分子生物学：癌基因与抑癌基因

1、癌基因与抑癌基因癌基因与抑癌基因Oncogenes and Anti-oncogenes 生化与分生系生化与分生系 tengxu_第一节第一节肿瘤发生的分子机制肿瘤发生的分子机制肿瘤特点：生长调控系统紊乱肿瘤特点：生长调控系统紊乱增殖与分化失常增殖与分化失常+侵袭与转移侵袭与转移1.从正常细胞演变成癌细胞从正常细胞演变成癌细胞 致癌物反复刺激致基因改变致癌物反复刺激致基因改变正常细胞正常细胞修复修复 癌细胞癌细胞2从癌细胞发展成为临床上的肿瘤从癌细胞发展成为临床上的肿瘤需经历癌细胞与机体抗癌反应性之间的矛盾斗争过程需经历癌细胞与机体抗癌反应性之间的矛盾斗争过程正常细胞正常细胞转化细胞转化细胞

2、扁平、有序、贴壁扁平、有序、贴壁 接触抑制接触抑制 生长依赖血清生长依赖血清 无致癌能力无致癌能力 叠加、无序、无需贴壁叠加、无序、无需贴壁 无接触抑制无接触抑制 不依赖生长因子不依赖生长因子 使裸鼠产生肿瘤使裸鼠产生肿瘤培养的正常细胞和转化细胞的差异培养的正常细胞和转化细胞的差异肿瘤发生机制的认识过程n1928年，细胞突变学说n基因表达失调学说n20世纪70年代后，癌基因与抑癌基因，肿瘤易感基因和DNA修复基因，代谢酶基因等相继发现n肿瘤不仅是环境病，也是基因病。肿瘤发生的环境因素的作用机制肿瘤发生的环境因素的作用机制化学致癌物作用的分子机制n致癌物特点未配对外层电子、正电荷、化学性质活泼

3、共价结合或交联损失。n磷酸核糖骨架磷酸二酯键断裂 重排、缺失n鸟嘌呤（G）O-6点突变C-8移码突变物理致癌分子机制n放射线 电离辐射 自由基DNA单链断裂、缺失、易位 原癌基因激活、抑癌基因失活n紫外线DNA 断裂后交联（嘧啶二聚体）修复酶类失活 着色性干皮病病毒致癌分子机制nDNA病毒HBV的X基因HPV的E6，E7基因EBV的LMP1基因nRNA病毒肿瘤发生的遗传因素nDNA复制过程中的基因突变率 10-6n人的一生中细胞分裂次数 1016n绝大多数的基因突变位点不会致癌n癌症的发生一般并不是单一基因的突变，而至少在一个细胞中发生5 -6个基因突变 肿瘤发生的遗传因素n二次突变学说n肿瘤

4、易感基因是指通过遗传获得的，在细胞癌变中起关键作用，对环境致癌因素敏感性增高，以及有利于癌变克隆选择和生长的突变基因。包括抑癌基因，个别癌基因和部分DNA错配修复基因。肿瘤的发生多基因、多阶段性多阶段的本质 癌基因、抑癌基因、DNA错配修复基因的时序性改变和交替作用肿瘤的发生多基因、多阶段性第第 一一 节节 癌癌 基基 因因Oncogenes癌基因的基本概念n癌基因是存在于病毒或细胞基因组中的一类在一定条件下能使正常细胞发生恶性转化的核苷酸序列。分为病毒癌基因和细胞癌基因。癌基因、抑癌基因与生长因子的关系癌基因、抑癌基因与生长因子的关系癌基因癌基因抑癌基因抑癌基因生长因子生长因子正调控正调控负

5、调控负调控产物产物诱发肿瘤诱发肿瘤鸡肉瘤无细胞滤液鸡肉瘤无细胞滤液电镜证实电镜证实致癌因子致癌因子鸡肉瘤病毒鸡肉瘤病毒（reverse transcription virus)） （Rous sarcoma virus, RSV) 病毒癌基因病毒癌基因(virus oncogene,v-onc)存在于病毒基因组中的癌基因，它不编存在于病毒基因组中的癌基因，它不编码病毒的结构成分，对病毒复制也没有作用，码病毒的结构成分，对病毒复制也没有作用，但可以使细胞持续增殖。但可以使细胞持续增殖。一、病毒癌基因一、病毒癌基因Hybridization Viral src oncogene probe病毒癌基

6、因可能来源于宿主细胞病毒癌基因可能来源于宿主细胞 Normal DNA与病毒与病毒srcsrc同源基因同源基因成纤维细胞形成肿瘤成纤维细胞形成肿瘤 化学致癌剂化学致癌剂诱导诱导提取提取DNA转染转染正常小鼠成纤维正常小鼠成纤维 细胞细胞NIH3T3转化细胞转化细胞引起肿瘤引起肿瘤接种接种人膀胱癌人膀胱癌提取提取DNA 转染转染NIH3T3细胞细胞转化细胞转化细胞提取提取DNA DNA文库文库杂交杂交分离出含人分离出含人膀胱癌基因膀胱癌基因有转化活性有转化活性的的DNA克隆克隆 二、细胞癌基因二、细胞癌基因n细胞癌基因细胞癌基因(cellular-oncogene, c-onc)存在于生物正常细

7、胞基因组中，是编码存在于生物正常细胞基因组中，是编码与细胞生长增殖及调控相关的蛋白质或多肽与细胞生长增殖及调控相关的蛋白质或多肽的基因。在正常情况下，处于静止或低表达的基因。在正常情况下，处于静止或低表达状态，又称为原癌基因；当被异常激活时，状态，又称为原癌基因；当被异常激活时，成为具有转化作用的细胞癌基因，可能导致成为具有转化作用的细胞癌基因，可能导致细胞癌变。细胞癌变。 癌基因名称癌基因名称 如：如： src病毒：病毒：v src ; 细胞：细胞：c - src细胞癌基因的特点细胞癌基因的特点 1. 广泛存在，高度保守；广泛存在，高度保守； 2. 通过表达的产物体现作用；通过表达的产物体现

8、作用； 3. 调控细胞生长和分化，是细胞发育、调控细胞生长和分化，是细胞发育、 组织再生、创伤与修复等必需；组织再生、创伤与修复等必需； 4. 被异常激活后发生数量或结构上的改被异常激活后发生数量或结构上的改 变，可导致细胞恶性转化。变，可导致细胞恶性转化。 1. 与细胞癌基因同源与细胞癌基因同源 2. 通常丢失两端的某些序列通常丢失两端的某些序列. 3. 无内含子且外显子序列与细胞癌基无内含子且外显子序列与细胞癌基 因有差别因有差别. 4. 常出现碱基替换和缺失常出现碱基替换和缺失. 5. 有较强的转化细胞的功能有较强的转化细胞的功能.病毒癌基因的特点病毒癌基因的特点细胞癌基因的分类及其产物

9、细胞癌基因的分类及其产物根据原癌基因的表达产物在细胞中的定位根据原癌基因的表达产物在细胞中的定位和功能分为：和功能分为：1. src家族家族 酪氨酸蛋白激酶酪氨酸蛋白激酶2. ras家族家族 Ras蛋白属于小蛋白属于小G蛋白蛋白3. myc家族家族 核内核内DNA结合蛋白结合蛋白4. sis家族家族 类人血小板源生长因子类人血小板源生长因子5. myb家族家族 核内转录因子核内转录因子（一）细胞外生长因子（一）细胞外生长因子 sis-P28（二）跨膜的生长因子受体（二）跨膜的生长因子受体c-src、c-abl、c-mos 、c-raf（三）细胞内信号传导体（三）细胞内信号传导体c-src、c-

10、abl、c-ras、c-mas、H-ras、K-ras、N-ras、crk（四）核内转录因子（四）核内转录因子 myc、fos三、原癌基因的产物三、原癌基因的产物n sis 癌基因：癌基因： 编码产物：编码产物：c -sis PDGF-2 v -sis P28（与人（与人PDGF的的B 链同源）链同源） 作用：竞争作用：竞争PDGFR加速细胞的分裂和增殖加速细胞的分裂和增殖.（一）生长因子及其类似物（一）生长因子及其类似物erbB 癌基因：癌基因：原癌基因编码产物：原癌基因编码产物： EGFR（ RTK） 恶性激活后恶性激活后 ErbB 蛋白与蛋白与 EGFR相似相似丢失丢失N-末端配体结合区

11、末端配体结合区 RTK持续激活持续激活（二）生长因子及细胞因子受体类（二）生长因子及细胞因子受体类src 癌基因癌基因: 原癌基因编码产物：膜结合原癌基因编码产物：膜结合PTK (50kD)416位位Tyr磷酸化磷酸化 激活激活PTK527位位Tyr磷酸化磷酸化 抑制抑制PTK恶性激活后表达恶性激活后表达 产物：产物： 丢失丢失527位位TyrPTK活性活性 诱发癌症诱发癌症（三）非受体（三）非受体PTK类类raf 癌基因癌基因: 原癌基因编码产物：原癌基因编码产物： Raf 类蛋白（类蛋白（648766AA）N端端: 调节区调节区; 中间：蛋白丝中间：蛋白丝/苏激酶结构域苏激酶结构域恶性激活

12、后表达产物：恶性激活后表达产物： 缺缺N 端调节区端调节区 癌蛋白癌蛋白（四）蛋白丝（四）蛋白丝/苏激酶类苏激酶类ras 癌基因癌基因: 原癌基因原癌基因 编码产物：编码产物： Ras类蛋白类蛋白 ( P21: 189AA) ras 基因点突变基因点突变 阻断阻断GAP激活激活Ras 的的GTP 酶活性酶活性 有转化活性的癌蛋白有转化活性的癌蛋白 （五）（五）GTP结合蛋白类结合蛋白类myc、 myb、 fos 、 jun癌基因癌基因:编码产物：核内转录调节因子编码产物：核内转录调节因子c-myc 产物产物G0/G1期进入期进入S 期的驱动因子期的驱动因子c-myb 产物产物调控血细胞发育分化

13、调控血细胞发育分化c-fos 和和c-jun 产物产物 在生长信号向基因传导中起重要作用在生长信号向基因传导中起重要作用（六）核内转录调节因子类（六）核内转录调节因子类目目 录录（一）点突变（一）点突变（二）基因易位（二）基因易位（三）原癌基因扩增（三）原癌基因扩增（四）基因低（四）基因低/ /去甲基化去甲基化出现新的表达产物出现新的表达产物 出现过量的正常表达产物出现过量的正常表达产物出现异常、截短的表达产物出现异常、截短的表达产物四、癌基因活化的机制四、癌基因活化的机制癌基因被激活的结果癌基因被激活的结果 （一）获得启动子与增强子（一）获得启动子与增强子 （插入激活（插入激活: inser

14、tional activation） Normal cell （c-myc gene） Tumour cell 1(Insert ALV gene） Tumour cell 2 LTRLTRmyc-mRNA Exon 1 Exon 2 Exon 3 DNA Tumour cell 3（二）基因易位或重排（二）基因易位或重排 ( gene rearrangement ) 着丝粒着丝粒 染色体染色体 22 bcr genec- abl gene 染色体染色体 9 bcr-mRNA bcr-abl mRNA 染色体染色体 9, 22 bcr-abl 融合蛋白（具融合蛋白（具PTK活性）活性） 慢性骨

15、髓白血病慢性骨髓白血病 （三）基因扩增（三）基因扩增 (gene amplification)（四）点突变（四）点突变 (point mutation) 非活化非活化 K-ras基因基因 G G CG T C Gly Val 点突变点突变 ras 基因基因: 12、13、59、61、63、186位密码子点突变位密码子点突变阻断阻断GAP 对对Ras蛋白的作用蛋白的作用 活化的活化的 K-ras基因基因 第第 二二 节节抑抑 癌癌 基基 因因Anti-oncogenes抑癌基因抑癌基因(cancer suppressive gene, anti-oncegene)抑癌基因是一类存在于正常细胞中，

16、抑制抑癌基因是一类存在于正常细胞中，抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因，细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因，其丢失或失活也可能导致肿瘤的发生。其丢失或失活也可能导致肿瘤的发生。一、抑癌基因的基本概念一、抑癌基因的基本概念Normal cellTumour cell 杂交细胞杂交细胞 细胞株融合细胞株融合 （成瘤能力和转移能力受抑制）（成瘤能力和转移能力受抑制） 正常细胞存在抑制肿瘤形成的基因正常细胞存在抑制肿瘤形成的基因确定抑癌基因的三个基本条件确定抑癌基因的三个基本条件 n恶性肿瘤中存在该基因的结构改变或表达缺陷n恶性肿瘤对应的正常组织中有该基因的正常表达n将野生型基因导入该

17、基因异常的肿瘤细胞内，可部分或完全抑制其恶性表型。 第一次突变第一次突变第二次突变第二次突变 一次突变一次突变 视网膜母细胞瘤（视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, Rb) 偶发型；偶发型； 遗传型遗传型 Rb 基因定位基因定位 13号染色体号染色体丧失丧失Rb 基因功能基因功能 双亲一方双亲一方Rb 基因缺陷基因缺陷丧失丧失Rb 基因功能基因功能偶发型：偶发型：遗传型：遗传型： 抗癌基因抗癌基因（antioncogene) 对癌症的发生：对癌症的发生： 抑癌基因抑癌基因 隐性基因隐性基因 （隐性癌基因）（隐性癌基因） 癌基因癌基因 显性基因显性基因个体水平上的抑癌基因突变表个体水平

18、上的抑癌基因突变表现出显性遗传特征现出显性遗传特征二、常见的抑癌基因二、常见的抑癌基因迄今为止尚未发现任何一种抑癌基因的异常存在于全部人类肿瘤中。 1. 定位：染色体定位：染色体13q14 含含27个外显子，转录个外显子，转录4.7kb的的mRNA 2. 表达产物：表达产物： 105110kD的的 pRb DNA结合蛋白结合蛋白 ( 928AA ) 3. 细胞定位：核内细胞定位：核内 三、抑癌基因的作用机制三、抑癌基因的作用机制（一）视网膜母细胞瘤基因（一）视网膜母细胞瘤基因（Rb基因）基因）（一）视网膜母细胞瘤基因（一）视网膜母细胞瘤基因（Rb基因）基因）nRb基因是第一个被克隆的抑癌基因，

19、在肿瘤中主要表现为等位基因丢失和点突变，又称Rb为视网膜母细胞瘤易感基因。n后来发现在骨肉瘤、软组织肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中也存在Rb基因缺失和突变失活 。 两种形式：两种形式：高磷酸化高磷酸化/ 低（非）磷酸化（有活性）低（非）磷酸化（有活性）G0/G1期期 S/G2期期 M期期 G1期期低磷酸化低磷酸化 高磷酸化高磷酸化 高磷酸化高磷酸化 低磷酸化低磷酸化病毒癌蛋白病毒癌蛋白 +细胞周期细胞周期蛋白依赖蛋白依赖性激酶性激酶CDKCDKI (-) 4. Rb 基因的作用：参与细胞分裂周期的调控，基因的作用：参与细胞分裂周期的调控， 促进细胞分化抑制细胞分裂增殖。促进细胞分化抑

20、制细胞分裂增殖。 无活性复合物无活性复合物ATPADP细胞周细胞周期蛋白期蛋白Cyclin (+) Rb 基因基因 缺失缺失/ 突变失活突变失活 pRb丧失抑制丧失抑制E2F 能力能力 细胞增殖细胞增殖5. 在细胞分裂周期调控中的作用机制在细胞分裂周期调控中的作用机制 ： G0/G1前期：前期： 低磷酸化低磷酸化pRb抑制转录因子（抑制转录因子（E2F) 抑制细胞分裂和增殖抑制细胞分裂和增殖核转录因子核转录因子c-myc癌蛋白家族癌蛋白家族具有酶氨酸激酶功能的癌蛋白具有酶氨酸激酶功能的癌蛋白c-Abl并使两者在细胞周期调节中的活性受到抑制并使两者在细胞周期调节中的活性受到抑制 G1晚期晚期 S

21、 期：期： 高磷酸化高磷酸化pRb 失活，与失活，与E2F解离解离 E2F调节与调节与DNA复制有关的基因表达复制有关的基因表达 启动启动DNA复制复制Rb基因的作用机制基因的作用机制G0 G1期期Rb蛋白蛋白E-2FS期期E-2FDNAmRNADNARb蛋白蛋白Rb基因的抑癌作用的调节机制 ncyclin D/CDKs复合物所致的Rb磷酸化； n病毒癌基因产物(如腺病毒的E1A、HPV16的E7以及SV40病毒的T抗原)与Rb的特异结合使Rb失去结合E2F、c- myc、c-Abl的能力； np53蛋白也能反式激活或抑制Rb基因启动子活性而对pRB 产生双向调控作用。 （二）（二）p53基因

22、基因 1. 定位：染色体定位：染色体17p13 含含11个外显子，转录个外显子，转录2.8kb的的mRNA 2. 表达产物：表达产物：53kD的的P53蛋白蛋白 DNA结合磷蛋白（结合磷蛋白（393AA ) （脱磷酸有活性）（脱磷酸有活性） 3. 细胞定位：核内细胞定位：核内 4. 是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因 P53P53 蛋白的一级蛋白的一级结构结构 酸性区酸性区 NC 1 80 102 290 319 393疏疏 水水 区区碱性区碱性区 含转录含转录因子活性因子活性 DNA结合区结合区核定位信号核定位信号（致癌突变）（致癌突变）形成

23、四聚体区形成四聚体区 进化保守区段进化保守区段发挥作用形式：四聚体发挥作用形式：四聚体nP53是一种抑癌基因，其在是一种抑癌基因，其在DNA损伤时被激活，通过反式激活细胞周期调节损伤时被激活，通过反式激活细胞周期调节蛋白蛋白(也是一种抑癌蛋白也是一种抑癌蛋白) p21WAFI/ cip1,而阻断细胞周期的行进；而阻断细胞周期的行进；n通过对癌基因通过对癌基因c- fos、 c-jun和和c-myc等的启动子序列的转录抑制作用，抑等的启动子序列的转录抑制作用，抑制细胞信号传导和细胞增殖；制细胞信号传导和细胞增殖；np53还能与一些特异的还能与一些特异的DNA序列结合蛋白结合，如序列结合蛋白结合，

24、如TATA一结合蛋白、一结合蛋白、CCAAT结合因子等，通过对其转录抑制而抑制与细胞恶性转化有关的生长结合因子等，通过对其转录抑制而抑制与细胞恶性转化有关的生长促进因子促进因子 ，抑制细胞增殖诱导分化。，抑制细胞增殖诱导分化。 P53蛋白的生物学功能蛋白的生物学功能 （1）抑制细胞增殖、诱导细胞分化）抑制细胞增殖、诱导细胞分化（2）促进）促进DNA损伤修复损伤修复np53对基因组稳定性的监控机制对基因组稳定性的监控机制 启动程序性死亡启动程序性死亡抑制抑制 DNA复复制参与修复制参与修复 细胞停滞于细胞停滞于G1 期期 p53 基因表达基因表达 P21蛋白蛋白 （ 依赖周期素的激酶的抑制剂）依

25、赖周期素的激酶的抑制剂） DNA损伤损伤 p21基因表达基因表达基因卫士基因卫士P53（3）诱导细胞调亡）诱导细胞调亡n野生型野生型p53蛋白能通过特异性结合作用反式激活蛋白能通过特异性结合作用反式激活Fas/APO-l、bax基因而诱导细胞凋亡；基因而诱导细胞凋亡；nbcl-2基因启动子区的负调控元件以促进细胞凋亡基因启动子区的负调控元件以促进细胞凋亡 。 6. p53 失活的机制失活的机制- （1）点突变）点突变np53基因的点突变存在于50%以上的肿瘤中。在人类肿瘤中的突变热点为175、248 、249、273和282位密码子。n特定类型的肿瘤有其特定的突变热点。如在中国南方所发生的肝癌

26、中， 53%的病例存在249位密码子的突变。n基因突变方式基因突变方式 * 野生型抑癌功能丢失野生型抑癌功能丢失 * 显性负突变显性负突变 丢失功能并中和另一野丢失功能并中和另一野生型等位基因抑癌功能生型等位基因抑癌功能 * 转化突变转化突变 丢失功能并具转化作用丢失功能并具转化作用 （2）P53蛋白误位蛋白误位 * 滞留胞浆滞留胞浆 无法发挥作用无法发挥作用（3）和癌基因产物结合）和癌基因产物结合 * 形成复合物形成复合物 功能丧失功能丧失人乳头状瘤病毒HPV的E6、腺病毒的E1B 、猴空泡病毒(SV40)的大T抗原突变型p53蛋白 （4）高甲基化）高甲基化（5）等位基因丢失）等位基因丢失（

27、6）基因重排）基因重排（三）（三）p16基因基因n定位于染色体9p21， DNA长度8. 5 kb，转录产生960 bp的mRNA，编码由148aa组成的15.8kDa蛋白质。 n由于与多种肿瘤有关，又称为多瘤抑制 基因(multiple tumor suppressor gene1， MTS1)。 np16基因的异常主要表现为基因丢失，且多为纯合性丢失 ；还有高甲基化 。p16的抑癌机制的抑癌机制 抑制抑制CDK4/CDK6两种蛋白激酶的活性两种蛋白激酶的活性 这种特异性的抑制作用降低或阻断了CDK4/CDK6对pRB蛋白的磷酸化修饰，致使转录因子E2F不能从与pRB的结合中解离而抑制细胞周

28、期进程。对对CDK4以及以及cyclin D1还有转录抑制作用还有转录抑制作用抑制抑制ras诱导的细胞生长及恶性转化诱导的细胞生长及恶性转化在在p16-CDK4/CDK6-pRB之间具有反馈作用调节环之间具有反馈作用调节环(feed back loop)。 pRB是p16作用的下游效应分子，同时，处于下游的pRB对p16基因的转录具有抑制作用。（四）其他抑癌基因（四）其他抑癌基因n nm23基因（肿瘤转移抑制基因）基因（肿瘤转移抑制基因）n DCC 基因（结直肠癌缺失基因）基因（结直肠癌缺失基因）n APC 基因（腺瘤性息肉病基因）基因（腺瘤性息肉病基因）n NF1 基因基因 (神经纤维瘤基因）神经纤维瘤基因）第第 三三 节节生