辣根过氧化物酶

1、第三节第三节 酶标记物的制备酶标记物的制备 2021/3/172 一、酶制剂及其底物一、酶制剂及其底物 v作为标记抗体用的酶应满足下列要求作为标记抗体用的酶应满足下列要求: (1) 活性高活性高 (2) 性质稳定性质稳定 (3) 专一性强专一性强 (4) 酶催化底物的显色信号易于判断和测量酶催化底物的显色信号易于判断和测量 (5) 方法敏感方法敏感,重复性好重复性好,简单易行简单易行 (6) 酶的底物易于配制保存酶的底物易于配制保存,酶及底物价廉酶及底物价廉 v目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶 (HRP)和碱性磷酸酶和碱性磷酸酶(AP),其次

2、还有葡萄糖氧化酶其次还有葡萄糖氧化酶,-半半 乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。 2021/3/173 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP) v HRP比活性高比活性高,稳定稳定,分子量小分子量小,纯酶容易制备。纯酶容易制备。 v HRP广泛分布于植物界广泛分布于植物界,辣根中含量高辣根中含量高,由无色的酶蛋白和棕由无色的酶蛋白和棕 色的铁卟啉结合而成的糖蛋白色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量糖含量18%。 v HRP由多个同功酶组成由多个同功酶组成,分子量为分子量为40,000,等电点为等电点为PH39, 酶

3、催化的最适酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异因供氢体不同而稍有差异,PH5左右。左右。 v HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和和275nm, 一般以一般以OD403nm /OD275nm的比值的比值RZ表示酶的纯度。表示酶的纯度。 v 高纯度的酶高纯度的酶RZ值应在值应在3.0左右左右(最高可达最高可达3.4)。 2021/3/174 HRP酶促反应酶促反应 v酶促反应的过程: HRP DH2H2O2D2H2O v供氢体的种类很多供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。目前用得形成的产物特点不一。目前用得 较广泛和较满意的供氢体是较广泛和较满意

4、的供氢体是:OPD和和TMB。另外。另外,还还 有一种供氢体称有一种供氢体称ABTS2, 2-边氮基边氮基-双双(3-乙基苯并乙基苯并 噻吡咯啉噻吡咯啉-6磺酸磺酸),灵敏度和稳定性均好。灵敏度和稳定性均好。 v由于由于HRP的底物的底物H2O2本身又是酶的抑制剂本身又是酶的抑制剂,因此酶促因此酶促 反应中使用的反应中使用的H2O2不能过量。不能过量。 2021/3/175 HRP常用底物常用底物 底物底物产物性质产物性质主要吸收峰波长（主要吸收峰波长（nm） ABTS绿色水溶性产物绿色水溶性产物410、650 OPD 邻苯二胺邻苯二胺 桔黄色水溶性产物桔黄色水溶性产物492 TMB 四甲基联

5、苯胺四甲基联苯胺 蓝色水溶性产物蓝色水溶性产物 加入硫酸或磷酸加入硫酸或磷酸,产生黄色产生黄色 370、652 450 DAB 3.3二氨基联苯胺二氨基联苯胺 不溶性棕色沉淀不溶性棕色沉淀免疫组化免疫组化 Chloronaphthol产物颜色介于蓝色产物颜色介于蓝色-蓝紫色蓝紫色,易于成像易于成像免疫印迹、免疫组化免疫印迹、免疫组化 AEC棕红色沉淀棕红色沉淀,容易成像容易成像多重染色的第二标记多重染色的第二标记 2021/3/176 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP), v AP:系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼

6、出来的一种磷酸酯的水 解酶解酶,由多个同功酶组成。由多个同功酶组成。 v 小牛肠粘膜小牛肠粘膜AP分子量为分子量为100kDa,酶作用的最适酶作用的最适pH为为9.6;大肠大肠 杆菌杆菌AP分子量为分子量为80kDa,最适最适pH为为8.0。 v AP作用底物较多作用底物较多,常用的酶底物有对硝基本磷酸盐常用的酶底物有对硝基本磷酸盐(PNP)、 -甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。 v AP主要用作双标记染色主要用作双标记染色,研究递质共存及酶免疫测定。研究递质共存及酶免疫测定。AP标标 记抗体记抗体,一般采用戊二醛作交联剂一步法一般采用戊二醛作交联剂一步法,使酶和抗体蛋白的使酶

7、和抗体蛋白的 氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。 2021/3/177 AP常用底物常用底物 底物底物产物性质产物性质主要吸收峰波长（主要吸收峰波长（nm） pNPP 对对-硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯 黄色产物黄色产物-硝基酚硝基酚405405nm NBT 不溶性黑紫色沉淀不溶性黑紫色沉淀免疫印迹免疫印迹 v其它其它:酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶、碳酸苷酶、溶菌酶和脲酶半乳糖苷酶、碳酸苷酶、溶菌酶和脲酶 2021/3/178 v作为酶标记对象的抗原与抗体要求: 抗原要求纯度高抗原要求纯度高, ,抗原性完整抗原性完整 抗体需要特

8、异性好、效价高、亲合力强以及比抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比 活性较高活性较高, ,能批量生产能批量生产, ,易纯化。易纯化。 2021/3/179 v制备方法要求制备方法要求: : （1 1）技术方法简单、产率高）技术方法简单、产率高, ,重复性好重复性好; ; （2 2）标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性; ; （3 3）酶标记物稳定酶标记物稳定 , ,不形成聚合物。不形成聚合物。 2021/3/1710 二、酶结合物的制备方法二、酶结合物的制备方法 方法方法原理原理酶标记率酶标记率 直接直接 结合结合 法法 过碘酸盐过碘酸盐 氧化法氧化法 过碘

9、酸盐钠氧化酶分子表面多糖羟基成醛基过碘酸盐钠氧化酶分子表面多糖羟基成醛基, 与抗体与抗体/抗原中游离反应抗原中游离反应,形成形成Schiffs碱。碱。 70% 交交 联联 法法 戊二醛戊二醛 一步法一步法 酶和抗体酶和抗体/抗原同时加入戊二醛溶液中抗原同时加入戊二醛溶液中,戊二戊二 醛两醛基分别与酶及抗体醛两醛基分别与酶及抗体/抗原上氨基反应抗原上氨基反应, 生成生成Schiffs碱碱 15% 戊二醛戊二醛 二步法二步法 酶和抗体酶和抗体/抗原先后分别加入戊二醛溶液中抗原先后分别加入戊二醛溶液中525% 苯二马来苯二马来 酰亚胺法酰亚胺法 双功能交联剂双功能交联剂PDM通过酶和抗体通过酶和抗体

10、/抗原中巯抗原中巯 基将两者偶联起来基将两者偶联起来 高高 异双功能异双功能 基团交联基团交联 法法 异双功能基团交联剂异双功能基团交联剂HECCM分别通过其羟分别通过其羟 琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基与酶和抗体琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基与酶和抗体/ 抗原上游离氨基和巯基结合抗原上游离氨基和巯基结合 85% 2021/3/1711 （一）过碘酸盐氧化法（一）过碘酸盐氧化法 v原理原理:是一种糖蛋白是一种糖蛋白,糖链部分无活性糖链部分无活性,其己糖邻位其己糖邻位- 0H可被碱性过碘酸盐氧化成醛基可被碱性过碘酸盐氧化成醛基,再与抗体蛋白中再与抗体蛋白中 游离游离-NH2形成形成schiff碱碱;酶与

11、抗体结合反应后酶与抗体结合反应后,再加再加 入硼氢化钠入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的）还原成稳定的HRP-IgG偶联偶联 物。物。 v所获酶标记抗体的产率高所获酶标记抗体的产率高,将近将近70的的HRP和和IgG结结 合合,99的的Ig与酶结合与酶结合,酶与酶与Ig的活性无重的活性无重 大损失大损失,是目前最常用的方法。是目前最常用的方法。 2021/3/1712 1、HRP标记腹水单抗标记腹水单抗 v过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法,HRP直接标记腹水中的单抗直接标记腹水中的单抗 1 1、5mg HRP5mg HRP溶解于溶解于0.5ml 0.1M NaHCO0.5ml 0.1M NaHC

12、O3 3中中; ; 2 2、加、加0.5ml10mM NaIO0.5ml10mM NaIO4 4, ,混匀混匀, ,盖紧瓶塞盖紧瓶塞, ,室温避光作用室温避光作用2h2h; ; 3 3、加、加0.75ml 0.1M Na0.75ml 0.1M Na2 2COCO3 3, ,混匀混匀; ; 4 4、加、加0.75ml 0.75ml 小鼠腹水单抗小鼠腹水单抗, ,混匀混匀; ; 5 5、加、加Sephadex G25Sephadex G25干粉干粉0.5g0.5g, ,混匀混匀, ,盖紧盖紧, ,室温作用室温作用3h3h; ; 6 6、用少许、用少许PBSPBS将交联物转移于一支下口具玻璃棉的将交

13、联物转移于一支下口具玻璃棉的5ml5ml注射器注射器 外筒中外筒中; ; 7 7、用少许、用少许PBSPBS将交联物全部洗出将交联物全部洗出; ; 8 8、收集洗出液、收集洗出液, ,加加1/20V1/20V新鲜配制的新鲜配制的5mg/ml NaBH5mg/ml NaBH4 4溶液溶液, ,混匀混匀, , 室温作用室温作用30min30min; ; 9 9、再加、再加3/20V NaBH3/20V NaBH4 4溶液溶液, ,混匀混匀, ,室温作用室温作用1h1h; ; 2021/3/1713 10、将交联物过将交联物过Sephdex G200（2.6100cm）层析纯化）层析纯化, 分管收集

14、第一峰分管收集第一峰。 Fig 2-1. Gel filtration of the reaction mixture of HRP conjugated to mAb 13A4 on a Sephadex G200 column（2.6cm100cm）, equilibrated with PBS, at a rate of 0.15 ml/min and a tube/15 min. 2021/3/1714 2、HRP标记多抗标记多抗 v 1. 称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中。 v 2. 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅 拌20分钟。 v 3. 将

15、上述溶液装入透析袋中,对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透 析,4过夜。 v 4. 加20l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化桯RP的pH升 高到9.0-9.5,然后立即加入10mg IgG在1ml 0.01M碳酸盐缓冲 液中,室温避光轻轻搅拌2h。 v 5. 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4 2h。 2021/3/1715 v 6. 6. 将上述液装入透析袋中将上述液装入透析袋中, ,对对0.15M PH7.4 PBS0.15M PH7.4 PBS透析透析, ,44过过 夜。夜。 v 7. 7. 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵在搅拌下逐滴加入等体积饱和

16、硫酸铵, ,置置4 1h4 1h。 v 8. 3000rpm8. 3000rpm离心离心30min30min, ,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二 次次, ,最后沉淀物溶于少量最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.40.15M PH7.4的的PBSPBS中。中。 v 9. 9. 将上述溶液装入透析袋中将上述溶液装入透析袋中, ,对对0.15M PH7.40.15M PH7.4的的PBSPBS缓冲盐水缓冲盐水 透析透析, ,去除铵离子后去除铵离子后( (用萘氏试剂检测用萘氏试剂检测) ), ,10,000rpm10,000rpm离心离心3030分分 钟去除沉淀钟去

17、除沉淀, ,上清液即为酶结合物。上清液即为酶结合物。 2021/3/1716 （二二）戊二醛交联法戊二醛交联法 v 原理原理:戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂,通过它的两个通过它的两个 醛基分别与醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合和抗体蛋白的氨基结合,形成形成HRP-戊二醛戊二醛- Ab蛋白结合物。蛋白结合物。 v 戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合,同时加入戊二醛进行同时加入戊二醛进行 交联反应。交联反应。 v 戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用,形成酶形成酶-戊二醛结合物戊二醛结合物, 结

18、过透析或层析除去未结合的戊二醛结过透析或层析除去未结合的戊二醛,然后再与抗体结合。然后再与抗体结合。 2021/3/1717 HRP标记多抗标记多抗 v 1、取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、 pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%),室温（20左右）反应 结合18h。 v 2、用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱,除 去游离的戊二醛,或用0.01mol/L,pH7.2PBS,4透析过夜。 v 3、将5mg抗体IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl,再与醛化HRP溶 液（10mg/mL）混合。 2021/3/

19、1718 v 4、加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液（调节pH至9.0 9.6）,4,电磁搅拌下结合24h。 v 5、加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸（0.29g溶于10mL蒸馏水） ,4放置2h,以封闭残留的醛基,终止反应。 v 6、装入透析袋,以0.01mol/L、pH7.2 PBS,4透析过夜,或通 过Sephadex G-200凝胶柱层析,用PBS洗脱,收集第1峰洗脱 液。 v 本法标记步骤比较简单本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点重复性好。缺点:酶的利用率低酶的利用率低,一般一般 只有只有24的酶与蛋白质结合。的酶与蛋白质结合。 2021/3/1719 注意事

20、项注意事项 v 1 1、标记用标记用HRPHRP的的RZRZ值应值应3.0;3.0; v 2 2、所使用试剂的所使用试剂的pHpH和浓度及用量必须严格掌握和浓度及用量必须严格掌握; ;一般一般HRPHRP: :待标待标 记物记物2 2: :1 1到到4 4: :1 1之间。之间。 ; ;所用试剂所用试剂, ,如过碘酸钠氧化法中的如过碘酸钠氧化法中的 NaIONaIO 和 和 NaBHNaBH 、戊二醛标记法中的戊二醛必需新鲜配制 、戊二醛标记法中的戊二醛必需新鲜配制; ; v 3 3、室温搅拌时须避光、室温搅拌时须避光, ,室内温度一般在室内温度一般在2525为宜为宜; ; v 4 4、标记抗

21、体的标记抗体的酶IgG克分子比应介于12之间; v 5 5、浓的标记物相当稳定浓的标记物相当稳定, ,常加入常加入303050%50%甘油于甘油于-10-10以下保存以下保存 。44可保存可保存1 12 2年年, ,但稀释成但稀释成110110, ,只能保存数周。已配制的只能保存数周。已配制的 使用液应在使用液应在1212小时内用完。切忌反复冻融。小时内用完。切忌反复冻融。 第四节第四节 酶免疫测定技术要点酶免疫测定技术要点 一、基本概念一、基本概念 v 酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ ELISA ）:结合在固相载体上的抗原结合在固相载体上的抗原 （抗体）与待检抗体（抗原）酶偶联物（标记

22、物）反应后（抗体）与待检抗体（抗原）酶偶联物（标记物）反应后,催催 化水解或氧化还原酶的相应底物呈色化水解或氧化还原酶的相应底物呈色,其颜色深浅与待测抗原其颜色深浅与待测抗原 （抗体）含量成正比。（抗体）含量成正比。 v 包被（包被（coating）:指将抗原或抗体固相化的过程。它是通过物指将抗原或抗体固相化的过程。它是通过物 理吸附作用理吸附作用,一般靠疏水键连接。一般靠疏水键连接。 v 封闭（封闭（blocking）:指用封闭剂封闭经包被的固相载体表面残指用封闭剂封闭经包被的固相载体表面残 留的未饱和位吸附位点的过程。留的未饱和位吸附位点的过程。 v 免疫吸附剂（免疫吸附剂（immunos

23、orbent）:固相化的抗原或抗体。固相化的抗原或抗体。 v 加样加样:即加标本、酶结合物和底物即加标本、酶结合物和底物,注意交叉污染和产生气泡。注意交叉污染和产生气泡。 v 温育温育:常采用的温度常采用的温度:43、37、室温和、室温和4（冰箱温度）。（冰箱温度）。 v 洗涤洗涤:是是ELISA最主要的关键技术最主要的关键技术,目的是分离游离的和结合的酶标记目的是分离游离的和结合的酶标记 物。洗涤方式自动板机、手工操作（浸泡式和流水冲洗式）。物。洗涤方式自动板机、手工操作（浸泡式和流水冲洗式）。 v 显色显色:影响因素影响因素:反应温度和时间反应温度和时间;OPD底物液应避光显色底物液应避光

24、显色,硫酸终硫酸终 止止;TMB显色终止液显色终止液:叠氮钠、叠氮钠、SDS、各类酸性终止液。、各类酸性终止液。 v 比色比色:以蒸馏水校零点以蒸馏水校零点,测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔） 和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔）。和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔）。 ELISA操作要点操作要点: v ELISA常用溶液常用溶液: 包被缓冲液包被缓冲液pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、pH7.2的磷酸盐缓冲液、的磷酸盐缓冲液、 pH78的的Tris-HCL缓冲液缓冲液 封闭液封闭液0.05%-0.5%的

25、牛血清白蛋白、的牛血清白蛋白、10%的小牛血清、的小牛血清、1%明胶、明胶、 5%脱脂奶粉脱脂奶粉 稀释缓冲液稀释缓冲液pH7.4 PBST（含（含0.05%吐温吐温20 ,1%牛血清白蛋白）牛血清白蛋白） 底物缓冲液底物缓冲液0.1M pH5.0磷酸磷酸-柠檬酸柠檬酸 终止液终止液2MH SO 洗涤缓冲液洗涤缓冲液0.15M pH7.4 PBST（含（含0.05%吐温吐温20 磷酸缓冲盐水）磷酸缓冲盐水） v ELISA常用的固相载体类型常用的固相载体类型: 聚苯乙烯（聚苯乙烯（PS）硬板）硬板对蛋白质有较强的物理吸附性能对蛋白质有较强的物理吸附性能 聚氯乙烯（聚氯乙烯（PVC）软板）软板蛋

26、白吸附性能高于蛋白吸附性能高于PS,但非特异性吸附较高但非特异性吸附较高 微孔滤膜微孔滤膜(NC膜、尼龙膜膜、尼龙膜)大多数抗原或抗体几乎全能结合到大多数抗原或抗体几乎全能结合到NC膜膜 琼脂糖珠或磁性微粒琼脂糖珠或磁性微粒共价结合抗原（抗体）共价结合抗原（抗体）,结合容量大结合容量大 2021/3/1724 标记抗体质量判定标记抗体质量判定 v （1）定性及效价滴定定性及效价滴定: 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 双向琼脂扩散试验测双向琼脂扩散试验测HRP-IgG效价效价 双向免疫扩散效价最低双向免疫扩散效价最低116116 直接直接ELISA法

27、测法测HRP-IgG效价效价 直接直接ELISAELISA效价效价110000110000以上以上 采用直接采用直接ELISAELISA法测定酶标单抗效价法测定酶标单抗效价, ,以特异显色为以特异显色为 1.01.0时的稀释倍数作为酶标单抗效价。时的稀释倍数作为酶标单抗效价。 2021/3/1726 标记抗体质量判定标记抗体质量判定 v （2）定量和克分子比值测定定量和克分子比值测定:分光光度计测定分光光度计测定(光程光程1cm) v 酶量酶量(mg/ml)OD403nm0.4 v IgG量量(mgml)OD280nm-OD403nm 0.3)0.62(过碘酸盐过碘酸盐) v IgG量量(mg

28、/ml)OD280nm-OD403nm0.42)0.940.62(戊二醛戊二醛) ) 酶量酶量(mg/ml) IgG量量(mg/ml) 酶量酶量 v HRP/IgG (摩尔比摩尔比) 4 40,000 160,000 IgG量量 v 标记率标记率 = OD403nm/OD280nm 2021/3/1727 用于用于ELISA酶标抗体的各项指标参数酶标抗体的各项指标参数 评价评价最好最好好好一般一般 酶结合量酶结合量(mg/ml)1.01.00.50.50.40.4 酶结合率酶结合率(%)309 9107 7 酶酶/IgG摩尔比摩尔比1.51.01.00.70.7 2021/3/1728 HRP

29、 含量 （mg/ml） Ig 含量 （mg/ml） 摩尔比 （E/P） 标记率效价 0.170.6531.120.3910028 表表2 单抗单抗12H7-HRP标记物性质标记物性质 2021/3/1729 三、包被抗体工作浓度确定三、包被抗体工作浓度确定 v 包被液稀释单抗包被液稀释单抗15F3为为1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、 1:5000和和1:7500包被酶标板包被酶标板; v 向酶标板中加入向酶标板中加入rhPI（1000 ng/ml）; v 然后加入经稀释的酶标抗体然后加入经稀释的酶标抗体HRP-13A4进行测定。进行测定。 v 以以P/N值最大值最大,且

30、且N值值0.1时包被抗体稀释度作为单抗时包被抗体稀释度作为单抗15F3最最 适工作浓度。适工作浓度。 2021/3/1730 15F31:10001:15001:2000 1:2500 1:50001:7500 Positive 1.669 0.017 1.685 0.015 1.722 0.059 1.645 0.025 1.494 0.036 1.339 0.049 Blank 0.107 0.003 0.102 0.003 0.079 0.006 0.069 0.002 0.067 0.002 0.062 0.003 P/Na 15.6 16.621.823.722.321.7 Table 2-2. The working concentration for mAb