第十二单元移植免疫学检测

1、2021/6/71 第十二单元 移植免疫学检测移植免疫学检测 2021/6/72 实验一实验一 HLA微量淋巴细胞毒试验微量淋巴细胞毒试验 2021/6/73 微量淋巴细胞毒试验（微量淋巴细胞毒试验（Microcytotoxicity assay）是）是 在经典的补体依赖的淋巴细胞毒试验（在经典的补体依赖的淋巴细胞毒试验（complement dependent cytotoxicity，CDC）基础上发展而来的一项）基础上发展而来的一项 实验技术，目前已经广泛应用于器官移植供、受者间的实验技术，目前已经广泛应用于器官移植供、受者间的 交叉配型、复发性流产的封闭抗体检测等多个领域。在交叉配型、

2、复发性流产的封闭抗体检测等多个领域。在 器官移植的文献中提及的器官移植的文献中提及的CDC法多指微量淋巴细胞毒法。法多指微量淋巴细胞毒法。 微量淋巴细胞毒试验概念微量淋巴细胞毒试验概念 2021/6/74 v器械器械 微量淋巴细胞毒反应板（泰萨奇板）、倒置荧光显微微量淋巴细胞毒反应板（泰萨奇板）、倒置荧光显微 镜、镜、 微量移液器、吸管、温箱、离心机、磁架等微量移液器、吸管、温箱、离心机、磁架等 。 v试剂试剂 淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液(Ficoll, 1.077)、T/B淋巴细胞分离淋巴细胞分离 磁珠及洗涤液、冻干补体、荧光染色液、供者全血磁珠及洗涤液、冻干补体、荧光染色液、供者全血23

3、ml （EDTA或或ACD抗凝）、受者血清抗凝）、受者血清2ml、阴性对照血清、阴性对照血清 （可用（可用1640培养液或培养液或PBS替代）、阳性对照血清（抗全淋替代）、阳性对照血清（抗全淋 巴细胞抗体巴细胞抗体ALG/ATG）。）。 实验器材和材料实验器材和材料 2021/6/75 v淋巴细胞的分离（淋巴细胞的分离（FicollFicoll法）：法）： 1. 将供者全血用将供者全血用PBS(pH7.4)缓冲液缓冲液 按按1:1稀释，混匀备用；稀释，混匀备用； 2. 取取15ml离心管一支，加入一定体积的离心管一支，加入一定体积的Ficoll液，用吸取稀释液，用吸取稀释 后的供者全血，沿试管

4、壁缓慢加入，使全血置于后的供者全血，沿试管壁缓慢加入，使全血置于Ficoll上层。上层。 Ficoll液与稀释后的全血体积之比为液与稀释后的全血体积之比为1:2； 3. 15002000rpm/min（半径（半径15cm水平转子）离心水平转子）离心10min； 4. 取出离心管，吸取中间白膜层，置于另一干净离心管中；取出离心管，吸取中间白膜层，置于另一干净离心管中； 5. 加入加入PBS，洗涤；，洗涤； 6. 2000rpm/min离心离心5min，倾出上清液；，倾出上清液； 7. 重复步骤重复步骤5、6； 8. PBS液调整细胞浓度为液调整细胞浓度为2109/L。 实验方法实验方法 2021

5、/6/76 v 淋巴细胞毒反应（一步法）淋巴细胞毒反应（一步法） 1. 于泰萨奇板每孔中加入于泰萨奇板每孔中加入5l石蜡油，以防反应物挥发；石蜡油，以防反应物挥发； 2. 建立反应格局，每位待测标本均应设立阴性对照、阳性建立反应格局，每位待测标本均应设立阴性对照、阳性 对照；对照； 3. 分别于各相应孔中加入分别于各相应孔中加入1l淋巴细胞（混合淋巴细胞、淋巴细胞（混合淋巴细胞、T 淋巴细胞、淋巴细胞）、淋巴细胞、淋巴细胞）、1l待测血清以及待测血清以及2l补体；补体； 4. 2225温度下孵育温度下孵育1h； 5. 荧光染色液染色并终止反应。荧光染色液染色并终止反应。 2021/6/77 结

6、果应在染色后结果应在染色后10分钟内观察，以防荧光猝灭。特分钟内观察，以防荧光猝灭。特 殊情况不能立即观察时，应将反应板用避光纸包紧，置殊情况不能立即观察时，应将反应板用避光纸包紧，置 于于4冰箱中，尽早观察结果。死亡细胞由于荧光染料进冰箱中，尽早观察结果。死亡细胞由于荧光染料进 入而呈红色（染料中的入而呈红色（染料中的EB与与DNA结合），体积略为增大。结合），体积略为增大。 活细胞因为细胞膜完整而呈明亮的绿色（染料中的活细胞因为细胞膜完整而呈明亮的绿色（染料中的CFDA 与细胞膜蛋白结合），具有强折光性。与细胞膜蛋白结合），具有强折光性。 结果观察结果观察 2021/6/78 根据死亡细胞

7、占全部细胞的百分比来计分，根据死亡细胞占全部细胞的百分比来计分， 目前普遍采用国际通用的目前普遍采用国际通用的NIH计分方法，如下表。计分方法，如下表。 判断死细胞的百分比需要操作者具备一定的工作判断死细胞的百分比需要操作者具备一定的工作 经验，大致原则为：可疑经验，大致原则为：可疑2分，分，30为为4，过半记，过半记6， 强阳写强阳写8。 结果判断结果判断 2021/6/79 淋巴细胞毒试验记分标准淋巴细胞毒试验记分标准 死细胞（死细胞（%）记分记分意义意义 0100阴性阴性 11202阴性可疑阴性可疑 21404阳性可疑阳性可疑 41806阳性阳性 808强阳性强阳性 2021/6/710

8、 1. 每份标本都必须设立阴、阳性对照；每份标本都必须设立阴、阳性对照； 2. 温度过低有可能产生假阴性结果；温度过低有可能产生假阴性结果； 3. 只有当阴性和阳性对照结果准确时，该实验的只有当阴性和阳性对照结果准确时，该实验的 阳性和阴性结果方能成立。阳性和阴性结果方能成立。 注意事项注意事项 2021/6/711 v淋巴细胞毒试验是测定患者机体内是否含有特异性针对供淋巴细胞毒试验是测定患者机体内是否含有特异性针对供 者的淋巴细胞毒抗体，检测的是者的淋巴细胞毒抗体，检测的是HLA特异性的特异性的IgG和和IgM 抗体，包括抗体，包括HLA-I类抗体和类抗体和II类抗体。由于混合淋巴细胞类抗体

9、。由于混合淋巴细胞 中主要为中主要为T淋巴细胞，淋巴细胞，B淋巴细胞数量较少，而淋巴细胞数量较少，而HLA-II类类 抗体在抗体在T淋巴细胞表面不表达，仅在淋巴细胞表面不表达，仅在B淋巴细胞表面表达，淋巴细胞表面表达， 因而，利用混合淋巴细胞进行因而，利用混合淋巴细胞进行CDC试验时，对试验时，对HLA-I类抗类抗 体阴性、体阴性、II类抗体阳性的患者，易产生漏检，而造成这种类抗体阳性的患者，易产生漏检，而造成这种 结果的原因是由于混合淋巴细胞中结果的原因是由于混合淋巴细胞中B淋巴细胞占全部细胞淋巴细胞占全部细胞 的比例较少所致。的比例较少所致。 v为了更加真实、全面地反应患者的免疫状态，我们

10、应该如为了更加真实、全面地反应患者的免疫状态，我们应该如 何改善上述局限性对实验结何改善上述局限性对实验结 果造成的影响？果造成的影响？ 南方医科大学南方医科大学 裘宇容裘宇容 实验讨论实验讨论 2021/6/712 实验二实验二 群体反应性抗体检测群体反应性抗体检测 2021/6/713 群体反应抗体（群体反应抗体（Pannel reactive antibody）是指存）是指存 在于某些人体内的抗人类白细胞在于某些人体内的抗人类白细胞(HLA)抗体，可通过输抗体，可通过输 血、输血小板、妊娠以及器官移植等免疫途径获得。血、输血小板、妊娠以及器官移植等免疫途径获得。 PRA测定即是检测患者体

11、内是否存在测定即是检测患者体内是否存在HLA抗体、抗体抗体、抗体 的水平高低以及抗体特异性如何。的水平高低以及抗体特异性如何。PRA对于患者是否发对于患者是否发 生排斥、移植物的存活状态以及器官功能的实现都有着生排斥、移植物的存活状态以及器官功能的实现都有着 不可忽视的作用。不可忽视的作用。 群体反应性抗体的概念群体反应性抗体的概念 2021/6/714 实验原理实验原理 将涵盖不同地域、不同人种的将涵盖不同地域、不同人种的HLA-I类和类和II类纯化类纯化IgG 抗原预先包被于泰萨奇微孔板中，与待测、血清反应，再加抗原预先包被于泰萨奇微孔板中，与待测、血清反应，再加 入碱性磷酸酶标记的二抗，

12、孵育后加入酶作用底物，待显色入碱性磷酸酶标记的二抗，孵育后加入酶作用底物，待显色 反应完成后终止反应。如果待测血清中存在反应完成后终止反应。如果待测血清中存在HLA-I类抗体，类抗体， 则相应的则相应的HLA-I类混合抗原孔中会发生特异性的抗原抗体反类混合抗原孔中会发生特异性的抗原抗体反 应，反应孔呈现蓝色的阳性反应结果；若无相应抗体，则反应，反应孔呈现蓝色的阳性反应结果；若无相应抗体，则反 应孔中为无色阴性结果。应孔中为无色阴性结果。 2021/6/715 v器械：器械： 各种移液器、吸头、温箱、离心机各种移液器、吸头、温箱、离心机 、微量酶标仪等。、微量酶标仪等。 v试剂：试剂： 抗原微孔

13、板（以抗原微孔板（以LAT mix tray为例）为例） 对照血清（对照血清（10serum control） 去离子水去离子水(sterile deionized water) 酶标二抗（酶标二抗（100alkaline phosphatase-conjugated anti- human IgG) 抗体稀释液（抗体稀释液（1antibody diluent） 洗液（洗液（10wash buffer） 底物底物A和和B（1colorimetric enzyme substrate A&B） 反应终止液（反应终止液（1stop reagent） 实验器材和材料实验器材和材料 2021/6/71

14、6 v 试剂准备试剂准备 1. 在第一次使用时，至少提前在第一次使用时，至少提前20min取出冻干对照血清以取出冻干对照血清以2ml去离子水轻去离子水轻 轻摇震使其彻底溶解。将溶解后的对照血清溶液分装，每管轻摇震使其彻底溶解。将溶解后的对照血清溶液分装，每管100l， 储存在储存在-20冰箱中，每次实验前取出，恢复至室温后使用；冰箱中，每次实验前取出，恢复至室温后使用； 2. 将洗液用去离子水将洗液用去离子水(sterile deionized water)按按1：9稀释，可根据工作频稀释，可根据工作频 率一次性配制一定量的工作液，率一次性配制一定量的工作液，4冰箱贮存备用；冰箱贮存备用； 3

15、. 将待测标本用抗体稀释液（将待测标本用抗体稀释液（antibody diluent)按按1：2稀释，约稀释，约60l/test； 4. 酶标二抗（酶标二抗（alkaline phosphatase-conjugated anti-human IgG)在第一次在第一次 洗涤之前用抗体稀释液按洗涤之前用抗体稀释液按1：100稀释，稀释，50l/test； 5. 底物底物A、B (colorimetric enzyme substrate A&B)在第二次洗涤之前按在第二次洗涤之前按1： 1比例混匀，比例混匀，50l/test。 实验方法实验方法 2021/6/717 v 酶联免疫吸附反应酶联免疫

16、吸附反应 1. 根据反应格局表，将待测血清和各种对照品加入相应的孔中，每孔根据反应格局表，将待测血清和各种对照品加入相应的孔中，每孔10l（阴性对（阴性对 照孔加入抗体稀释液，阳性对照孔和质控孔加入对照血清）；照孔加入抗体稀释液，阳性对照孔和质控孔加入对照血清）； 2. 盖好反应板，盖好反应板，2225孵育孵育60min； 3. 用力将反应板中的血清甩出，并在垫有纸巾的实验台面上叩击反应板两至三次，用力将反应板中的血清甩出，并在垫有纸巾的实验台面上叩击反应板两至三次， 在加入下一液体前，请注意加盖，保持反应孔湿润；在加入下一液体前，请注意加盖，保持反应孔湿润； 4. 于每孔中加入洗液于每孔中加

17、入洗液(wash buffer) 20-30l， 轻轻晃动反应板，甩出洗液，叩击轻轻晃动反应板，甩出洗液，叩击 反应板两至三次；反应板两至三次； 5. 再重复步骤再重复步骤9两次；两次； 6. 加入加入10ul酶标二抗，轻轻晃动反应板酶标二抗，轻轻晃动反应板, 2225孵育孵育40min； 7. 重复步骤重复步骤9三次；三次； 8. 每孔加入每孔加入10l混合好的底物，混合好的底物，37避光孵育避光孵育1015min（一般不要超过（一般不要超过15min）；）； 9. 待质控孔和阳性对照变成深蓝色后待质控孔和阳性对照变成深蓝色后, 每孔加入每孔加入5l 终止液终止液(stop reagent)

18、，盖上反应，盖上反应 板，板，15分钟后观察结果。分钟后观察结果。 2021/6/718 肉眼观察反应结果，蓝色或深蓝色为阳性肉眼观察反应结果，蓝色或深蓝色为阳性, 无色为阴性，无色为阴性， 阳性结果的颜色深浅程度与待测标本阳性结果的颜色深浅程度与待测标本HLA抗体水平的高低抗体水平的高低 成正比。有条件时可在微量酶标仪上读取吸光度值，并根据成正比。有条件时可在微量酶标仪上读取吸光度值，并根据 阴、阳性对照的吸光度值判定标本的阴、阳性。尽量在显色阴、阳性对照的吸光度值判定标本的阴、阳性。尽量在显色 终止反应后终止反应后1小时内读取反应结果，上机前请移去反应板盖。小时内读取反应结果，上机前请移去

19、反应板盖。 如因特殊情况需延迟观察结果时，请将反应板贮存于如因特殊情况需延迟观察结果时，请将反应板贮存于25 冰箱中，此情况下可能会引起反应孔吸光度值降低，产生假冰箱中，此情况下可能会引起反应孔吸光度值降低，产生假 阴性结果。阴性结果。 观察结果观察结果 2021/6/719 注意事项注意事项 v 洗涤洗涤 洗涤是洗涤是ELISA实验中关键的步骤，如洗涤不充分，实验中关键的步骤，如洗涤不充分， 则可能出现本底过高的现象；但洗涤过度，亦可能丢失一则可能出现本底过高的现象；但洗涤过度，亦可能丢失一 些阳性反应；些阳性反应； v 温度温度 除二抗反应过程外，本实验以除二抗反应过程外，本实验以2225

20、为宜，温度为宜，温度 过高或过低都会对实验结果产生不同性质的干扰；过高或过低都会对实验结果产生不同性质的干扰； v 对于强阳性标本，可加大稀释倍数后再进行检测；对于强阳性标本，可加大稀释倍数后再进行检测； v 本实验的难点为阳性结果的评价和判断，因此，如果操作本实验的难点为阳性结果的评价和判断，因此，如果操作 者具备丰富的者具备丰富的HLA专业基础知识，将会大大提高本实验专业基础知识，将会大大提高本实验 结果判断的可靠性和准确性。结果判断的可靠性和准确性。 2021/6/720 v 结果评价标准结果评价标准 1. 依据实验条件不同，各实验室结果具有不同的波动范围；依据实验条件不同，各实验室结果

21、具有不同的波动范围； 2. 当空白对照、阴性对照、阳性对照以及质控孔的当空白对照、阴性对照、阳性对照以及质控孔的OD值均值均 在试剂盒可接受范围时，说明实验结果准确可靠；在试剂盒可接受范围时，说明实验结果准确可靠； 3. 肉眼判断结果时，应根据反应孔的颜色深浅计分，计分方肉眼判断结果时，应根据反应孔的颜色深浅计分，计分方 法同法同“微量淋巴细胞毒试验微量淋巴细胞毒试验”，以，以0，2，4，6，8分来表分来表 示反应由弱至强的程度。示反应由弱至强的程度。 4. 对于对于HLA混合抗体检测，建议混合抗体检测，建议4分以上为阳性。对于分以上为阳性。对于2分结分结 果的定义是本实验的难点，应结合患者机

22、体免疫状态而定。果的定义是本实验的难点，应结合患者机体免疫状态而定。 结果分析结果分析 2021/6/721 vCut-off值的确定值的确定 v不同的不同的HLA抗体检测试剂盒，可设置不同的调节抗体检测试剂盒，可设置不同的调节Cut- off值，建议在值，建议在HLA抗体初筛时适当下调抗体初筛时适当下调Cut-off值；值； v对于对于HLA抗体特异性及抗体水平的检测，可根据试剂抗体特异性及抗体水平的检测，可根据试剂 盒类型（盒类型（LAT1240/1288/1HD/240）相应上调）相应上调Cut-off值。值。 v调节调节Cut-off值的计算：值的计算： v调节调节Cut-off（阳性

23、孔均值空白均值）（阳性孔均值空白均值）校正系校正系 数数空白均值空白均值 vPRA值的计算值的计算 PRA阳性孔数阳性孔数/总检测孔数总检测孔数100% 2021/6/722 南方医科大学南方医科大学 裘宇容裘宇容 如孔如孔2A2E均为阳性，根据反应工作表格局，说均为阳性，根据反应工作表格局，说 明抗体特异性为抗明抗体特异性为抗HLA-A1抗体；如孔抗体；如孔2A2E中有中有3 孔强阳性，而孔强阳性，而2孔阴性，应该如何分析？孔阴性，应该如何分析？ 实验讨论实验讨论 2021/6/723 实验三实验三 病例讨论病例讨论 2021/6/724 v 病历病历 患者吴xx,女性，39岁，汉族，广东省

24、汕头籍，家住汕头市鲈岗 镇，2007年5月18入院。 主诉：主诉： 尿检、肾功异常6年，加重半年。缘于2001年5月无明显诱因出现 头晕，腰酸痛，在当地医院就诊，査尿常规提示尿蛋白（+），肾功 异常（肌酐130umol/L左右），给予对症治疗（具体不详），症状缓 解。此后病情平稳。监测肾功肌酐逐步上升，2006年9月为 200umol/L,11月再次出现头晕，伴恶心，呕吐，测肌酐达700umol/L, 就诊于西安某医院，诊断“慢性肾功不全尿毒症期”，行左前臂内 瘘术，术后内瘘栓塞。拟行肾移植术，但因无合适供体，回当地医院 继续治疗。2007-5-15复查肌酐1400umol/L,为行肾移植术，

25、就诊我院， 门诊以“慢性肾功能不全尿毒症期”收入科。病程中精神、饮食一 般。24小时尿量1400ml左右，大便正常，体重无明显变化。婚育史： 患者23岁已婚，生有2子3女，流产1次 2021/6/725 v 查体：查体： 体温 36.6 0C，脉搏80次/分，呼吸18次/分，血压150/100mmHg 发育正常，营养中等，神志清楚，精神欠佳，慢性病容，贫血貌，全 身皮肤、黏膜无黄染，全身浅表淋巴结未触及肿大。颈静脉无怒张， 颈动脉无异常搏动，未扪及包块，甲状腺不肿大，气管居中，颈软无 抵抗。胸廓对称无畸形，无局限性隆起，双侧乳房对称，未扪及肿块。 胸壁未见静脉曲张，胸式呼吸存在，节律规整，叩诊

26、呈清音，肺肝界 位于右锁骨中线第5肋间，双肺呼吸音清，未闻及干湿性罗音及胸膜 摩擦音。心前区无隆起，心尖搏动不明显，未见异常搏动，心界不大， 心率80次/分，律齐，各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音，无心包摩擦 音。腹平坦，腹肌软，全腹无压痛及反跳痛，未扪及包块，肝脾肋缘 下未触及。肝脾及双肾区无叩击痛，移动性浊音阴性，肠鸣音正常3 5次/分。生理反射存在，病理反射未引出。专科检查: 双侧肋脊角 未见异常隆起，皮肤无红肿，双肾区平坦，未触及包块，双侧肋脊点 无明显压痛，双肾区无叩击痛，未闻及血管杂音。双侧输尿管行径无 压痛点，耻骨上区无膨隆及压痛，膀胱叩诊空虚。 2021/6/726 v 实验室检查

27、：实验室检查： 血常规：WBC 4.42G/L，NEU% 68.5%，RBC 2.37G/L，HGB 60g/L，HCT 0.193,PLT 132G/L；血型：“B”型；血生化：BUN 25.4mmol/L，Cr 975umol/L,GLU 4.7mmol/L，K+ 3.51mmol/L，Ca2 2.13mmol/L，TG1.35mmol/L，Tco2 21.1mmol/L；肝功能转氨酶、胆 红素结果正常；ALB 39.8g/L；自身抗体阴性；凝血四项基本正常； 乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病及结核相关检查均阴性；肿瘤标记物检查 未见异常；尿常规：尿蛋白（+），尿白细胞（+），尿隐血（+）。 PR

28、A40。 v 心电图：心电图：1.窦性心律，2.左室肥厚。 v 胸片：胸片：心影增大，符合尿毒症性心肌病。 v 腹部腹部B超：超：1.双肾缩小，实质回声增强，左肾囊肿，2.右侧附件区囊 性占位，建议定期复查，3.肝、胆、胰、脾未见明显异常。 v 超声心动图：超声心动图：1.左房轻度增大，2.主动脉瓣反流（轻度），3.左室 顺应性减低。 v 胃镜：胃镜：十二指肠球炎。 2021/6/727 v 讨论讨论 患者高PRA,肾移植术前、术后注意事项。 患者出现高患者出现高PRAPRA的可能原因有哪些？的可能原因有哪些？ 等待移植的患者术前如果接受过输血治疗、或者前一次移植后因 排斥而导致移植物失功以及

29、女性患者曾经生育过孩子（妊娠），那 么患者体内的免疫系统有可能受到来自其他个体（同种异体）的人 类白细胞抗原（HLA）分子刺激（致敏），导致患者的免疫系统产 生针对同种异体HLA分子的特异性抗体，并释放到外周血液中，我 们将这些抗体称为群体反应性抗体（Panel Reactive Antibody, PRA）， 简称为PRA。PRA阳性受者称为致敏受者，PRA40%的受者称为高 致敏受者。患者生有2子3女，流产1次。这可能是高PRA的主要原因。 高高PRAPRA患者的器官移植存在哪些危害？患者的器官移植存在哪些危害？ 研究表明，PRA在实体器官（肾、心、肺、肝等）移植排斥反 应中扮演了重要角色，不仅与肾移植超急性排斥反应密切相关，而 且与移植物功能延迟、急性排斥、慢性排斥以及移植物存活率下降 也有关系 。 2021/6/728 v PRA阳性阳性患者在移植配型上应严格注意哪些问题？患者