出口食品霍乱弧菌的检验方法

1、出口食品霍乱弧菌的检验方法1仪器和设备1. 1恒温培养箱：36 1 C1. 2恒温水浴箱：45 土 1C1. 3高压灭菌锅1. 4拍打式均质器1. 5菌落计数器1. 6 试管:18 x 150mm12 mmx 100 mm1. 7 锥形瓶:500ml 250ml1. 8平皿：直径为 90mm1. 9灭菌盒和枪头1. 10灭菌袋1. 11酒精棉1. 12天平:感量0.1g1.13 冰箱：0-4 C 和-15 -20 C2. 培养基的制备2. 1碱性蛋白胨水称取15g干粉于1000.0ml蒸馏水中，加热溶解，分装， 121 C 10min高压灭菌。2. 2硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（ T

2、CBS称取89.1g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷至55C倾注平板备用。2. 3三糖铁（TSI）称取65g于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12 mnX 100 mm每管约24ml,115C 15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用，桔红色。2. 4霍乱双糖铁琼脂（KIA ）称取64.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热溶解，分装。121 C 15分钟高压灭菌，制成高层斜 面备用。2. 5T1N琼脂称取35g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121 C 15分钟高压灭菌。倾注平板备用。在上项成分中改变氯化钠的含量，去除琼脂可制成TN）和T1N3肉汤。

3、2. 6精氨酸葡萄糖斜面琼脂（AGS称取58g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装， 121 C 15分钟高压灭菌， 制成高层斜面备用。2. 7 O/F 实验用培养基（HLGB称取45.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每管 3ml （有的加矿物 油覆盖）121 C 15分钟高压灭菌备用。2. 8赖氨酸脱羧酶肉汤生化管2. 9MR-VP肉汤生化管3.1样品的分离培养和初步鉴定：注：霍乱弧菌菌落特征形状大，光滑，黄色，稍平，具有不透明中心和半透明的边缘。霍乱弧菌初步鉴定试验中的反应KIATSITNT1N3斜面底层斜面底层斜面底层霍乱弧 菌A（K少见）A

4、Aa+注：K-碱性；A-酸性；a-微酸性。霍乱菌属细菌在 TSI、KIA、AGS中不产H2S，也不产气。一些气单胞菌属菌株可能产气。3. 2确认试验以接种环取初步鉴定试验符合霍乱弧菌反应的TN培养物，分别接种到以下培养基：Hugh-Leifson 葡萄糖肉汤（HLGB, 36 1C培养 1824h。ONPG胨水，36 1C培养1h3h或24h。赖氨酸脱羧酶肉汤，36 1 C培养2496h。阿拉伯糖肉汤，36 1C培养24h。O/129试验用培养基，36 1C培养1824h。霍乱弧菌的生化反应表生化项目生化性状生化项目生化性状TCBSYD-甘露糖+AGSKa氧化酶ONPG+Nacl 0 %+V-

5、Pv3%+精氨酸双水解酶一6%一赖氨酸脱羧酶+8%一鸟氨酸脱羧酶+10%一抑菌试验42 C生长+10ugO/129S蔗糖一150 ugO/129SD-纤维二糖一明胶酶+乳糖一尿素酶一阿拉伯糖一注：Y-黄色；K-碱性；+ -80 %或更多的菌株阳性；一-80 %或更多的菌株阴性；v-依据种 或菌株的可变反应；S-敏感；AGS精氨酸-葡萄糖斜面。所有试验均不产 H2S和气体。4 血清学凝集试验4. 1自分离培养基上挑取可疑菌落与 0群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。如可疑菌落 在诊断血清中很快（一般在 10s）出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为阳 性。5报告结果霍乱弧菌的检出，可依据以下性状报告： 革兰氏染色阴性，无芽孢或弯曲杆菌；TSI :斜面产酸/底层产酸，不产气，不产 H2S;Hugh-Leifson试验：葡萄糖发酵阳性；氧化酶：阳性；精氨酸脱羧酶试验：阴性；赖氨酸脱羧酶试验：阳性；42 C生长：阳性；嗜盐性试验：0% Nacl + （有的非O群霍乱弧菌不生长）3% Nacl +6% Nacl 蔗糖发酵：阳性；ONPC试验：阳性；