细胞培养学课件：第七章 个别细胞和组织的培养

1、第七章第七章 个别细胞和组织个别细胞和组织 的培养的培养 类型：类型： 正常细胞培养正常细胞培养 肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养 第一节第一节 正常细胞培养正常细胞培养 v正常细胞，在体外培养时都正常细胞，在体外培养时都不易生长，建不易生长，建 立细胞系更难。立细胞系更难。 v正常细胞难培养的正常细胞难培养的原因：它们是分化的细原因：它们是分化的细 胞，对体外生存条件要求严格胞，对体外生存条件要求严格. v但只要一切条件适当仍有培养成功可能。但只要一切条件适当仍有培养成功可能。 上皮组织由排列密集而规则的细胞和少量上皮组织由排列密集而规则的细胞和少量 间质构成，细胞之间借粘着物和特殊连接结构间质构成

2、，细胞之间借粘着物和特殊连接结构 相连。分布于人体或动物体的外表面和管、腔、相连。分布于人体或动物体的外表面和管、腔、 囊的内表面，按照细胞的层次可分为单层上皮囊的内表面，按照细胞的层次可分为单层上皮 和复层上皮。和复层上皮。 特征性生长状态特征性生长状态：膜状生长（细胞紧密相膜状生长（细胞紧密相 连），细胞数量多时最为明显；不规则多角形，连），细胞数量多时最为明显；不规则多角形， 呈铺路石样；以及呈铺路石样；以及“拉网拉网”现象（现象（Netting）。）。 一、上皮细胞类培养一、上皮细胞类培养 v胚胎发育的内、中、外三个胚层均可分化成上胚胎发育的内、中、外三个胚层均可分化成上 皮组织。皮组

3、织。 v身体不同部位的上皮组织身体不同部位的上皮组织 ，因为所处的位置不，因为所处的位置不 同而有不同的功能，主要表现为保护、吸收、同而有不同的功能，主要表现为保护、吸收、 排泄和分泌等功能。排泄和分泌等功能。 v培养中只有源于培养中只有源于外和内胚层外和内胚层的细胞能反映出上的细胞能反映出上 皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。 v在体外培养时，上皮组织还部分保留体内生在体外培养时，上皮组织还部分保留体内生 长时的特性。长时的特性。 一方面上皮细胞常成群存在或紧密相连一方面上皮细胞常成群存在或紧密相连 成单层膜，极少出现脱离细胞群而单独存在成单层膜，极少出

4、现脱离细胞群而单独存在 的细胞，表现为上皮细胞生长的群体依赖性。的细胞，表现为上皮细胞生长的群体依赖性。 另一方面，上皮组织经一段时间的生长另一方面，上皮组织经一段时间的生长 增殖，细胞数量增多，细胞相互接触连接成增殖，细胞数量增多，细胞相互接触连接成 片后，细胞的生长受到抑制，培养细胞的数片后，细胞的生长受到抑制，培养细胞的数 量不再增加，此现象为接触抑制。量不再增加，此现象为接触抑制。 v体外培养上皮组织的生长与增殖特性：同体外培养上皮组织的生长与增殖特性：同 其他组织来源的细胞相比，上皮组织的细其他组织来源的细胞相比，上皮组织的细 胞培养条件要求更高，常需生长在特殊的胞培养条件要求更高，

5、常需生长在特殊的 生长基质上，且极易失去在体内已有的分生长基质上，且极易失去在体内已有的分 化特征，如细胞极性等。因此上皮细胞的化特征，如细胞极性等。因此上皮细胞的 体外培养条件和要求不仅保证上皮细胞在体外培养条件和要求不仅保证上皮细胞在 体外的生长和繁殖，而且应尽可能地恢复体外的生长和繁殖，而且应尽可能地恢复 和诱导上皮细胞在体外培养状态下的分化。和诱导上皮细胞在体外培养状态下的分化。 v生长基质的支持：生长基质的支持： 体内的上皮组织的基底面一般均附着在体内的上皮组织的基底面一般均附着在 基膜上，借此与结缔组织相连。基膜上，借此与结缔组织相连。 一旦将上皮组织从体内环境转移到体外一旦将上皮

6、组织从体内环境转移到体外 培养，上皮细胞只能依赖贴附于某种支持物培养，上皮细胞只能依赖贴附于某种支持物 上才能生长，即所谓贴壁依赖性细胞。上才能生长，即所谓贴壁依赖性细胞。 v特殊的培养基：特殊的培养基：可用于上皮组织体外培养的培养基有可用于上皮组织体外培养的培养基有 M199、RPMI1640、DMEM和和F12。其中。其中M199、RPMI 1640较为常用。较为常用。 由于许多上皮组织的体外培养都依赖于血清才能生由于许多上皮组织的体外培养都依赖于血清才能生 长，所以在培养时一般都要在上述培养基中添加一定浓长，所以在培养时一般都要在上述培养基中添加一定浓 度血清。在培养基中尚需添加各种促细

7、胞生长因子，以度血清。在培养基中尚需添加各种促细胞生长因子，以 促进细胞的生长和增殖。促进细胞的生长和增殖。 但由于血清成分复杂，其中也含有一定量的有毒物但由于血清成分复杂，其中也含有一定量的有毒物 和抑制物，所以人们在已知细胞培养所需促生长物质和和抑制物，所以人们在已知细胞培养所需促生长物质和 促细胞贴附物质的基础上设计了无血清培养基，无血清促细胞贴附物质的基础上设计了无血清培养基，无血清 培养基也有良好的促生长作用，但仍需完善和改进。培养基也有良好的促生长作用，但仍需完善和改进。 v 去除成纤维细胞去除成纤维细胞 体内的上皮组织借薄层基膜和结缔组织相体内的上皮组织借薄层基膜和结缔组织相 连

8、。在分离细胞培养时，由于取材时会带入少连。在分离细胞培养时，由于取材时会带入少 量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮 细胞混杂生长。细胞混杂生长。 由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附力强由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附力强 的特点，很容易的特点，很容易“疯长疯长”为培养物中的优势细为培养物中的优势细 胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为 细胞的污染源。细胞的污染源。 在培养上皮细胞时，要特别注意去除和抑在培养上皮细胞时，要特别注意去除和抑 制成纤维细胞的生长。制成纤维细胞的生长。 v上皮细胞培养有上皮细胞培养

9、有三个难点三个难点： 需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则 利于细胞生长；利于细胞生长； 需求特殊培养基；需求特殊培养基； 与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞 同时混杂生长，并常压过上皮细胞。同时混杂生长，并常压过上皮细胞。 纯化和延长上皮细胞生存期纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养是上皮细胞培养 的关键之一。的关键之一。 （一）表皮细胞培养（一）表皮细胞培养 表皮属于一种角化的复层扁平上皮，由角质表皮属于一种角化的复层扁平上皮，由角质 形成细胞和非角质形成细胞组成。角质形成细胞形成细胞和非角质形成细胞组成。

10、角质形成细胞 呈层排列，皮肤的干细胞位于角质形成细胞的基呈层排列，皮肤的干细胞位于角质形成细胞的基 底层，具有活跃的增殖能力。真皮组织对表皮基底层，具有活跃的增殖能力。真皮组织对表皮基 底层细胞的分裂增殖具有直接的影响。底层细胞的分裂增殖具有直接的影响。 皮肤是表皮细胞培养来源，小儿包皮、早产流产儿皮皮肤是表皮细胞培养来源，小儿包皮、早产流产儿皮 肤组织最为理想。肤组织最为理想。 培养液：培养液：DMEM/F12(3:1，V/V)、胰岛素、胰岛素、 转铁球蛋转铁球蛋 白、氢化可的松、促表皮生长因子白、氢化可的松、促表皮生长因子(EGF)。 采用胶原底物或采用胶原底物或NIH3T3为饲养层细胞，

11、细胞易生长并为饲养层细胞，细胞易生长并 可发生一定程度的分化现象。可发生一定程度的分化现象。 表皮和真皮分离培养法表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞。可获得纯上皮细胞。冷消化法冷消化法 （使表皮和真皮结合松散），（使表皮和真皮结合松散），胶原酶消化效果较好胶原酶消化效果较好，对结缔，对结缔 组织有较强消化作用，对表皮细胞损伤小。组织有较强消化作用，对表皮细胞损伤小。 排除成纤维细胞排除成纤维细胞的处理，选用的处理，选用不含血小板生长因子不含血小板生长因子的的 无血清无血清培养基。培养基。 亦可用全皮消化法或组织块培养法培养，但表皮细胞亦可用全皮消化法或组织块培养法培养，但表皮细胞 和成纤维细

12、胞混合生长，难以纯化。和成纤维细胞混合生长，难以纯化。 表皮细胞培养的要点表皮细胞培养的要点: : 表皮细胞培养程序：表皮细胞培养程序： (1) 取材取材：取外科植皮或手术残余皮肤小取外科植皮或手术残余皮肤小 块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤 更好，切成更好，切成0.5 1cm2小块；小块； (2) EDTA 处理处理：先置入先置入0.02 EDTA 中中 室温置室温置5 分钟。分钟。 (3) 冷消化冷消化：换入换入0.25% 胰蛋白酶中，置胰蛋白酶中，置 4过夜；过夜； (4) 分离：分离：取出皮块，用血管钳或镊子把取出皮块，用血管钳或镊子把 表皮与真

13、皮层分开；表皮与真皮层分开； (5) 温消化温消化：取出表皮单独处理，用剪刀取出表皮单独处理，用剪刀 剪成更小的块后，置入新的剪成更小的块后，置入新的0.25胰蛋白酶胰蛋白酶 中，中，37再消化再消化30 60 分钟；分钟； (6)制细胞悬液制细胞悬液：用吸管轻轻反复吹打，用吸管轻轻反复吹打， 使成细胞悬液；使成细胞悬液； (7) 加培养液加培养液：通过通过80 目不锈钢纱网滤过目不锈钢纱网滤过 后，低速离心，吸上清，直接加入后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle 液液 和和20小牛血清小牛血清. (8)培养培养：接种入碟皿中，接种入碟皿中，CO2 温箱培养。温箱培养。 v注意事项：注意事项

14、： 冷消化目的在于使表皮和真皮结合松冷消化目的在于使表皮和真皮结合松 散；散；如冷消化后分离下来的表皮膜自身也如冷消化后分离下来的表皮膜自身也 已松散，此时亦可直接置入已松散，此时亦可直接置入PBS 中用吸管中用吸管 吹打制备细胞悬液；不再经过第二次消化。吹打制备细胞悬液；不再经过第二次消化。 （二）乳腺上皮细胞的培养（二）乳腺上皮细胞的培养 乳腺主要由腺上皮组成，培养成功时可获乳腺主要由腺上皮组成，培养成功时可获 纯上皮细胞培养物，既可培养正常乳腺，也可纯上皮细胞培养物，既可培养正常乳腺，也可 利用乳腺癌组织。利用乳腺癌组织。 1.选取脂肪少，腺体组织多的部位，尽可选取脂肪少，腺体组织多的部

15、位，尽可 能剥除脂肪组织（易培养）。能剥除脂肪组织（易培养）。 2.培养培养正常乳腺组织正常乳腺组织宜用胶原酶消化法。宜用胶原酶消化法。 3.培养培养乳腺癌组织乳腺癌组织可用两种培养方法：可用两种培养方法： 直接培养法直接培养法：适用于：适用于含纤维少含纤维少的软组织，剪切成碎的软组织，剪切成碎 片片加培养液，吸管吹打，置加培养液，吸管吹打，置3 5分钟分钟吸除上层吸除上层 非腺细胞成分非腺细胞成分反复反复23次次无菌纱布滤过无菌纱布滤过调整调整 好细胞团块浓度好细胞团块浓度移入细胞培养瓶中移入细胞培养瓶中37培养。培养。 胶原酶消化法胶原酶消化法：适合于：适合于含纤维多含纤维多的较硬癌组织。

16、的较硬癌组织。 4. 上皮细胞生长在胶原上比其他底物上效果更好，且上皮细胞生长在胶原上比其他底物上效果更好，且 生长后的乳腺上皮细胞对塑料底物的贴附甚牢不易生长后的乳腺上皮细胞对塑料底物的贴附甚牢不易 解离，不利于制成细胞悬液进行传代。在接种底物解离，不利于制成细胞悬液进行传代。在接种底物 上铺以胶原层较好，既利于乳腺细胞生长，也易使上铺以胶原层较好，既利于乳腺细胞生长，也易使 细胞分离制成悬液进行传代。细胞分离制成悬液进行传代。 5. 培养液：培养液： RPMI1640+胎牛血清，补加胰岛胎牛血清，补加胰岛 素、氢化可的松有利于乳腺上皮细胞生长。素、氢化可的松有利于乳腺上皮细胞生长。 无血清

17、无血清培养基培养基+EGFC（上皮细胞生长因（上皮细胞生长因 子）、胰岛素、氢化可的松，猪促乳素和前列子）、胰岛素、氢化可的松，猪促乳素和前列 腺素均可。腺素均可。 实验材料：实验材料： 1. 人哺乳期早期或断奶后乳汁。人哺乳期早期或断奶后乳汁。 2. 培养液：培养液：RPMI1640，15%FBS，10%人血清，人血清， 50g/ml霍乱毒素，霍乱毒素，0.5mg/ml氢化可的松，氢化可的松，1mg/ml 胰岛素。胰岛素。 3. HuS（human serum）：血库过期的血清，）：血库过期的血清， 澳大利亚抗原阴性。澳大利亚抗原阴性。5cm Nunc塑料培养皿。塑料培养皿。 4. 不含不含

18、Ca2+ 和和Mg2+ 的的1PBS，添加，添加200000 IU/L青霉素、青霉素、200mg/L链霉素和链霉素和200000U/L庆大霉庆大霉 素，素，pH7.4。 乳汁正常乳腺上皮细胞培养乳汁正常乳腺上皮细胞培养 5. 培养用液：培养用液：1mg/ml胰岛素，用胰岛素，用6mmol /L 盐酸盐酸 配制；配制；0.5mg/ml氢化可的松，用生理盐水配制；氢化可的松，用生理盐水配制； 50g/ml霍乱毒素，用生理盐水配制。霍乱毒素，用生理盐水配制。 血清和储存备用的胰岛素、氢化可的松、霍乱血清和储存备用的胰岛素、氢化可的松、霍乱 毒素、胰酶和胰蛋白酶应在毒素、胰酶和胰蛋白酶应在-20条件下

19、保存。条件下保存。 6. 消化液消化液（TEGPED） ：胰蛋白酶液：加入：胰蛋白酶液：加入 13mmol/L EGTA 10ml，用，用PBSA配置。配置。 7. 7 mmol/L EDTA：4ml，用，用PBSA配置。配置。 8. 0.2%胰蛋白酶：胰蛋白酶：4ml，用，用HBSS配置。配置。 9. 1%胰酶：胰酶：2ml，用，用HBSS配置。配置。 实验方法：实验方法： 1. 于产后于产后2 7d收集乳汁。用无菌水擦洗乳房，收集乳汁。用无菌水擦洗乳房， 将乳汁挤入无菌容器。将收集的乳汁混合后，用将乳汁挤入无菌容器。将收集的乳汁混合后，用 RPMI1640稀释，以利于离心。稀释，以利于离心

20、。 2. 将稀释的乳汁离心（将稀释的乳汁离心（6001000g，20min） 后，轻轻吸去上清。为了避免影响沉淀细胞，应后，轻轻吸去上清。为了避免影响沉淀细胞，应 留有少量液体。用含有留有少量液体。用含有5%FBS的的RPMI1640洗细洗细 胞胞 2 4次，直至上清不浑浊。次，直至上清不浑浊。 3. 用生长培养液混悬细胞，将用生长培养液混悬细胞，将50l 细胞悬液加细胞悬液加 入含入含6ml培养液的培养液的5cm培养皿中。在培养皿中。在37，5% CO2 条件下培养细胞。条件下培养细胞。 4. 3 5d后换液，以后每周换液后换液，以后每周换液2次，次，6 8d出出 现克隆。开始时，有巨噬细胞

21、混杂生长，起饲养细现克隆。开始时，有巨噬细胞混杂生长，起饲养细 胞的作用。克隆增多后巨噬细胞逐渐消失。胞的作用。克隆增多后巨噬细胞逐渐消失。 5. 传代培养。细胞长满底壁传代培养。细胞长满底壁80% 85%时，时， 可传代。每个可传代。每个5cm培养皿培养皿1.5ml加入加入TEGPED，37 孵育细胞孵育细胞5 15min。然后，混悬细胞。然后，混悬细胞。 6. 离心（离心（1000g，5min）后，用培养液混悬细）后，用培养液混悬细 胞，将细胞悬液稀释胞，将细胞悬液稀释3倍。将细胞悬液接种到培养倍。将细胞悬液接种到培养 皿或培养瓶中，每皿或培养瓶中，每3个培养皿或每个培养皿或每1个培养瓶个

22、培养瓶2ml。 人乳腺上皮细胞人乳腺上皮细胞 （三（三）胃黏膜上皮细胞的培养）胃黏膜上皮细胞的培养 1.材料来源：胚胎胃黏膜、手术切除组织。材料来源：胚胎胃黏膜、手术切除组织。 2.胶原底物胶原底物：1% 胶原蛋白或胶原蛋白或1%明胶涂布瓶明胶涂布瓶 壁。壁。 3.消化液：消化液：型胶原酶和透明质酸酶并用型胶原酶和透明质酸酶并用， DMEM配制，配制，37消化消化80分钟分钟。 4.含有特定成分的培养液含有特定成分的培养液：DMEM和和F12按按1:1 混合，添加混合，添加5% FBS、胰岛素、转铁蛋白、新、胰岛素、转铁蛋白、新 生牛脑提取物等。生牛脑提取物等。 5. 培养程序：培养程序： (

23、1) 取材：取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非 病变区粘膜少许；病变区粘膜少许； (2) 清洗：清洗：用含庆大霉素用含庆大霉素(400g/m1)和二性霉素和二性霉素 (2g/m1 的的Hanks)液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，液漂洗后，用钝器剥离下粘膜， 剪成剪成1mm大小；大小； (3) 消化：消化：在在I 型胶原酶和透明质酸酶中，于型胶原酶和透明质酸酶中，于37中中 消化消化80 分钟；分钟； (4) 离心：离心：收集细胞悬液，收集细胞悬液，800 转转/分离心后，分离心后，Hanks 液漂洗两次；液漂洗两次； (5) 接种：接种：末次离心后加入含有末

24、次离心后加入含有1 2胎牛血清的胎牛血清的 完全培养基，接种入不同孔数的培养板中；接种完全培养基，接种入不同孔数的培养板中；接种 量依不同实验目的而定。量依不同实验目的而定。 6. 结果分析：结果分析：细胞接种后一般在细胞接种后一般在16 小时内贴壁，小时内贴壁， 细胞呈多角形，胞质透明，成岛状或片状生长，细胞呈多角形，胞质透明，成岛状或片状生长， 以后逐渐联接成片。初代培养可维持以后逐渐联接成片。初代培养可维持2 3 周，第周，第 一周末达高峰，最后逐渐衰退剥落。一周末达高峰，最后逐渐衰退剥落。 7.胃黏膜上皮细胞的鉴定胃黏膜上皮细胞的鉴定 角蛋白免疫组化染色角蛋白免疫组化染色胃黏膜上皮细胞

25、呈阳性胃黏膜上皮细胞呈阳性 反应。反应。 粘蛋白组化染色显示培养的胃黏膜上皮细胞粘蛋白组化染色显示培养的胃黏膜上皮细胞 主要为分泌黏液的细胞。主要为分泌黏液的细胞。 8. 注意事项注意事项： 注意消化酶的选择和控制消化时间。注意消化酶的选择和控制消化时间。 正常胃黏膜上皮细胞一般采用正常胃黏膜上皮细胞一般采用原代培养原代培养。 多加血清并不能提高促细胞生长作用多加血清并不能提高促细胞生长作用，血清，血清 中中TGF-1有抑制上皮细胞生长的作用。有抑制上皮细胞生长的作用。 （四）肝细胞培养（四）肝细胞培养 1. 肝细胞具有取材方便和易于生长的优点，能获得典肝细胞具有取材方便和易于生长的优点，能获

26、得典 型上皮细胞培养型上皮细胞培养 2. 初代培养（组织块培养效果好）初代培养（组织块培养效果好） 原代组织块培养原代组织块培养：1mm3小组织块贴壁培养，效果较小组织块贴壁培养，效果较 好。好。(易于贴壁，生长力好，一般次日可出现生长晕）易于贴壁，生长力好，一般次日可出现生长晕） 初代消化法培养初代消化法培养：胰蛋白酶、胶原酶均可。胰蛋白酶、胶原酶均可。 全肝可采用灌流法消化全肝可采用灌流法消化（能获得较纯的肝上皮细（能获得较纯的肝上皮细 胞和较好的效果）。胞和较好的效果）。 3. 易传代形成细胞系易传代形成细胞系，常用培养基为，常用培养基为RPMI1640。 肝脏灌流法：肝脏灌流法： v需

27、用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。 (1) 无菌解剖动物，取出肝脏，先用无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS 洗除血污；洗除血污； (2) 取取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插注射器头轻轻插 入肝管中入肝管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把 消化液注入胆管系统，并不时轻柔压肝脏，以便消化液消化液注入胆管系统，并不时轻柔压肝脏，以便消化液 进入肝小叶中。进入肝小叶中。 消化液在肝内停留消化液在肝内停留20 30 分后，在吸出消化液的同分后，在吸出消化液的同 时并轻柔

28、压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出。时并轻柔压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出。 (3) 待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用 RPMI 1640 培养基培养培养基培养(较其它培养基为好较其它培养基为好)，能获得较，能获得较 纯的肝上皮细胞和较好的效果。纯的肝上皮细胞和较好的效果。 （五）内皮细胞培养（五）内皮细胞培养 1材料：人脐静脉，动物大动脉材料：人脐静脉，动物大动脉 2常用方法为常用方法为灌流消化法灌流消化法，消化用酶为胶原酶，消化用酶为胶原酶， 消化时间通常消化时间通常310min，首次用胶原酶消化时，须做首次用胶原酶消化时，须

29、做 预试验，以找出最佳消化时间预试验，以找出最佳消化时间，防止消化不足细胞未，防止消化不足细胞未 脱落，也可避免因消化过度使内皮细胞底层成纤维细脱落，也可避免因消化过度使内皮细胞底层成纤维细 胞混入。胞混入。 3. 人脐静脉培养效果好，人脐静脉培养效果好，2 3天内皮细胞即可长天内皮细胞即可长 成单层。细胞生长后，开始呈梭形，类成纤维细胞，成单层。细胞生长后，开始呈梭形，类成纤维细胞， 连接成片后始显内皮细胞形态。连接成片后始显内皮细胞形态。一般传一般传67代后即衰代后即衰 退退，难以长期维持。兔血管内皮细胞可传，难以长期维持。兔血管内皮细胞可传1030代。代。 (1)取产后的新鲜脐带；如不立

30、即培养可保取产后的新鲜脐带；如不立即培养可保 存于存于4中，但不宜超过中，但不宜超过12 小时；无菌剪取长小时；无菌剪取长 10 15 厘米一段。厘米一段。 (2) 先用三通注射器吸温先用三通注射器吸温PBS 液注入脐带的液注入脐带的 脐静脉中，洗除残血；注入口处宜用线绳结扎，脐静脉中，洗除残血；注入口处宜用线绳结扎， 以防液体返流；以防液体返流； (3) 用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静 脉中徐徐注入最终浓度为脉中徐徐注入最终浓度为0.1的胶原酶，待的胶原酶，待 末端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口末端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口 亦应结扎，以

31、防液体返流，消化亦应结扎，以防液体返流，消化3 10 分钟；分钟； (4) 吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心 管中；为获取更多细胞，可再注入温管中；为获取更多细胞，可再注入温PBS 冲洗冲洗 2 3 次彻底清除干净残余细胞，一并注入离次彻底清除干净残余细胞，一并注入离 心管中离心；心管中离心； (5) 吸除上清，加吸除上清，加1640 培养液，制成细胞悬培养液，制成细胞悬 液，接种入瓶皿中培养，顺利时液，接种入瓶皿中培养，顺利时2 3 天内细天内细 胞即可长成单层。胞即可长成单层。 血管内皮细胞血管内皮细胞 (六六) 毛细血管内皮细胞培养毛细血管内皮细胞培养

32、 v毛细血管细小，结构简单，内皮细胞外有较毛细血管细小，结构简单，内皮细胞外有较 多的结缔组织，进行分离培养有很大困难。多的结缔组织，进行分离培养有很大困难。 v近年毛细血管培养已获成功；近年毛细血管培养已获成功； v利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌 组织组织(如卵巢癌如卵巢癌) 等均可；等均可； 1材料：材料： v肿瘤条件培养基制备肿瘤条件培养基制备 (1) 取取C3H 小鼠的小鼠的S-180 实体肉瘤组织实体肉瘤组织； (2) 胰蛋白酶消化，胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良改良Eagle 氏培氏培 养液养液15m1 (含含10小牛血清小牛血清

33、) 种到培养瓶中种到培养瓶中 培养；培养； (3) 在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基；在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基； 再用含再用含10小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次，小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次， 可获多量条件培养基；可获多量条件培养基； (4) 4000 转分离心后，再通过转分离心后，再通过0.22m 微孔滤膜滤过，微孔滤膜滤过，-20冻冻 存备用存备用(临用前融解临用前融解)。 v凝胶底层制备凝胶底层制备 (1) 取取60 mm Falcon 产培养皿，加产培养皿，加1% Difco 产明胶产明胶(用不合钙和用不合钙和 镁的镁的

34、Hanks 液配制液配制)，铺盖瓶底，形成薄层；，铺盖瓶底，形成薄层； (2) 置置4过夜；用前再用少许培养液冲洗一次。过夜；用前再用少许培养液冲洗一次。 2初代培养初代培养 (1) 取材：取材：取新鲜牛肾上腺数个，先用取新鲜牛肾上腺数个，先用Hanks 液洗除血液洗除血 污；污； (2) 消化：消化：剥除被膜，分离出皮质，切成剥除被膜，分离出皮质，切成l mm3 小块，小块， 加加0.5胶原酶室温中消化胶原酶室温中消化1 小时；每隔小时；每隔10 分钟用吸分钟用吸 管吹打悬液令消化充分；管吹打悬液令消化充分； (3)过滤：过滤：通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允许能通通过不锈钢纱网滤过，网眼要

35、求只允许能通 过小于过小于110 微米长的毛细血管小段；微米长的毛细血管小段； (4)离心：离心：650 rpm，4，离心，离心7 分钟后，弃掉上清胶分钟后，弃掉上清胶 原酶；原酶； (5)再离心：再离心：沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再 离心，共两次；离心，共两次； (6) 制细胞悬液：制细胞悬液：末次沉淀物仍用含末次沉淀物仍用含10小牛血清的小牛血清的 Dulbecco 改良改良Eag1e 氏培养液重悬后，稍吹打；氏培养液重悬后，稍吹打； (7)接种：接种：接种入铺有明胶底层的培养皿中，接种入铺有明胶底层的培养皿中，37培养；培养； 在培养头在培养头

36、1 3 小时中，毛细血管小段和内皮细胞最小时中，毛细血管小段和内皮细胞最 先贴附于底物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍先贴附于底物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍 在培养液中漂浮；在培养液中漂浮； (8)换液：换液：吸除培养液，再吸除培养液，再加入肿瘤条件培养液加入肿瘤条件培养液；每两；每两 天换液一次。毛细血管小段一般成自天换液一次。毛细血管小段一般成自1 4 个内皮细个内皮细 胞，胞， v以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛，以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛， 能持续能持续2 5 天。天。 3毛细血管内皮细胞分离培养：毛细血管内皮细胞分离培养： (1) 初代培养初代培养

37、2 3 天后，镜下确认几个毛细血管天后，镜下确认几个毛细血管 内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔划圈内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔划圈 圈起；圈起； (2) 镜下检查，如圈内残有非内皮细胞时，可用显镜下检查，如圈内残有非内皮细胞时，可用显 微细针在倒置显微镜下挑除；用细胞解剖器也微细针在倒置显微镜下挑除；用细胞解剖器也 可，宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进可，宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进 行，但时间不宜过长行，但时间不宜过长(15 20 分钟分钟)；圈外非内；圈外非内 皮细胞可用无菌胶刮刮除；皮细胞可用无菌胶刮刮除； (3) 用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞；用培养液漂洗两

38、次，以去除漂浮细胞； (4) 剩余内皮细胞岛如小剩余内皮细胞岛如小(5 20 个细胞个细胞) 而少时，生而少时，生 长增殖常变得缓慢或完全不生长，此时需加入长增殖常变得缓慢或完全不生长，此时需加入3T3 等饲细胞；饲细胞接种量为等饲细胞；饲细胞接种量为4000 细胞细胞cm2； (5) 当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用胰蛋白酶当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用胰蛋白酶 消化、离心、加入肿瘤条件培养基；消化、离心、加入肿瘤条件培养基； (6) 接种入明胶底物皿中继续培养接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡被淘饲细胞死亡被淘 汰汰)，细胞增殖生长汇合后，按，细胞增殖生长汇合后，按1:5 传代。

39、传代。 二、结缔组织二、结缔组织 包括固有结缔组织、血液、淋巴液、软骨和包括固有结缔组织、血液、淋巴液、软骨和 骨，由细胞和细胞外基质构成。结缔组织的细胞骨，由细胞和细胞外基质构成。结缔组织的细胞 主要有成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞以及软主要有成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞以及软 骨和骨细胞等。骨和骨细胞等。 （一）成纤维细胞培养：（一）成纤维细胞培养： 1.包括人在内的各种动物成纤维细胞都易培养，也往包括人在内的各种动物成纤维细胞都易培养，也往 往是其他组织培养时的副产品，极易获得。往是其他组织培养时的副产品，极易获得。 2. 生物学性状稳定，很难发生转化，为二倍体细胞培生物学性状稳定，很

40、难发生转化，为二倍体细胞培 养的主要对象养的主要对象人的二倍体细胞系人的二倍体细胞系主要为主要为成纤维细胞成纤维细胞。 3. 常用胰蛋白酶消化法。常用胰蛋白酶消化法。 4. 人胚肺、幼儿包皮和扁桃体组织。人胚肺、幼儿包皮和扁桃体组织。 5. 可采用真皮片进行培养，细胞以真皮片为中心向四可采用真皮片进行培养，细胞以真皮片为中心向四 周生长，呈梭型或不规则型。周生长，呈梭型或不规则型。 6. 采用皮肤组织进行成纤维细胞培养时应尽量剥除皮采用皮肤组织进行成纤维细胞培养时应尽量剥除皮 下组织。下组织。 小鼠成纤维细胞培养条件小鼠成纤维细胞培养条件 v12.514.5d胎龄的小鼠胎儿分离效果最好；胎龄的

41、小鼠胎儿分离效果最好； v最佳培养基为最佳培养基为DMEM添加添加15%小牛血清；小牛血清； v第第3代细胞增殖最旺盛；代细胞增殖最旺盛； v室温条件下，室温条件下，0.125%胰蛋白酶消化时间以胰蛋白酶消化时间以 810min为宜。为宜。 v在培养在培养ES细胞时，应选择第细胞时，应选择第35代的小鼠成代的小鼠成 纤维细胞作为饲养层细胞。纤维细胞作为饲养层细胞。 小鼠成纤维细胞；小鼠成纤维细胞； 细胞来源：细胞来源：swiss小鼠胚胎小鼠胚胎 【原创】人成纤维细胞HF 1.细胞种类：人成纤维细胞； 2.培养天数：7d； 3.放大倍数：1010； 4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清； 5

42、.细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，贴壁生长 （二）巨噬细胞培养（二）巨噬细胞培养 M属免疫细胞，具有多种生物学功能，是研究细胞属免疫细胞，具有多种生物学功能，是研究细胞 吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要实验工具。吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要实验工具。 1. 来源于人胸水、腹水、血液和透析液等，实验多用来源于人胸水、腹水、血液和透析液等，实验多用 小鼠腹腔渗出物，不加任何刺激物的情况下，一个小鼠小鼠腹腔渗出物，不加任何刺激物的情况下，一个小鼠 腹腔可含有腹腔可含有23106个细胞，也无炎症反应，冲洗后个细胞，也无炎症反应，冲洗后 即可用于培养。若欲获取多量即可用于培养。若欲获取多量M，可于取

43、材前向小鼠，可于取材前向小鼠 腹腔注射刺激物，通常取细胞前向动物腹腔内注射腹腔注射刺激物，通常取细胞前向动物腹腔内注射5 10ml 4%硫代乙醇酸盐，缺点是很多刺激物能激活吞噬硫代乙醇酸盐，缺点是很多刺激物能激活吞噬 细胞并被其吞噬，进行培养后，刺激物不能很快被消化细胞并被其吞噬，进行培养后，刺激物不能很快被消化 掉，残留在细胞内，能干扰细胞代谢。全血可获得大量掉，残留在细胞内，能干扰细胞代谢。全血可获得大量 单核细胞，缺点是混有血小板及其他白细胞。单核细胞，缺点是混有血小板及其他白细胞。 2.其他细胞（其他细胞（LC、NC、PC和成纤维细胞等）成和成纤维细胞等）成 分的排除，大多数单核巨噬细

44、胞有极易附着玻璃表分的排除，大多数单核巨噬细胞有极易附着玻璃表 面的特性，可用面的特性，可用附着分离法附着分离法去除其他细胞成分，纯去除其他细胞成分，纯 度可达度可达95%。 3.巨噬细胞巨噬细胞对胰蛋白酶和对胰蛋白酶和EDTA均不敏感均不敏感，不易，不易 使之离壁，借此可与其他细胞相区别，也是淘汰其使之离壁，借此可与其他细胞相区别，也是淘汰其 他细胞的方法。纯利多卡因他细胞的方法。纯利多卡因37 5分钟可使细胞分分钟可使细胞分 离。离。 4.正常正常M能附着瓶壁，胞质延展，胞质有皱褶，能附着瓶壁，胞质延展，胞质有皱褶， 胞核呈特有的肾形，细胞较多时可形成单层，有时胞核呈特有的肾形，细胞较多时

45、可形成单层，有时 细胞呈多角形并连接成网状。细胞呈多角形并连接成网状。 5. 强烈的吞噬活动，如向培养中加入淀粉、乳胶粒和红强烈的吞噬活动，如向培养中加入淀粉、乳胶粒和红 细胞等，可见巨噬细胞能吞噬细胞等，可见巨噬细胞能吞噬5个以上的颗粒。个以上的颗粒。 6. 直接从腹腔获取的巨噬细胞为静止性细胞，呈圆形，直接从腹腔获取的巨噬细胞为静止性细胞，呈圆形， 伪足不明显。经硫代乙醇酸盐诱导可获得大量的炎性巨噬伪足不明显。经硫代乙醇酸盐诱导可获得大量的炎性巨噬 细胞，细胞多呈梭型，有较强的运动和吞噬能力。细胞，细胞多呈梭型，有较强的运动和吞噬能力。 7. 巨噬细胞易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不

46、巨噬细胞易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不 繁殖细胞群，难以长期生存，繁殖细胞群，难以长期生存，好的条件下仅能生活好的条件下仅能生活2 3周，周， 多用作多用作初代培养初代培养。 8. 状态不良时，胞质常不延展，胞体变圆，不透明，或状态不良时，胞质常不延展，胞体变圆，不透明，或 脱离瓶壁漂浮在培养液中和失去吞噬能力脱离瓶壁漂浮在培养液中和失去吞噬能力。 9. 巨噬细胞也能建成无限细胞系；大多来自小鼠，如巨噬细胞也能建成无限细胞系；大多来自小鼠，如 P388D-1、J774A1、RAW309、Cr. 1 等。等。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来 获取

47、细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法 如下：如下： 1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟 乙乙 酸肉汤酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺激生大量的（勿注入肠内！），以刺激生大量的 巨噬细胞。巨噬细胞。 2、引颈处死小鼠。、引颈处死小鼠。 3、手提鼠尾将其全浸入、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中乙醇中35 秒。秒。 4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕 开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上 下两侧，暴露出腹膜壁。下两侧，暴露出腹

48、膜壁。 5、用、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle 液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁， 使液体在腹腔内流动。使液体在腹腔内流动。 6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧。使腹腔中、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧。使腹腔中 液体集中于针头下吸取入针管内。液体集中于针头下吸取入针管内。 7、小心拔出针头，把液体注入离心管。、小心拔出针头，把液体注入离心管。 8、4下下250g离心离心10分钟后，去上清，加分钟后，去上清，加 10 ml Eagle培养基。培养基。 9、计数细胞。每只鼠可产生、计数细胞。每只鼠可产生2

49、030106细胞，其细胞，其 中中90%为巨噬细胞。为巨噬细胞。 10、以、以3105个贴附细胞个贴附细胞/平方厘米接种。平方厘米接种。 11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白 细胞，纯化培养细胞，用细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗液冲洗1 2次，次， 再加新再加新Eagle培养液置培养液置CO2温箱中。温箱中。 各种巨噬细胞各种巨噬细胞 (三三) 成骨细胞的培养成骨细胞的培养 1. 取材取材: 胚胎或手术切除之骨组织。多选扁骨或长骨。胚胎或手术切除之骨组织。多选扁骨或长骨。 2. 胰蛋白酶或胶原酶。胰蛋白酶或胶原酶。 3. 原代培养原代培养

50、: (1) 植块培养法植块培养法 成骨细胞具有迁移生长特点成骨细胞具有迁移生长特点 (2) 分离细胞培养法分离细胞培养法 贴壁生长的成骨细胞为梭型或多边形贴壁生长的成骨细胞为梭型或多边形, 单层铺满培单层铺满培 养瓶后可出现重叠生长。传代细胞形态与原代同。养瓶后可出现重叠生长。传代细胞形态与原代同。 4. 骨膜内层含有大量的骨原细胞，而成骨细胞是由骨原细骨膜内层含有大量的骨原细胞，而成骨细胞是由骨原细 胞增生分化而来，故亦可取骨膜进行培养。骨膜内成骨胞增生分化而来，故亦可取骨膜进行培养。骨膜内成骨 细胞含量丰富，培养的细胞可用于临床移植。细胞含量丰富，培养的细胞可用于临床移植。 5. 成骨细胞

51、的鉴定成骨细胞的鉴定 碱性磷酸酶染色时，成骨细碱性磷酸酶染色时，成骨细 胞的胞质及其周围基质呈阳性，但成纤维细胞染胞的胞质及其周围基质呈阳性，但成纤维细胞染 色呈阴性。也可用盖玻片培养，利用免疫学方法色呈阴性。也可用盖玻片培养，利用免疫学方法 标记细胞内的骨钙素，以鉴定成骨细胞。标记细胞内的骨钙素，以鉴定成骨细胞。 6. 培养的成骨细胞中常混杂有成纤维细胞，可利培养的成骨细胞中常混杂有成纤维细胞，可利 用用差速黏附法除去成纤维细胞差速黏附法除去成纤维细胞。成纤维细胞在。成纤维细胞在 510min内贴壁，而成骨细胞贴壁较慢。内贴壁，而成骨细胞贴壁较慢。 （四）软骨细胞的培养（四）软骨细胞的培养

52、软骨由软骨细胞和软骨基质组成。在软骨软骨由软骨细胞和软骨基质组成。在软骨 移植及软骨病发生机制的研究中，常需借助体移植及软骨病发生机制的研究中，常需借助体 外培养技术获得保持着分化特性的软骨细胞。外培养技术获得保持着分化特性的软骨细胞。 1. 取材取材: 胚胎或幼体的关节软骨及成人手术切除胚胎或幼体的关节软骨及成人手术切除 软骨。软骨。 2. 0.2%的的型胶原酶消化。型胶原酶消化。 3. 培养液可选择培养液可选择Ham12、DMEM和和 RPMI1640 等，加等，加20%30%小牛血清。小牛血清。 4. 前三代生长旺盛，细胞呈圆形或椭圆形，可分前三代生长旺盛，细胞呈圆形或椭圆形，可分 泌较

53、丰富的细胞外基质。传代后，细胞变为多泌较丰富的细胞外基质。传代后，细胞变为多 角形，变为梭形，角形，变为梭形，6代后以梭形为主，增生几乎代后以梭形为主，增生几乎 停止。停止。 5. 软骨细胞的鉴定软骨细胞的鉴定 根据软骨细胞产生的细胞外基根据软骨细胞产生的细胞外基 质酸性糖胺多糖、质酸性糖胺多糖、型胶原和型胶原和型胶原来鉴定。型胶原来鉴定。 细胞外基质含有酸性糖胺多糖时，甲苯胺蓝染细胞外基质含有酸性糖胺多糖时，甲苯胺蓝染 色呈异染性；色呈异染性； 应用免疫抗体法染色观察细胞外应用免疫抗体法染色观察细胞外 基质是否含有基质是否含有型胶原和型胶原和型胶原。型胶原。 D:原代软骨细胞培养7d E:第

54、2代软骨细胞培养7d，呈长梭形，多角、呈明 显的“铺路石”状，部分细胞集落已形成复层 三、肌肉组织三、肌肉组织 各种肌组织均可培养各种肌组织均可培养 （一）心肌细胞培养（一）心肌细胞培养 是最早利用的培养材料是最早利用的培养材料 1. 一般认为正常成年心脏的心肌细胞不再分裂，一般认为正常成年心脏的心肌细胞不再分裂， 因此心肌细胞的培养多采用动物或人的胚胎心脏以因此心肌细胞的培养多采用动物或人的胚胎心脏以 及刚出生动物的心脏，取心室肌。及刚出生动物的心脏，取心室肌。 2. 可应用可应用悬滴培养、组织块培养和消化培养法悬滴培养、组织块培养和消化培养法。 3. 原代培养的心肌细胞呈纺锤形，并常混有成

55、纤原代培养的心肌细胞呈纺锤形，并常混有成纤 维细胞和内皮细胞；根据心肌细胞较其他细胞成分维细胞和内皮细胞；根据心肌细胞较其他细胞成分 贴壁慢贴壁慢的特点，可采用的特点，可采用胰蛋白酶消化后反复贴壁法胰蛋白酶消化后反复贴壁法， 淘汰掉非心肌成分。淘汰掉非心肌成分。 4. 培养成功时，可于相差显微镜下，观察到培养成功时，可于相差显微镜下，观察到 横纹；培养横纹；培养1周后可见有周后可见有节律性收缩现象节律性收缩现象，细，细 胞可因收缩运动从支持物上脱落。成簇的心肌胞可因收缩运动从支持物上脱落。成簇的心肌 细胞呈放射状排列，可呈现同步化搏动。细胞呈放射状排列，可呈现同步化搏动。 5. 心肌细胞的鉴定

56、心肌细胞的鉴定 PAS 染色显示心肌细染色显示心肌细 胞中的糖原颗粒，以此鉴别心肌细胞与间质细胞中的糖原颗粒，以此鉴别心肌细胞与间质细 胞；此外可应用胞；此外可应用HE染色观察心肌细胞的形态染色观察心肌细胞的形态 结构。结构。 整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能 维持一个短时期，小鼠在出生维持一个短时期，小鼠在出生3周后周后DNA合成所合成所 需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低 至成年鼠水平至成年鼠水平 小鼠心肌细胞小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后的原代培养，一般选用生后 110d的乳鼠心脏，尤以出

57、生的乳鼠心脏，尤以出生1 4d的较好，此的较好，此 时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出 生生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢 发育成为有自律性搏动的心肌细胞。发育成为有自律性搏动的心肌细胞。 试剂试剂 1、培养液：、培养液：1：1混合的混合的DMEM / F12 培养液，添培养液，添 加终浓度为加终浓度为10%小牛血清、小牛血清、100IU/ml 青霉素、青霉素、 100g/ml 链霉素。链霉素。 2、消化液：胰酶（效价为、消化液：胰酶（效价为1：250） 0.08%、胶原、胶原 酶酶II（活力为

58、（活力为150U/mg） 0.05% ，用，用pH 7.2-7.8 的的D-Hanks溶液配制，溶液配制，-20 保存。保存。 3、 D-Hanks溶液（溶液（pH 7.2 7.8）：）：KCl0.4g , KH2PO4 0.06 g , NaCl 8.00g , NaHCO3 0.35g, Na2HPO47H2O 0.09 g , 酚红酚红 实验步骤实验步骤 v取生后取生后1 4d的乳鼠，用的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再乙醇消毒皮肤，再 用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤， 用用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开乙醇消毒皮下组织，更换

59、镊子及剪刀，开 胸取出心脏，将心脏放入盛有胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平溶液的平 皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用 D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心 脏剪成脏剪成1mm3 大小的碎片，再将心脏碎片转移至大小的碎片，再将心脏碎片转移至 离心管中，加离心管中，加5ml左右消化液，左右消化液，37消化消化5 min， 自然沉淀，弃上清。自然沉淀，弃上清。 v再加再加5ml左右消化液，左右消化液，37消化消化20min（每隔（每隔 2min振摇几下），用吸管吹打振摇几下），用吸管吹打

60、1min 后，将未后，将未 消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加 入入2ml冷的培养液终止消化，冷的培养液终止消化，1000 rpm 5min ， 弃上清，沉淀中加入弃上清，沉淀中加入D-Hanks 溶液溶液2ml， 1500 rpm 10min ，弃上清，沉淀中加入培养液，弃上清，沉淀中加入培养液2ml， 用吸管吹打制成细胞悬液。用吸管吹打制成细胞悬液。 v上述未消化完全的心脏碎片补加上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化左右消化 液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后 放入培养瓶中置于二氧化碳培养箱中（放