 沉淀真空干燥沉淀真空干燥 溶于溶于CH2Cl2/乙醇（乙醇（2/1） 不溶物 滴入无水乙醚中 沉淀立即用无水乙醚洗沉淀立即用无水乙醚洗2次次 低沸点石油醚洗1次 沉淀干燥沉淀干燥 *分离采用离心分离采用离心 木素的分离方法木素的分离方法MWL Purify溶于吡啶溶于吡啶/醋酸醋酸/水（水（9/1/4） 沉淀层和水层 摇晃后，静置12 h分层 后摇荡，再次分层后， 分离出下层溶有木素的下层溶有

8、木素的 有机层有机层 萃取（两次）萃取（两次） 有机层浓缩（旋转）有机层浓缩（旋转） 滴入10倍体积无水乙醚中 沉淀立即用无水乙醚洗涤沉淀立即用无水乙醚洗涤 沉淀（浅黄色）干燥沉淀（浅黄色）干燥 *沉淀分离沉淀分离 采用离心采用离心 约等体积的氯仿约等体积的氯仿 置于真空干燥器，加干燥置于真空干燥器，加干燥 剂（五氧化二磷）剂（五氧化二磷） 冷冻干燥（先冷冻过夜）冷冻干燥（先冷冻过夜） 木素的分离方法木素的分离方法CEL l原料和高得率 浆仍需研磨 （ball milling） l化学浆较易与 酶反应，可不 用研磨 l纯化参照MWL HYP 化学浆化学浆 木素的分离方法木素的分离方法EMAL

9、extractive-free powder enzymatic hydrolysis mild acid hydrolysis Purify E MA 1. NaAc/HAc（pH=4.8）缓冲溶液）缓冲溶液 2. 纤维素酶用量为纤维素酶用量为360 IU/g 3. 40的摇床内连续酶解的摇床内连续酶解48 h，100 r/min 4. 酶解后，离心弃去上层清液，沉淀第二次酶解后，离心弃去上层清液，沉淀第二次 酶解酶解 5. 离心沉淀物用离心沉淀物用pH=2的盐酸溶液洗涤数次的盐酸溶液洗涤数次 6. 真空冷冻干燥机冷冻干燥真空冷冻干燥机冷冻干燥 木素的分离方法木素的分离方法EMAL extr

10、active-free powder enzymatic hydrolysis mild acid hydrolysis Purify E MA 1. HCl浓度为浓度为0.05mol/L的二氧六环的二氧六环-水水 （85:15） 2. 在氮气保护下回流在氮气保护下回流2h 3. 过滤得到深红色滤液，二氧六环洗涤滤渣过滤得到深红色滤液，二氧六环洗涤滤渣3 遍遍 4. 洗涤液和滤液混合，洗涤液和滤液混合，NaHCO3中和至中性中和至中性 5. 旋转蒸发器进行浓缩至旋转蒸发器进行浓缩至2mL左右左右 6. 浓缩液滴至浓缩液滴至pH为为2（硫酸）的水中（硫酸）的水中（10倍体倍体 积）积） 7. 离

11、心分离沉淀，冷冻干燥，得到粗木素样品。离心分离沉淀，冷冻干燥，得到粗木素样品。 木素的分离方法木素的分离方法制浆废液中木素制浆废液中木素 l硫酸盐木素 l酸化过滤洗涤 l应先浓缩，提高得率 l酸化常用硫酸或盐酸 lpH=2沉淀大部分木素，逐步酸化可以实现分级 l洗涤使用酸性水 l木素磺酸盐 l与长链烷基形成不溶于水的混合物 l有机溶剂萃取 l水相中再生木素磺酸盐 木素的分离方法木素的分离方法 木素的化学结构研究方法木素的化学结构研究方法 l化学降解分析 l紫外光谱 l红外光谱 l核磁共振 l色谱法 l薄层色谱 l气相色谱 l液相色谱 l凝胶色谱 色谱与光谱色谱与光谱 GC、LC、GPC UV-

12、Vis、IR、 MS、NMR 定量分析定量分析 定性分析定性分析 化学降解分析化学降解分析 l酸解 l醇解 l氧化铜 l高锰酸钾氧化 l碱性硝基苯氧化 色谱法色谱法 lGC-MS lHPLC lGPC GC-MS 分子量大小与分布 Py-GC-MS Rencoret, J., et al. (2011). Plant Physiol 155(2): 667-682. UV(-Vis) l定性分析 l280nm l定量分析 l差示紫外光谱 l溶液中木素含量 （酸溶木素） l阔叶木205nm l针、竹200nm l吸收系数均值 100L/（g*cm） (FT-)IR l注意样品干燥 l固体IR样品

13、的粉 末颗粒大小 (FT-)IR NMR1H、31P、13C 1H-NMR l乙酰化的木素溶于氘代试剂 l氘代氯仿 l氘代丙酮 l氘代DMSO l结构单元上的氢 l缩合单元缩合度 l乙酰化定量各种羟基 1H-NMR Brunow G., Lundquist K. (1980). Paperi ja Puu(11): 669-672. 31P-NMR l测定碳水化合物及 木素的功能基 l酚羟基（Ph-OH） l脂肪羟基 （Aliph-OH） l羧基（COOH） l醛基（CHO）等 l木素中邻醌与对醌 l分析各种醚键结构 150148146144142140138136134 化学位移 脂肪族羟基

14、 内标 对羟基苯 基酚羟基 羧基 愈创木基 型酚羟基 缩合型酚羟基 紫丁香基 型酚羟基 功能基团功能基团积分区域（积分区域（10-6，） 脂肪族羟基脂肪族羟基150.0-145.0 缩合型酚羟基缩合型酚羟基 144.5-143.3 142.4-140.4 紫丁香基型酚羟基紫丁香基型酚羟基143.3-142.4 愈创木基型酚羟基愈创木基型酚羟基140.4-138.7 对对-羟基苯基型酚羟基羟基苯基型酚羟基138.7-137.0 羧基羧基136.0-133.5 31P-NMR 脂肪羟基 G型酚羟基 H型 酚羟基 羧基 WI I H 1000 386.66 105080 1 2 -3 386.66内

15、标胆固醇摩尔质量； I1胆固醇中羟基的积分面积，此处I1=1； I2木素结构中羟基的积分面积； W木素样品质量，mg。 H羟基含量，mmol/g； 80内标胆固醇浓度，mg/mL； 50内标胆固醇用量，L； 31P-NMR 1.溶剂：氘代吡啶和氘代氯仿按8-5（体积比） 2.用上述溶剂准确配制浓度为80 mg/mL的胆固醇 （内标）溶液和11 mg/mL的乙酰基丙酮络酸铬 （驰豫剂）溶液 3.分别称取约40.0mg的干燥木素样品，置于容量为 1 mL带有刻度容量瓶中 4.加入0.65mL氘代溶剂，使木素溶解 5.加入100 uL磷化试剂TMDP 6.分别加入50 uL内标溶液和100 uL驰豫

16、剂溶液 7.用氘代溶剂，定容总体积为1mL，摇动使溶液混 合均匀 8.迅速转移到直径为5 mm的NMR测试管中，放入 NMR仪器的QNP探头中进行测试。 磷化试剂：磷化试剂： 2-氯-4,4,5,5-四甲基 -1,3,2-二氧膦杂戊环 （2-chloro-4,4,5,5- tetramethyl-1,3,2- dioxaphospholane， 简称TMDP） 溶剂：溶剂： Pyridine-d5， Chloroform-d 内标：内标： Cholesterol 驰豫剂：驰豫剂： 乙酰基丙酮络酸铬 （Chromium() Acetylacetonate 31P-NMR 1995 2011 20

17、01 13C-NMR l各种有机物都含C原子 l不同13C的化学位移变化范围 大（022010-6） l化学环境稍有不同的13C核都 有不同的化学位移 John Ralph, Department of Forestry, University of Wisconsin, Madison /faculty/ ralph/ 乙酰化的 木素溶于 DMSO-d6、 丙酮-d6 13C-NMR l定量分析 l化学位移100ppm160ppm之间积分值为6个苯环上的碳和 0.12个乙烯基碳的吸收峰面积的积分值，因此在计算木素中 各个结构含量时，以该化学

18、位移区间的积分值为参考标准 136 )162102( )( I jiI A ji Ai-j为每个苯环上化学位移在ij之间的结构基团的个数 I（i-j）为化学位移在ij之间的积分面积 I（102-162）为化学位移在102-162ppm之间的积分面积 Capanema, E. A., et al. (2004). J Agric Food Chem 52(7): 1850-1860. Capanema, E. A., et al. (2005). J Agric Food Chem 53(25): 9639-9649. 13C-NMR l木素侧链的各种结构含量 （联接方式） l木素结构中各种功能

19、基含量 l苯环上各种结构的含量 l木素结构中缩合结构的含量 2D NMR（HQSC） l一维核磁共 振波谱往往 使一些信号 重叠 l二维核磁共 振技术通过 碳核与氢核 的耦合 13C NMR 1H NMR 氧化脂肪族侧链C-H 共振C/50.0- 95.0ppm H/2.5-6.0ppm） 2D NMR（HQSC） 芳香环上的C-H共振 C/95.0-160.0ppm H/5.5-8.5ppm 多糖 脂肪族侧链C-H共振 C/0-50.0ppm H/0-2.5ppm C H Kim, H. and J. Ralph (2010). Org Biomol Chem 8(3): 576-591.

20、2D NMR（HQSC） Kim, H. and J. Ralph (2010). Org Biomol Chem 8(3): 576-591. 2D NMR（HQSC） Kim, H. and J. Ralph (2010). Org Biomol Chem 8(3): 576-591. 2D NMR（HQSC） Peng, P., et al. (2012). Wood Science and Technology 46(5): 871-885. 木素乙酰化木素乙酰化 1.各称取300 mg木素样品 2.加入15 mL吡啶-醋酸酐（吡啶：醋酸酐为1:2，体积比）混合液使木素 溶解 3.通入

21、氮气赶走瓶中空气后，迅速盖紧瓶塞 4.置于暗处，室温下反应72h，其间经常摇荡 5.木素溶液慢慢滴入搅动着的200 mL乙醚中沉淀出乙酰化木素 6.用乙醚洗涤沉淀多次直至无吡啶气味 7.置入40的真空干燥箱中干燥 8.干燥后的乙酰化木素样品保存于放有P2O5的真空干燥器中备用。 激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜(CLSM) 木素木素-碳水化合物复合体碳水化合物复合体 lLignincarbohydrate complexes(LCC) Lignincarbohydrate complexes(LCC) l旋转式球磨罐中加入的球磨珠占总体积的18%、振 动式的32% l球磨珠（玻璃or钢）与ex

22、tractive-free wood powder的质量比为16.6 l使用甲苯作为分散体，加入量约为罐体的80%（V） l球磨时间 2 to 96 h（4872），温度低于35C. Ball milling Extract lDioxane/water(96:4,v/v)用量5-10mL/g l慢速搅拌、萃取24h l离心分离出清液，残渣重复上述步骤两次 l三次清液合并，旋转蒸发除去溶剂 离心去离心去 除甲苯除甲苯 后干燥后干燥 Residuals from MWL Extract 不溶物 溶液溶液 真空干燥 乙酸-水(1/1，v/v) 2h, 3 times 沉淀沉淀 LCC 溶液溶液 沉

23、淀沉淀 缓慢搅拌下，滴加至 二氯乙烯-乙醇(2/1，v/v) 离心分离 二氯乙烯-乙醇洗一次 无水乙醚洗三次 离心分离 乙酸-水(1/1，v/v) 滴加至丙酮中 溶液 不溶物 溶液 溶液 Balakshin, M., Capanema, E., Gracz, H., et al. (2011). Planta 233(6): 1097-1110. Lawoko, M., Henriksson, G. and Gellerstedt, G. (2005). Biomacromolecules 6(6): 3467 内切葡聚糖酶 尿素 Ara Arabinan Xyl Xylan Man Mannan Gal Galactan Glc Glucan AcOH Acetic acid GC-FID、SEC(GPC) 根据HSQC判断LCC类型 多糖 Balakshin, M., Capanema, E., Gracz