cDNA文库及其构建

1、cDNA文库科技名词定义中文名称:cDNA文库英文名称:cDNA library定义: 含一种生物体所有基因编码的cDNA分子的克隆群。应用学科: 遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的 cDNA文库。 目录概述定义原理cDNA文库构建的注意事项制备用于克隆cDNA的mRNATotal RNA的提取mRNA的分离cDNA双链合成概述c

2、DNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA ）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白 质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。cDNA文库显然比 基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的

3、是已经过剪接、去除了内含子的cDNA 。真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和 mRNA的100倍左右，而 且含有大量的重复序列 采用电泳分离和杂交的方法 ，都难以直接分离到目的基因 这 是从染色体 DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的 mRNA分子可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定 方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞

4、分化、细胞周期调控、细胞衰老和 死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。定义（cDNA Library） 某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的 cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中（一般为E.coli .）繁殖和扩增，理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息，称该生物基因组的cDNA文库。原理经典cDNA文库构建的基本原理：用 Oligo （ dT ）作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得cDNA文库。其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA

5、是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7） cDNA文库鉴定评价。cDNA文库构建的注意事项构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。无论怎样，应 当注意如下几个方面：保证获得数量足够的高质量的起始RNA构建cDNA文库要求的 RNA量比做 RACE和Northern blot 的要多，在材料允许 的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做

6、。老版本CLONTECH 的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA 量最好在 0.05-0.5 微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建 cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总 RNA的杂质方面要求稍松，但对 RNA的完整性则一 丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总 RNA的质量要求非 常高，不仅要求 RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰 酸胍等杂质少，最好是试剂

7、盒抽提的。反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分 mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的 mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。In vitroge n 公司基于去磷酸

8、化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer 说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长 mRNA且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。层析柱cDNA分级很关键这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心，尤其要在加入 cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检测结果一定

9、要舍弃太短的cDNA （一般400bp以下就不要了，因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。四、噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是否成 功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。一般的片段克隆连接是 固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的 DNA连接，目的基因 cDNA长的有10kb以上，短的只有500bp或更短。一系列长度不等的cDNA与载体在一起连接的结果，不同长度cDNA的连接效率就不一样。有的专家的经验是，根据

10、分级结果，有意识地将长度不同的cDNA群分别与载体连接，再分别转化或转染大肠杆菌，分别完成滴度检测，最后将不同长度级别 的文库混合在一起供杂交筛选。制备用于克隆 cDNA的mRNA1, mRNA的制备动物细胞 mRNA的制备植物细胞mRNA的制备2, mRNA的来源选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方法提高mRNA的含量3, mRNA完整性的检测1)mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(Cell-free tran slation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统，因为该系统需要制备无细胞提取物，还有人称之为”溶胞粗制品翻译系统。无细胞提取物

11、的制备：用机械的，超声波的，渗透压或用适当的去污剂等方法，将细胞溶破，冉咼速离心出去其质膜与细胞核等该提取液中含有RNA聚合酶，核糖体，tRNA和能量发生系统 常见的体外无细胞翻译系统：兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核，其合成的蛋白质 90%以上为珠蛋白缺点:已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+，可很快分解，除去体系中的珠蛋白mRNA 。麦胚系统用组织捣碎机将麦子捣碎，分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨23000g离心所得的上清夜称为S23 ;将S23分装，保存于-20 C冰箱中利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时，需加的物质与网织红细胞

12、系统相似由于该体系无 mRNA,所以必须加入 mRNA 。优点：适于研究mRNA,活力强，价格低廉等.缺 点：不同制品的活性差别较大，且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译*SDS-PAGE an alysis of prote ins tran slated by cell-free tran slati on system.Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA; Lane 3 to 7: translation products oftotal mRNA from mammalia

13、 n cells2) mRNA 在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力3)mRNA 分子的大小哺乳动物 mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb 之间.4)总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力利用哺乳动物细胞 提取的poly(A)+RNA 合成cDNA*Lane 1: -Hindlll-EcoRI; Lane 2: the first chain of cDNA;Lane 3: the seco nd chain of cDN A; La ne 4: -Hi ndlll4，mRNA在细胞中的丰度1）咼丰度mRNA目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA

14、 量的50-90%，该类 mRNA在合成和克隆 cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA .2)低丰度mRNA目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA 量的0.5%以下.5, mRNA 的富集方法典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的 mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝mRNA的丰度与文库克隆子数的关系In （1-P）N= In （1-1/n）N:所需克隆数；P:要求的概率；n: 一种mRNA 在总mRNA中的相对比例1）按大小对 mRNA进行分级分离*通过琼脂糖凝胶电泳 分离大小不同的 mRNA分子,该方法的分离效果最好，但从凝胶中回收的得

15、率较低.*蔗糖梯度离心：加入破坏 RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等，再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.2）cDNA 的分级分离* mRNA通过反转录形成cDNA,在插入到克隆载体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的cDNA分子分离开来.*优点：a）避免了分离过程中mRNA被污染的 RNA酶降解b）增加了获得全长cDNA克隆的概率c）获得更准确的分级分离效果（分子量）3）多聚核糖体免疫学纯化法*使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体.将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱（A蛋白-Sepharose 柱）上,随后用EDTA将多聚核糖体解离下来,并通过Oligo（dT

16、）层析分离 mRNA,利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍.目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝Total RNA 的提取1. 试剂配制准备工作：1、 研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml 量筒、250ml/100ml 容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内，180 C,烤6小时。2、 50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1 %oDEPC 水浸泡过夜后，121 C20mi ns 高压灭菌。3、 电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。4、常用试剂及其配方： DEPC 水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC,静置过夜后高压

17、灭菌。 0.78M 柠檬酸纳：PH=45三水合柠檬酸纳22.94g加DEPC水定容至100ml ,室温放置备用。 10%肌氨酸钠：肌氨酸钠 10g加DEPC水定容至100ml ,室温放置备用。变性裂解液：0.78M柠檬酸钠 8.25ml10%肌氨酸钠 12.375ml异硫氰酸胍 118.05g加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用临用前加 B-巯基乙醇使其终浓度为1% （v/v） 2M 醋酸钠 PH=4.5NaAc- 3H2O 13.6g加DEPC水定容至 50ml,高压灭菌，室温放置备用 3M醋酸钠 PH=5NaAc- 3H2O 20.4g加DEPC水定容至 50ml,高压灭菌，室温放

18、置备用 4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用 0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g用NaOH调PH值至8.0，定容到 100ml ,高压灭菌，室温放置备用 10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸 ）:MOPS 41.86gNaAC 3H2O 4.10g0.5MEDTA (PH 8.0 ) 20ml用NaOH调PH值6.5 , DEPC 水定容到1L,室温避光放置备用。 1x MOPS:10x MOPS 30ml加DEPC 水270ml，用时现配。 4x RNA Load ing buffer:10x MOPS 40

19、0ul甘油（高压过）200UL溴酚兰 10ul甲醛(37%) 72ul去离子甲酰氨310ulEDTA(0.5M PH 8.0) 8ulErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul在4C可保持3个月 10x PBSpH=7.4NaCl 80gKCl 2gNa2HPO4 14.4gKH2PO4 2.4g 定容至 1000ml变性电泳胶：称取0.5g琼脂糖，加入 47.5ml 1x MOPs ，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50 C左右，加入 2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。变性电泳缓冲液：在250ml容量瓶内加入 5ml甲醛，用1x MOPS 定容至250ml2. 动物组织tot

20、al RNA 的提取1.根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free 的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。2.将组织样品放入变性裂解液中，在咼速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。3.根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5 次。4.根据表1加入适量酚/氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。5. 冰浴10分钟。6.4C, 12000g 离心 20 分钟。7 .小心转移上层水相于另一个RNase-free 的无菌离心管中，内含所需的 RNA。蛋白质和 DNA分别留在了有机相和中间层。8 .加入等体积的异丙醇，-20

21、 C沉淀30分钟以上。9.4C, 12000g 离心 20 分钟。10 . 根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。11 .加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动 10秒钟。12 .4C, 12000g 离心 20 分钟。13 .小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，加入等体积的异丙醇，-20 C沉淀至少 30分钟。14 .4C, 12000g 离心 20 分钟。15. 弃上清，加 1ml75%的乙醇漂洗RNA 沉淀。4C, 12000g离心10分钟。16.弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。17. 取少量RNA用

22、于测定OD值及电泳，其余置80 C冰箱中保存。表1Mg# of tissue5008001000变性裂解液（ml）58102M NaOAC pH 4 (ml)0.50.81水饱和酚（mL）5810氯仿（mL）11.62异丙醇（mL）468变性裂解液（mL）0.50.81异丙醇（mL）0.50.8175% 乙醇（mL）111DEPC-treated H20 (mL)0.50.813. 植物组织total RNA 的提取I. 先将研钵于-80 C冰箱中预冷，然后将 1g样品在液氮中研磨成粉末状。2将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。（1g样品加入3ml变性裂解液）。3. 加

23、入0.3ml（ 1/10 体积）2M的NaAc （ ph4 5）颠倒混匀。4. 加入3ml （等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml （1/3 ）的氯仿，振荡。5. 冰浴 10min。4 C, 12000g 离心 10min6. 小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，一70 C沉淀至少1小时。7. 4 C, 12000g 离心 20min。8. 去上清，取沉淀。加1ml 4M 的LiCI溶解沉淀（1mlLiCI/g 组织），并转入1.5ml离心管中。9. 4 C, 13000rpm 离心 15min 。10. 用0.4ml DEPC 水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2

24、体积的氯仿，颠倒混匀。II. 4 C, 13000rpm 离心 10min。12. 取上清，加1/10体积的3MNaAc （ ph5 ）和2倍体积的无水乙醇，一 70 C沉 淀30min以上。13. 4 C, 13000rpm 离心 15min 。14. 弃上清，用 1ml 75% 的乙醇洗涤沉淀， 4 C, 13000rpm 离心10min。15. 弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。16. 用 40 60ul DEPC 水溶解（300-500ug/g）RNA 沉淀。17. 取少量RNA用于测定 0D值及电泳，其余置80 C冰箱中保存。4. TRIzol Reage nt 提

25、取 total RNA（GIBCO）1 .查表2根据样品量选择适当的TRIzol Reage nt体积装入50ml RNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzol Reage nt 体积的10% 。2 .将组织样品放入TRIzol Reage nt中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。3 .室温温育 10分钟。4 .据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育 3分钟。5 . 4ºC , 12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。6 .转移上清于另一个Rnase-fre

26、e 的50ml离心管中。根据表 2加入适量异丙醇，-20ºC 沉淀1小时以上。7 . 4ºC,12000g离心 10 分钟。8 .去上清，据表 2加入适量体积的 75%的乙醇混匀。9. 4ºC , 7500g 离心 5 分钟。10 .去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER, 溶解沉淀。11 . 取少量 RNA用于测定其 OD值和电泳，其余置-80ºC 冰箱中保存。表2组织量TRIzol Reagent氯仿异丙醇75吃醇50100mg1ml0.2ml1ml1mlmRNA的分离1.Oligotex mRNA K

27、its (QIAGEN )法准备工作：1. 将Oligotex Suspension 置于37 C水浴中，旋转混匀，溶解 Oligotex.,然后置 于室温。2. 将OBB Buffer 置于37 C水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。3. 将OEB Buffer 置于70 C水浴中，待用。试验步骤：表3 :加入试剂量据此表Total RNARNase-free Wate r to:Buffer OBB(ul)OligotexSuspension (ul)Prep size=0.25mg250ul250ul15Mini0.25-0.5mg500ul500ul30Midi0.5-0.75

28、mg500ul500ul45Midi0.75-1.00mg500ul500ul55Midi1. Total RNA量不要多于 1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中,加 RNase-free water 补足到 500ul2. 根据表 3加入适当体积的OBB Buffer 和Oligotex Suspension , 轻弹1.5ml离心管彻底混匀3. 置于70 C水浴中 3min4. 取出置于室温(20 C 30 C) 10min5. 13000rpm 室温离心2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到 polyA被结合上。6. 用移液器取 400ul

29、OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到Spin Column中，RT , 13000rpm ，离心 1min7. 将Spin Column转移到一个新的1.5ml离心管中，加 400ul OW2 , RT ,13000rpm ，离心 1mi n8. 将 Spin Column转移到一个新的1.5ml 管中，取出 25ulOER Buffer(70 C )到Column 中，用移液器吹打3 4次树脂，室温 13000rpm，离心1min 。9. 取出25ul OER Buffer(70 C )到Column 中，用移液器吹打3 4次树脂， 室温13000rpm，离心 1min 。10.

30、测OD,并电泳定量。2. 磁珠法分离mRNA1. 在 RNase-free 的 Eppendorf 管中加入 0.11.0mg 的总 RNA 和 RNase-free 水至终体积为 500ul.2. 65ºC加热 10 分钟。3.加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul20 XSSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10分钟左右。4.同时配 0.5 XSSC 1.2ml 和 0.1 XSSC 1.4ml.5.将磁珠(SA-PMPs )轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧(约 30sec )，小心去上清，切不可离心。用0.3ml 0.5

31、 Xssc漂洗 SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。6.将漂洗后的SA-PMPs 重新悬浮于 0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs 应在30分钟内使用。7.将(3)中的 oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA PMPs 管中，轻轻摇匀，室温下放10分钟。8. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清，但不要弃去。9. 用0.1 XSSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至 SA-PMPs 悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs.10. 将SA-PMPs 重新悬浮在 0.1ml RNase-free水中，反复颠

32、倒，使SA-PMPs散开，洗脱 mRNA。11. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的 mRNA吸入另一个新的Eppendorf 管中。12. 将SA-PMPs 再悬浮于 0.15ml RNase-free的水中，洗脱，与(11 )步洗脱液 合并。13将得到的 mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见 14-18 ）。14.加0.1体积的3mol/l NaAc 和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20ºC 沉淀过夜。15.4ºC ，13000g 离心60 分钟。去上清，加入 500ul 70% 乙醇混匀。

33、16.4ºC ， 7500g 离心 10 分钟。17. 去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free 水溶解。18. 重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱注意事项：1 所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行2 .如果total RNA 质量高，杂质少，就选择Oligotex 的方法分离 mRNA，相反则可以用磁珠法。3. mRNA 的电泳图是 smear 。cDNA双链合成1. Superscipt II RT 合成第一链1.在一 RNase-free 的 0.2ml PCR 管中，加入xul mRNA(大约 500ng)1ul Xho I Prime

34、r(1.4ug/ul)(5 GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAG TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3)11-x ul RNase-free water(大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.)2.混匀后,70 C反应10分钟;3.反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5mi n;4.稍微离心一下，顺序加入以下试剂：4ul 5 xfirst strand buffer2ul 0.1M DTT1ul 10mM dNTP( 自己配制)5.混匀，稍微离心反应物之后,42 C放置2分钟；6.反应完成

35、，趁热加入 1 ul Superscipt IIRT,混匀；7.42 C反应50分钟，然后70 C ,15分钟火活反转录酶.2. cDNA 第二链的合成1.第一链反应完成后，取2ul 一链产物20 C冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):20ul 10 x DNA Polymerase I buffer6ul 10mM dNTP(自己配制)xul dd H201ul RNase H(2U/ul)10ul DNA Polymerase l(10U/ul) 总体系为200ul;2. 混匀后,16 C反应2.5小时;3. 70 C灭活10分钟；4.反应

36、完成后，得到200ul cDNA第二链反应体系，将此体系置于冰上；5.取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder ，确定双链的大小范围。注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。3. 双链cDNA末端补平1. 在第二链反应体系中，顺序加入下列试剂(promega):6ul 10mM dNTP2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)2ul BSA(10mg/ml)2. 稍微离心混匀反应物，37 C反应至少 30分钟，然后75 C灭活10分钟3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇，剧烈振荡后，常温下13000g离心5分钟；4. 离心后，

37、吸取上清于另一1.5ml eppendof管中，加入等体积氯仿，上下颠倒几次混匀后，常温下13000g离心5分钟；5. 吸取上清至另一eppendof 管，加入1/10V3M NaAc(PH5.2) 和2.5V预冷的无水乙醇，混匀,-20 C放置过夜以沉淀双链cDNA;6. 第二日，将昨日沉淀物在4C ,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7. 离心完毕，弃上清，加入1ml 70% 乙醇洗涤沉淀，常温下13000g离心5分钟；8. 离心完毕，弃上清，干燥沉淀至无乙醇气味.注：第3，第4步可以用 PCR 纯化试剂盒代替。PCR纯化试剂盒操作流程:1 .溶液PE使用前应加入适量体积95

38、% 100%的乙醇，混匀。2 .向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。3 .加入 spin column 中，13000rpm 离心 1min。4 .加入 0.75ml buffer PE , 13000rpm 离心 1min。5. 13000rpm，再离心 1min。6 .将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB ，静置10min 。7. 13000rpm 离心 2min 。8 .加入 30ul buffer EB ，静置 10min 。9. 13000rpm 离心 2min 。10 .加入1/10体积3M的NaAc , 2.5

39、倍体积无水乙醇，混匀，一20 C沉淀过夜。4 EcoR I adaptor 加接1. 往双链 cDNA 沉淀中加入 9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4C至少放置 30分钟以充分溶解 cDNA沉淀；2. 溶解完成后，顺序加入下列试剂：1.2ul 10 XLigase Buffer1ul 10mM rATP1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)3. 混匀后,4 C连接3days,或者8 C过夜连接；5双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切1. 连接反应完成后，将反应体系 70 C放置15分钟灭活 T4 DNA Ligase;2. 稍微离心使反应物集中至管底，

40、室温下放置 5分钟，然后加入下列试剂：1ul 10 XLigase Buffer1ul 10mM rATP6ul dd H2O1ul T4 PNK(10U/ul)3. 37 C反应30分钟，然后70 C灭活15分钟；4. 稍微离心使反应物集中至管底；5. 室温放置5分钟；然后加入下列试剂 ：4ul Xho 10 x Buffer2ul BSA5ul ddH2O8ul Xho I (10U/ul)6. 37 C反应1.5小时，然后65 C灭活酶10分钟；7. 反应完成，双链cDNA合成完毕。置于4 C准备回收。6.胶回收cDNA1 .配制小胶数板(每个样品一板)：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/3

41、00ml 胶2 取4 C保存样品上样,40ul/ 孔。3 .电泳 50V ; 1hr4 .紫外灯下分别切下5001kb、1.0-2.0kb 及 2.0-4.0kb cDNA片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。5. 称取胶重，加入三倍体积 buffer QXI (例如，100mg 胶中加入 300ul buffer QXI )6 . 50 C水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹QIAEX II使重悬，每管中加入5ul QIAEXII7 . 50 C 水浴10min，每隔2min取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮8 . 4C, 13000rpm , 30sec。(弃上清，离心机

42、中甩一下，吸取上清)9 .加入 500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬10 .离心并去上清(同操作 8)11 . 加入 500ul buffer PE ，重悬 QIAEX II，离心 30sec，去上清12 . 再加入 500ul buffer PE ，重悬 QIAEX II，离心 30sec，弃上清，离心机中 甩一下，吸去上清13 . 超净台上吹干(至无乙醇味)，加入10ul elution buffer ，重悬 QIAEX II静置5min , 13000rpm ， 30sec。吸上清，冰上放置。14 . 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准(1kb ladd

43、er )及DNA含量标准(10ng , 20ng )作对照。15 . 将收回的CDNA置于-20 C内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。注意事项：1 .胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCI浸泡过夜。2 .胶回收时电压要稳定。cDNA第一链的合成oligo(dT)引导的DNA合成法：缺陷：因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5-末端,必须从3-末端开始合成 cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言，特别麻烦.随机引物引导的cDNA 合成法 (randomly primed cDNA synthesis):根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物)

44、,作为合成第一链cDNA的引物在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从 mRNA模板的许多位点同时发生 ，而不仅仅从 3-末端的oligo(dT)引物一处开始cDNA第二链的合成1,自身引导合成法单链cDNA的3端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链缺点：在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于 mRNA 5端的地方的序列出现缺失和重排 S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子自身引导法合成双链cDNA2,置换合成法原理：以第一链合成产物 cDNA:mRNA 杂交体作为切口平移的模板 ,RN

45、A酶H在杂交体 的mRNA链上造成切口和缺口 ，产生一系列 RNA引物，在大肠杆菌 DNA聚合酶I的作 用下合成 cDNA的第二链优点：a）合成cDNA的效率高b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化c）避免使用 S1核酸酶来切割双链cDNA3,引物-衔接头法双链cDNA分子的克隆将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，转化大肠杆菌寄主细胞增殖.1, 同聚物加尾法利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3-端都加上一个互补的同聚片段，通过退火使两个片段连接成重组质粒，再将重组质粒转化受体细胞同聚物加尾法克隆双链cDNA2, 接头-衔接头法3, mRNA-cDNA 克隆法方法：在mRNA

46、反转录合成 cDNA第一链后，将dA残基加到 mRNA:cDNA 杂交体上 然后与带dT尾的克隆载体连接，转化受体细胞，在宿主细胞内，mRNA被降解并代之以 DNA.缺点：克隆的效率低 （为双链cDNA克隆的1/10）4,0kayama-Berg法合成并克隆双链cDNAcDNA文库的筛选和鉴定1核酸杂交是最常用，最可靠的方法之一可大规模地分析文库的克隆子1）同源探针：至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆 .2）部分同源探针：探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.3）总cDNA探针:通过反转录酶均匀掺入放射

47、性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly（A）+mRNA 进行末端标记而获得cDNA探针.cDNA扣除探针：从第一种 mRNA制备cDNA探针，连续多次与 20倍过量的第二种mRNA杂交；回收未杂交的 cDNA探针，再与100倍过量的第一种 mRNA杂交，使得原 mRNA 中的一些特异序列得到高度富集*主要用于探测 cDNA文库中与调节水平有所差别的 mRNA克隆.5）合成寡核苷酸探针2特异性免疫学检测在cDNA表达文库中，目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应，通过酶学的方法加以检测3 cDNA克隆的同胞检测将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚 cDNA文

48、库,对每组亚cDNA文库进行检测，当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测，直到获得阳性单克隆4 cDNA克隆的确证cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框第四节目的基因的分离外源基因：插入到载体内的那个特定的片段基因1目的基因：DNA片段.那些已被或者准备要分离，改造,扩增或表达的特定基因或cDNA文库组标准流程:载体制备1 . pBlueScriptll 的提取1. 取1ul商品的pBlueScriptll ，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上，37 C培养过夜。2 .第二天取一只无菌的50ml离心管，加入 10ml AMP 抗

49、性的LB液体培养基，挑单克隆于离心管中，37 C, 250rpm，培养过夜。3 .第三天取 200µl小摇后的菌液接种于 250ml含AMP的LB液体培养基 中，37 C, 250rpm 培养 6 hr左右，使 0D值达到 0.6-0.8。4 .将菌液移入250ml离心管中， 4 C, 3000rpm，离心15min。取出离心管，菌团朝上倒掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。(注意离心前需配平)5.加入 10ml 溶液1( 50mM Glucose , 25mM Tris-HCl , 10mM EDTA , pH8 . 0)，加入 RNase至终浓度100µg

50、/ml ，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静 置 10min。6 .按 NaOH ( 0.4N ): SDS ( 2% ) -1 : 1的比例新鲜配制溶液H,加入 20ml溶液n,静置 3-5min 。注：静置时间勿超过5min ,提前将溶液川置于冰盒中。7 .加入15ml冰浴的溶液川，冰浴15-30min 。8. 4C, 5000rpm，离心 15min 。9 .取上清于两个50ml离心管中，弃去原离心管中的沉淀。10 每管加入 0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，室温下放置10min11.20 C, 12000g，离心 20min回收质粒沉淀。12 .弃上清，用70%的乙醇洗 2次。13 .弃上清，

51、倒扣于吸水纸上，尽量空干液体。14 .用3ml TE （ pH8.0 ）溶解沉淀，移入1.5ml Eppendof离心管中。15 .电泳检查 DNA质量并定量。（必要的话，可以用胶回收的方法先纯化一下 质粒再进行双酶切。）2. pBlueScriptll的双酶切消化1 .以如下体系进行EcoRI酶切：pBSK(+) X µl( 6µg )ddH2O 174-X & micro;l10X Buffer E 20 & micro;l混匀，加入限制性内切酶：EcoRI (10U/ & micro;l )6 & micro;l总体积为 200 & micro;l。2 .轻弹管壁

52、或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。3 . 37 C,水浴 1hr。4 .加入 200ul 1:1 的酚 /氯仿，混匀。 4 C, 13000rpm ，离心 15min。5.取上清，加入等体积的氯仿，4C, 13000rpm，离心10min。6 .取上清，加入0.1倍体积的 NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，一20 C,沉淀30min 。7. 4 C, 13000rpm ，离心 10min，弃上清，取沉淀。8 .加入200ul 70% 的乙醇洗沉淀。9 . 4C, 13000rpm，离心 10min，弃上清，取沉淀。10 .自然风干沉淀，至无乙醇味，加入100ul ddH2O 充分溶解沉淀

53、。11 .加入以下试剂进行XhoI酶切：ddH2O 74 & micro;l10X Buffer D 20 & micro;l混匀，加入限制性内切酶XhoI :XhoI(10U/ & micro;l)6 & micro;l总体积为 200 & micro;l。12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下13.37 C,水浴 1.5hr。14 .加入 200ul 1:1 的酚/氯仿，混匀。15 . 4 C, 13000rpm ，离心 15min 。16 .取上清，加入等体积的氯仿，4 C, 13000rpm，离心10min。17 .取上清，加入0.1倍体积的 NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，20 C,沉淀30min 。18. 4 C, 13000rpm ，离心