疟疾实验技术

1、疟疾检测技术及进展疟疾检测技术及进展疟疾疟疾：是由按蚊叮咬传播疟原虫而引起的寄生虫病，以寒战、高热、大汗为特点。 病 原 疟原虫是疟疾的病原体。 人体疟原虫有4种： 恶性疟原虫 （临床表现重） 间日疟原虫 （可复发） 三日疟原虫 （可复发） 卵形疟原虫 人体寄生的四种疟原虫人体寄生的四种疟原虫生活史 两阶段 有性生殖（蚊体内） 无性生殖（人体内） 两宿主 中间宿主（人） 终宿主（蚊）在蚊体内的发育阶段 肝细胞内的发育间日疟、卵型疟四种疟疾均可红细胞内的发育疟原虫完整生活史疟原虫完整生活史 疟原虫的生活史应明确以下几点疟原虫的生活史应明确以下几点:(1) 当疟原虫在人体肝细胞和红细胞内增殖时，临

2、床上无明显表现。(2) RBC内期：周期性发作有关。(3) 周期性发作：一部分裂殖子再侵入红细胞内增殖后再释放入血。(4) 红细胞破坏，大量裂殖子、疟色素及代谢产物释放入血，引起疟疾发作。(5) 肝细胞内期：复发、潜伏期有关。(6) 迟发型子孢子在肝细胞内的发育是复发的根源。(7) 间日疟和卵形疟有复发，恶性疟和三日疟无复发。(8) 裂殖子经3-6代增殖后发育成雌雄配子体时，具有传染性。(9) 人为中间宿主，蚊为终宿主。疟疾检测技术疟疾检测技术疟疾常用诊断方法u病原学诊断u免疫学诊断u分子生物学诊断一、病原学诊断血膜镜检法（金标准）u血片的制作u血膜染色u血片镜检 血片的制作（一）所需设备 1

3、载玻片：玻片使用前应清洗。 新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中1020 分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净柔软的棉巾将玻片擦亮。也可以用95%乙醇浸泡。 2采血针：使用一次性采血针。 3玻片盒：为防止污染和苍蝇吸食血膜，新制作的血膜应放在玻片盒中，厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥。 475 乙醇棉球：用于采血前后的消毒。 5记号笔：用于玻片上书写号码。（二）采血部位及取血方法 采血部位：末梢血（耳垂、指端） 也可使用血常规抗凝静脉血，但制作的血片厚血膜容易脱落。采血时间：间日疟发作后8-10小时， 恶性疟发作2小时。 （三）涂制血膜 取玻片2 张，1 张作载片

4、，1 张作推片（具有光滑边缘）。 薄血膜薄血膜厚血膜厚血膜 厚血膜：用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液45ul （相当于火柴头大小），使血滴与载玻片接触，由里向外一个方向旋转24圈，涂成直径0.81厘米大小圆形厚血膜（厚度以1 个油镜视野内可见到510 个白细胞为宜） 薄血膜：用推片一端中部刮取血液11.5ul，将血置于载玻片离厚血膜适当远的地方，推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm 宽时，使两玻片保持2535角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜。l推片技巧：将推片匀速向前，勿停顿。l涂片的厚薄取决于速度和角度： 快、大（厚） 慢、小（薄）

5、l一张满意的血涂片应厚薄均匀，头、体、尾鲜明 尾 体 头疟疾临床 病人血膜（四）厚、薄血膜的位置标签厚血膜血量适宜，不宜过多或过少。薄血膜平整,无皱折和空泡，红细胞单层排列。 血片放置待干时不可倾斜，否则厚血膜中血细胞沉在一边，可使厚薄不匀。 制成的血膜须完全干燥后，方可进行固定及染色。否则薄血膜中的红细胞边缘皱缩，厚血膜容易在染色时脱落，而常现网状的背景； 血膜放置时间，夏天不宜超过48 小时，冬天不宜超过72 小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。（五）制作血片的注意事项血膜的染色 （一）染色液的种类及配制 吉氏染液 保存时间长，染色时间长 瑞氏染液 保存时间短，染色时间短 28

6、吉氏（Giemsas）染液配制 吉氏粉 5.0 g 甲醇 250ml 甘油 250ml 将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗清研钵中甘油为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，置室温内，每天用力摇动溶液5min，3d后即可使用。 也可在带有紧口瓶塞的硬质玻璃瓶中放入约50个玻璃珠（直径3 5mm），用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中，再把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇缓慢地把所有染料粉冲入瓶内，塞紧瓶塞，置于室温内，每天用力摇动5min，3d后即可使用。 瑞氏（Wrights）染

7、液 瑞氏染剂粉 1.0 g 甲醇 500ml 甘油 15ml 将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用甲醇洗出研钵中的甘油溶液，倒入瓶中，摇匀后，置室温下，每天摇动5min，3d后即可使用。（二）染色用水 为使血膜着色较好，应用pH7 . 0 7 . 2 水效果最佳。常用的是中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水。最好配制缓冲液用于染液的稀释和染色后的冲洗。常用磷酸盐缓冲液。 PBS缓冲液的配制（0.01 mol/l PBS pH7.2） KH2PO4 0.38g Na2HPO4 1.02g (或Na2HPO4 12H2O 2.58g) NaCl 8.00g 蒸馏水加至 1

8、000ml（三）染色方法 可用吉氏或瑞氏染色法染色。 国家推荐使用吉氏染色法。 根据临床工作的实际情况，为了方便操作，推荐使用瑞氏-吉姆萨染液（临床用于血常规推片染色）。 吉氏染色（主要成分：水） 吉氏染液要现用现配，配制好的染液保存 不超过24小时。染液工作浓度为 2（ 2ml吉氏原液+98ml蒸馏水缓冲液混匀）。 先用甲醇固定薄血膜。 厚血膜如果放置时间超过48小时，需要用 蒸馏水或清水溶血。 取吉氏染液工作液滴在厚、薄血膜上，2030min后，水洗、晾干。 瑞氏染色（主要成分：甲醇） 厚血膜需要用蒸馏水或清水溶血。（用蜡笔在厚、薄血膜间划一界限） 在薄血膜上滴加67滴瑞氏染液，轻轻摇动玻

9、片，使染液在血膜上展开30秒钟，加蒸馏水或缓冲液1012滴，摇动玻片，使染液与水充分混合，并将染液引到厚血膜上，使厚薄血膜同时染色5分钟，然后用蒸馏水或缓冲液将血膜冲洗干净，晾干后检查。推荐染色方法 由于瑞氏-吉姆萨染液中含有甲醇，因此在操作时，与瑞氏染液染色方法相同。 应该在厚血膜完全干燥后，用蒸馏水或清水溶血，然后再进行染色。 染色方法可参照产品说明书。四、影响血膜染色质量的因素 血片染色好坏，除与玻片的清洁程度、血膜制作的质量和染色技术等有关外，还与下列因素有关： 染剂和溶剂的质量（分析纯、容器无水、试染） 染液的新旧 （染色前12周配制，越久越好） 染液的稀释浓度 浓 着色快，各种细胞

10、着色深，薛氏点、 茂氏点等粗大显著 。 稀 染液浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色均匀、清晰，但薛氏点、茂氏点不够清楚。 稀释和冲洗用水（pH7.07.2 ）太蓝水pH值偏碱，用pH较低的缓冲水冲洗；太红水pH值偏酸，用pH较高的缓冲液冲洗；太深建议延长冲洗时间。 偏 酸偏 碱标 准 染色时间及温度 染色时间长，效果好 ；温度高，着色快 。 冲洗方法 染色后不要直接将染液倒掉，应沿玻片及染色缸边缘加水使染液表层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。 血涂片检查 在染色后的血膜上加一滴香柏油，用光学显微镜油镜检查。以检查厚血膜为主，薄血膜主要用于虫种鉴别。 间日疟镜下可见：环状体、滋养

11、体、裂殖 体、配子体 恶性疟镜下可见：环状体、配子体厚、薄血膜镜检示意图123123XXXX 着色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性粒细胞颗粒呈鲜红色，嗜中性粒细胞核呈紫蓝色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，疟原虫核呈红色。除环状体外，其他各期均可查见疟色素。以查完整个厚血膜，未查见疟原虫者判为阴性。根据疟原虫形态确定恶性疟、间日疟、三日疟、卵形疟或混合感染。 嗜酸性粒细胞 中性粒细胞 淋巴细胞 中性粒细胞 单核细胞 红细胞血细胞形态 血小板人人体体四四种种疟疟原原虫虫红红内内期期各各期期形形态态鉴鉴别别 环状体环状体大滋养体大滋养体裂殖前期裂殖前期成熟裂殖体成熟裂殖体雌配子体雌配子体雄配

12、子体雄配子体间日疟、恶性疟薄血膜中形态特点 间日疟原虫间日疟原虫恶性疟原虫恶性疟原虫被寄生红被寄生红细胞细胞胀大胀大；颜色褪色；出现薛氏点，红；颜色褪色；出现薛氏点，红色，细小数多。色，细小数多。大小正常大小正常，颜色正常或稍紫；茂氏点，颜色正常或稍紫；茂氏点红色，粗大数少。红色，粗大数少。小滋养体小滋养体(环状体环状体)较大较大，约占红细胞直径的，约占红细胞直径的1/3；核核1个个；胞浆较薄；无色素。；胞浆较薄；无色素。小环状体较小小环状体较小，约占红细胞直径，约占红细胞直径1/6, 大环状体与间日疟原虫相似；大环状体与间日疟原虫相似；核核1或或2个个；胞浆小环状体纤细，大环状体与；胞浆小环

13、状体纤细，大环状体与间日疟原虫相似；无色素。间日疟原虫相似；无色素。大滋养体大滋养体较大较大；核多见核多见1个个；胞浆阿米巴样，；胞浆阿米巴样，含空泡；色素黄褐色，细小，杆状，含空泡；色素黄褐色，细小，杆状，散在分布多见。散在分布多见。较小较小；核核1或或2个个；胞浆圆形，空泡不；胞浆圆形，空泡不显著；色素黄褐色，细小，结成团块显著；色素黄褐色，细小，结成团块后，呈黑褐色。后，呈黑褐色。未成熟裂未成熟裂殖体殖体较大较大；核；胞浆圆形或不规则，空；核；胞浆圆形或不规则，空泡消失；色素黄褐色，分布不匀。泡消失；色素黄褐色，分布不匀。较小较小；核；核2个以上胞浆圆形，空泡消个以上胞浆圆形，空泡消失；

14、色素黑褐色团块状。失；色素黑褐色团块状。成熟裂殖成熟裂殖体体大于正常红细胞大于正常红细胞；裂殖子较大，；裂殖子较大，224个；排列不规则；色素黄褐个；排列不规则；色素黄褐色，常聚集一侧。色，常聚集一侧。小于正常红细胞小于正常红细胞；裂殖子较小，；裂殖子较小，826个，排列不规则；色素为黑褐色团个，排列不规则；色素为黑褐色团块。块。雌配子体雌配子体大于正常红细胞，大于正常红细胞，圆形圆形；核核1个个，较小，深红色，较小，深红色，位于一侧位于一侧；胞浆深；胞浆深蓝色；色素黄褐色，均匀散在。蓝色；色素黄褐色，均匀散在。较大，较大，新月形新月形，两端尖锐；核，两端尖锐；核1个，个，较小，深红色，位于中

15、央；胞浆深蓝较小，深红色，位于中央；胞浆深蓝色；色素黑褐色，紧密分布于核周围。色；色素黑褐色，紧密分布于核周围。雄配子体雄配子体大于正常红细胞，大于正常红细胞，圆形圆形；核；核1个，个，较大，淡红色，较大，淡红色，位于中央位于中央；胞浆浅；胞浆浅蓝色；色素黄褐色，均匀散在。蓝色；色素黄褐色，均匀散在。较大，较大，腊肠形腊肠形，两端钝园；核，两端钝园；核1个，个，较大，淡红色，位于中央；胞浆浅蓝较大，淡红色，位于中央；胞浆浅蓝色或淡红色；色素黑褐色，松散分布色或淡红色；色素黑褐色，松散分布于核周围。于核周围。被疟原虫寄生的RBC变化 虫种虫种RBC大小大小RBC颜色颜色间日疟胀大变淡恶性疟正常或

16、缩小正常间日疟环状体形态 约占寄生红细胞的1/3，很少见到一个红细胞寄生2个环状体和一个环状体有2个核。间日疟大滋养体形态 虫体增大，胞质增多，伸出伪足。 出现黄褐色的疟色素。 红细胞胀大，变形，颜色变淡，并出现数量较多，淡红色的小点，称薛氏小点间日疟成熟裂殖体形态红细胞红细胞： 胀大，褪色，可见薛氏小点。大大 小小： 个体较大。胞浆和核胞浆和核：裂殖子1224个平均16个，排列不规则，核红色，胞浆浅兰色。色色 素素： 黄褐色常集于疟原虫的一边。间日疟配子体形态 雌配子体：虫体较大，占满胀大的红细胞。胞质致密，色深蓝核，小致密，深红色，多位于虫体一侧，疟色素分散 雄配子体：虫体较小，占满胀大的

17、红细胞。胞质浅蓝；核大疏松，淡红色，多位于虫体的中央。疟色素分散 间日疟大滋养体与配子体的区别大滋养体大滋养体配子体配子体虫体虫体较小较小较大较大胞浆胞浆边缘不规则可见空泡边缘不规则可见空泡 边缘规则无空边缘规则无空泡泡 核核较小、不规则较小、不规则 较大有不染色较大有不染色带带色素色素较少、分布不匀较少、分布不匀色素分布均匀色素分布均匀恶性疟环状体形态 虫体：约占RBC的1/5-1/6,环状。常见几个虫同时寄生在同一细胞 核： 小致密规则、常见2个核 胞浆：纤细完整恶性疟配子体形态 雄（小）配子体：腊肠形，两端钝圆。胞浆浅蓝色或淡紫红色。核较大，疏松，位于中央，浅红色，核周可见不染色带。疟色

18、素松散分布于核周围。雌（大）配子体：新月形，两端稍尖。胞浆深蓝色。核较小，致密，深红色，位于中央，核周可见透明不染色带。疟色素密布于核的周围。间日疟、恶性疟厚血膜中形态特点 间日疟原虫间日疟原虫恶性疟原虫恶性疟原虫小滋养体（环状体）较大。核1个，较大，胞浆较厚。常呈！或，状。较小。核12个，较小，胞浆纤细。常呈！、飞鸟、和断环状。大滋养体较大。呈阿米巴样，形状不规则。核位于胞浆之中或外边，胞浆常缩成圆形或断裂成数块。色素分布不匀。较小。常呈圆形，色素细小或结成12个团块。裂殖体较大。裂殖子较大，1224个。较小；裂殖子较小，826个。配子体较大。圆形，色素粗大。雌配子体较大，核小，胞浆深蓝色，

19、雄配子体较小，核大，胞浆浅蓝色。雌配子体新月形，雄配子体腊肠形。色素黄褐色，细小。杆状，或结成粗大颗粒。分布不匀。黄褐色，颗粒细小，结成团块后，呈黑褐色。配子体色素粗大，分布于核周围。被寄生红细胞常见红细胞“影子”和薛氏点可见红细胞“影子”和茂氏点厚血膜疟原虫形态特点间日疟原虫间日疟原虫恶性疟原虫恶性疟原虫 厚血膜由于用血量较多，涂制的血膜小，红细胞重叠且干燥慢，致使虫体皱缩，空泡消失，胞浆变形，各期疟原虫的体积都略微缩小，其中只有大、小滋养体的形态有较大改变，而裂殖体和配子体的形态则无明显变化。间间日日疟疟原原虫虫厚厚血血膜膜涂涂片片嗜酸性粒细胞裂殖体小配子体大配子体大滋养体小滋养体大滋养体

20、厚血膜环状体体形态 环状体： 胞浆呈环状或向核的一侧或两侧收缩，使环的中间断裂，或围绕核。间日疟原虫的环较大，常呈分号“；”和感叹号“！”状；恶性疟原虫的环纤细，常呈冒号“：”、飞鸟“.”、V状和断环状。 间日疟小滋养体恶性疟小滋养体61厚血膜间日疟各期恶性疟小滋养体厚血膜间日疟配子体形态 雄（小）配子体雄（小）配子体核大，疏松，圆形或呈星状，胞浆较少，着色淡，疟色素颗粒大，数量较多，散在分布。 雌（大）配子体雌（大）配子体与圆形成熟的大滋养体相似，但配子体疟色素颗粒粗大，多而散在分布。间日疟原虫的配子体间日疟原虫的配子体呈圆形或卵圆形，除虫体略缩小且着色深外，均与薄血膜相似。63厚血膜恶性疟

21、配子体形态 配子体配子体呈新月形或腊肠形，如血膜干燥较慢，则可缩成圆形，核居中，疟色素围在核周，外围一圈胞浆。此外，还可见配子体的胞浆部分或全部消失，只留下核和疟色素，或核和胞浆均消失，只留下一些疟色素。 64间日疟配子体恶性疟配子体厚血膜配子体 A.疑似 疟色素 染色液杂质或灰尘 大小、色泽、位置。转动显微镜的微调时，可见它浮于红细胞之上，与原虫不在一个平面上。 B. 疑似疟原虫核 球菌或白细胞破裂散出的颗粒 球菌较大、较多，白细胞颗粒着色较淡，边缘整齐，附近常有白细胞的碎屑。 C. 疑似疟原虫胞质 网织红细胞和白细胞残留物 依据虫体大小、折光是否均匀以及核与胞质是否在一个平面上予以区别。杂

22、质与疟原虫的鉴别鉴定是否为疟原虫的五条原则1、疟原虫要有核有浆有核有浆（红核蓝浆）。2、疟原虫各期（除环状体外）均含有疟色素。均含有疟色素。3、疟原虫自然形态要像自然形态要像；疟原虫呈半透明状态呈半透明状态，模糊一团不透明者不是。4、体积最大最大的疟原虫也不不能超过中性粒细胞大。超过中性粒细胞大。5、数量极少，似是而非者判为可疑，应重新选择时即多次制片、多次检查。67血片中的疟原虫与杂质疟原虫杂质血片镜检的意义 优点：是疟疾确诊的依据金标准；简便、价廉、能够鉴别疟原虫种类，方便评估感染原虫密度。 缺点：费时费力、对检验者的专业知识和操作经验要求较高，检测敏感性低。二、免疫学诊断1、循环抗体检测

23、2、循环抗原检测1、循环抗体检测 人类感染疟疾后，在感染后2周内出现特异性抗体，48周达高峰，然后下降，并且在疟疾清除后仍可持续3-6个月（带虫免疫）。 方法： 间接荧光抗体试验(IFA)、 间接血凝试验 酶联免疫吸附试验(ELISA)原理：用已知抗原检测未知抗体原理：用已知抗原检测未知抗体 间间 接接 免免 疫疫 荧荧 光光 法法 原原 理理 示示 意意 图图疟疟原原虫虫血血涂涂片片间间接接荧荧光光抗抗体体试试验验意义 由于疟疾抗体在患者治愈后仍能持续一段时间，且广泛存在着个体差异，因此抗体检测在临床上仅作为辅助诊断。其主要用于疟疾的流行病学调查，包括了解疟疾地方性流行水平、监测传播强度、确定范围、防治效果评估及输血对象的筛选。2、循环抗原检测 利用血清学方法检测疟原虫。循环抗原常用的方法有放射免疫试验、酶联免疫吸附试验和快速诊断实验(RDTs)等。快速诊断实验(RDTs) 是用来检测疟疾现症或近期感染者血液中疟原虫特异性抗原的试验方法。其检测原理主要基于免疫层析技术利用纤维膜的毛细作用，使血液中待测疟原虫抗原沿膜表面向前运动与检测区标记的特异性抗体结合根据