12细胞周期(cellcycles)

1、第十二章 细胞周期(cell cycles)通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程称为细胞周期(图12-1)。在这一过程中, 细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。图12-1 细胞周期及染色体行为12.1.1 细胞周期时相及类型细胞周期是一个相当复杂的过程, 不同类型的细胞周期持续的时间不完全相同, 而且,细胞的分裂状态也各有异。 细胞周期的时相根据光学显微镜所观察到的细胞分裂时的活动, 将细胞周期分为两个主要的时期: M期(M phase)和分裂间期(interphase)。M期包括细胞的有丝分裂和胞质分裂两个过程。在有丝分裂的过程中,

2、复制的染色体被分到两个细胞核中, 胞质分裂则是将整个细胞一分为二, 形成两个子细胞。分裂间期实际上是新细胞的生长期, 根据新细胞从开始生长起到分裂前止的分裂间隔期中的生理和生化变化, 可分为: G1期(Gap1 phase), 即从M期结束到S期开始前的一段间歇期; S期, 即DNA合成期(DNA synthetic phase);G2期(G2 phase), 即DNA合成后(S期)到有丝分裂前的一个间歇期。是否所有生物的细胞周期持续的都相同？主要差别在哪里？(是否所有生物的细胞周期持续的时间都相同？主要差别在哪里？（答案） 答: 不同生物的细胞周期时间不同, 同一系统中不同细胞,其细胞周期的

3、时间也有很大的差异。细胞周期所持续的时间一般为1232小时, M期所持续的时间较短, 一般为3060分钟, 分裂间期的时间跨度较长, 根据细胞的类型和所处的生理条件不同而不同, 有几小时、几天、几周或更长。如人的细胞周期约为24小时丝裂期30分钟，G1期 9小时，S期 10小时，G2期 4.5小时。一般说来, S+G2+M的时间变化较小, 主要差别在G1期的长短。如消化系统, 小鼠食管和十二指肠上皮细胞, 它们的细胞周期时间, 分别为115小时和15小时, 食管上皮细胞的G1期长达103)不同生物的细胞周期时间不同, 同一系统中不同细胞,其细胞周期的时间也有很大的差异。表12-1是几种细胞的细

4、胞周期的比较。表12-1 某些真核生物的细胞周期时间细胞类型 细胞周期时间 早期的蛙胚细胞 30分钟酵母细胞 1.53小时 肠表皮细胞 12小时 培养的哺乳动物成纤维细胞 20小时 人的肝细胞 1年 细胞周期和细胞类群在正常的情况下, 一个完整的细胞周期应包括四个时期, 细胞沿着G1SG2M期的路线运转,但在多细胞机体中, 细胞的分裂行为有所差异。根据细胞的分裂行为, 可将真核生物细胞分为三类: 持续分裂细胞,又称周期性细胞, 即在细胞周期中连续运转的细胞。此类细胞的分裂周期非常正常, 有丝分裂的活性很高。 终端分化细胞, 即永久性失去了分裂能力的细胞，这些细胞都是高度特化的细胞, 如哺乳动物

5、的红细胞、肌细胞等。 G0细胞,又称休眠细胞，暂时脱离细胞周期,但在某些条件的诱导下重新进入细胞周期。如肝细胞, 外科手术切除部分肝组成后可以诱导进入细胞分裂。根据细胞分裂行为，可将细胞分为几种类型？各有什么特点？(根据细胞分裂行为，可将细胞分为几种类型？各有什么特点？（答案） 答: 根据细胞的分裂行为, 可将真核生物细胞分为三类:持续分裂细胞,又称周期性细胞, 即在细胞周期中连续运转的细胞。机体内某些组织需要不断的更新,组成这些组织的细胞就必须通过不断分裂产生新细胞。此类细胞的分裂周期非常正常, 有丝分裂的活性很高。如性细胞(包括卵母细胞和精原细胞),它们要不断地产生配子; 造血干细胞需要不

6、断地产生红细胞和白细胞;上皮基底层细胞需要通过分裂不断补充表面老化死亡的细胞; 植物的根茎尖端细胞需要通过分裂进行生长等都是具有正常周期的持续分裂细胞。终端分化细胞, 即永久性失去了分裂能力的细胞，它们不可逆地脱离了细胞周期, 但保持了生理活性机能。这些细胞都是高度特化的细胞, 如哺乳动物的红细胞、神经细胞、多形性白细胞、肌细胞等, 这些细胞一旦分化,就永远保持这种不分裂状态直到死亡。G0细胞,又称休眠细胞，暂时脱离细胞周期,不进行DNA复制和分裂, 也称静止细胞群。但这些细胞可在某些条件的诱导下重新开始DNA合成, 进行细胞分裂。如肝细胞, 外科手术切除部分肝组成后可以诱导进入细胞分裂。淋巴

7、细胞可通过与抗原的相互作用诱导增殖。在胚胎发育早期(卵裂期)，所有的细胞均为周期性细胞, 以后随着发育成熟, 某些细胞进入了GO期, 某些细胞分化后丧失分裂能力。到成体时,只有少数细胞处于增殖状态, 它们的增殖仅作为补充丢失的细胞, 或对外界刺激的反应。)12.1.2 细胞周期的研究方法为了研究细胞周期的不同阶段的生化特性必须获得细胞周期一致性的细胞, 这就是细胞的同步化(synchronization)。细胞同步化分为自然同步化和人工同步化。自然同步化是自然界存在的现象, 人工同步化是利用细胞培养的方法, 用各种理化因素处理获得的同步化生长的细胞。常用的细胞人工同步化的方法分为选择同步化、诱

8、导同步化或者两者的结合。 诱导同步法(induction synchrony)控制培养条件, 将非同步培养中的所有或大部分细胞暂时性地阻止在细胞周期的某个阶段, 最终使所有细胞达到同步化生长。常用的手段有改变温度、添加代谢抑制剂将细胞阻止在细胞周期的某一阶段。 胸腺嘧啶阻断技术(thymidine block technique) 高浓度的胸腺嘧啶能够阻断DNA合成所需的核苷酸的合成, 因此将细胞群体培养在具有高浓度的胸腺嘧啶的培养液，可获得同步化的细胞。 中期阻断法 某些药物，如秋水仙素可抑制微管的聚合, 因而抑制有丝分裂器的形成, 将细胞阻断在有丝分裂的中期。如何利用胸腺嘧啶和秋水仙素获得

9、同步培养的细胞？(如何利用胸腺嘧啶和秋水仙素获得同步培养的细胞？（答案） 答: 高浓度的胸腺嘧啶能够阻断DNA合成所需的核苷酸的合成, 因此将细胞群体培养在具有高浓度的胸腺嘧啶的培养液中时, 非同步化的细胞能够正常地通过细胞周期, 但到达S期时, 因DNA的合成被阻断, 这些细胞不能顺利通过S期进入G2期。经过对S期的短暂阻断, 再改变胸腺嘧啶的浓度, 解除抑制, 所有的细胞都开始DNA的合成, 即获得处于同步生长的细胞。秋水仙素可抑制微管的聚合, 因而抑制有丝分裂器的形成, 将细胞阻断在有丝分裂的中期， 适当时间后解除秋水仙素的作用，即获得处于中期的同步化的细胞。这一方法称为中期阻断法。)

10、选择同步法(selection synchrony)用物理方法将处于细胞周期中同一阶段的细胞从非同步的群体中分离出来。 选择同步化可克服同步化过程中对细胞的毒性影响。常用的方法有： 有丝分裂选择法是根据细胞在细胞周期的不同阶段的生理变化设计的一种方法。此法的优点是不受药物的影响, 同步化程度高, 不足之处是分离的细胞少, 手续繁琐。 细胞沉降分离法 此法主要用于悬浮培养的细胞，也可用于贴壁生长的细胞, 但获得的细胞的同步化程度有限, 因同一时相的细胞大小并非都是一致的。有丝分裂选择法和细胞沉降分离法获得同步化细胞方法的原理有何不同？(有丝分裂选择法和细胞沉降分离法获得同步化细胞方法的原理有何不

11、同？（答案） 答: 有丝分裂选择法是根据细胞在细胞周期的不同阶段的生理变化设计的一种方法。单层培养于细胞培养瓶内的非同步化的细胞群体中, 处于对数期增殖的细胞分裂活跃, 分裂指数高, 分裂细胞变圆、隆起, 与培养器的粘着性降低。此时轻轻摇动, M期的细胞就脱离器皿壁而悬浮于培养液中, 其它阶段的细胞则不会脱落。将倾出培养液贮存于4保存, 再向培养瓶中加入37新鲜培养液继续培养, 经1-2小时, 再如同上法收集M期的细胞。每12小时摇动并收集细胞, 最后集中所收集的培养液,离心后, 可获得一定数量的M期的同步化细胞。此法的优点是不受药物的影响, 同步化程度高, 不足之处是分离的细胞少, 手续繁琐

12、。细胞沉降分离法主要用于悬浮培养的细胞。由于细胞在其周期过程中, 体积逐渐增大, 所以处于细胞周期不同阶段的细胞体积不同。而细胞在某一离心力场中的沉降速度与其半径平方成正比, 因此可用沉降法分离所处周期时相不同而大小不同的细胞。) 条件突变体(conditional mutants)的利用利用条件突变体可研究细胞周期中的重要事件，发现细胞周期基因。例如温度敏感突变使细胞对于某种温度敏感，这样可用正常温度培养细胞而用突变温度来研究突变的事件。利用条件突变，在酵母中鉴定了几十种细胞分裂周期(cell-division cycle,cdc)突变体, 发现了一些重要的细胞周期调控基因。12.1.3 细

13、胞周期各时相的合成活动在细胞周期的不同阶段中, 生化合成反应是不同的。 G1期 (Gap1 phase)G1 期是从有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期, 又叫合成前期。此期主要合成rRNA、蛋白质、脂类和碳水化合物。在G1期的后期, DNA合成酶的活性大大增加。G1期进入S期与S期激活因子有关。如将S期和早G1期细胞融合,S期细胞可以诱导G1期细胞提前进入S期, 表明早G1期细胞尚未出现S期激活因子。 S期 (synthesis phase)即DNA合成期。细胞周期中S期是最重要的一个时期, 在此期, 除了DNA合成外, 同时还会合成组蛋白, DNA复制所需的酶都在这一时期合成。在S期, 组

14、蛋白的mRNA水平可增加50倍。也就是说, DNA的合成和组蛋白的合成在时间上是同步的(图12-2), 在密度上是相应的, 从而使新合成的DNA得以及时包装成核小体。另外, 推测组蛋白起到DNA复制延长因子的作用, 没有组蛋白的合成, DNA的复制就会停止。图12-2 DNA和组蛋白合成的协同性实验将大鼠的肝组织部分切除, 诱导肝组织的细胞同步化生长。手术后的不同时间注射3H标记的亮氨酸和14C标记的胸腺嘧啶, 1小时后测定DNA的放射性(实心圆)和组蛋白放射性(空心圆)，结果显示它们的合成是同步的。此外, 还发现DNA复制时, 不同序列的复制先后是不同的: 常染色质: 先; 异染色质: 后;

15、能转录的DNA: 先; 不能转录的DNA: 后;GC含量高: 先; AT含量高: 后; G2 期 (G2 期)是DNA合成的后期。在这一时期, 主要是大量合成ATP、RNA、蛋白质, 包括微管蛋白和成熟促进因子MPF(maturation promoting factor)等，为有丝分裂作准备。 有丝分裂期(mitotic phase,M 期)从细胞分裂开始到结束所经历的过程, 也就是从染色体的凝缩、分离到平均分配到两个子细胞为止。分裂后, S期合成的DNA减半。这一期的特点是RNA合成停止, 蛋白质合成减少, 以及染色体高度螺旋化。12.1.4 细胞周期中细胞形态结构的变化细胞周期各阶段的生

16、化变化必然会引起细胞的表型变化, 包括外部表型和内部表型。 细胞形态的变化在细胞周期的不同阶段，细胞的形态变化很大，如处于S期的细胞多呈扁平状, 紧贴在培养瓶壁上, 细胞表面的微绒毛和小泡很少。 细胞内部结构的变化内部结构的最大变化是染色质结构的变化。与染色体复制周期相关联的是核仁的变化。根据细胞周期各时相的生化活动，推测细胞的表面形态和内部结构各有哪些变化？(根据细胞周期各时相的生化活动，推测细胞的表面形态和内部结构各有哪些变化？（答案） 答: 由于细胞周期的各时相的生化活动不同，引起不同的表面和内部结构的变化：细胞形态的变化： 如处于S期的细胞呈扁平状, 紧贴在培养瓶壁上, 细胞表面的微绒

17、毛和小泡很少。 细胞进入G2期, 特别是G2期的中后期, 细胞渐渐从贴壁摊平的状态鼓起来, 而细胞表面的微绒毛增多, 此时摇动培养瓶, 细胞很容易与瓶壁脱离。进入M期的细胞, 变成球形。细胞内部结构的变化 内部结构的最大变化是染色质结构的变化。在S期, 染色体处于极松散的状态, DNA半保留复制和核小体八聚体组蛋白全保留方式偶联。到G2期已形成两条染色质纤维; 到M期, 染色单体形成。与染色体复制周期相关联的是核仁的变化。从细胞分裂前期到M期中期, 核仁消失, 核膜解体；分裂后期重新形成核膜。在间期-分裂期过渡中, 有两点明显的变化: 一是形成纺锤体, 需要大量的微管蛋白，另一是细胞表面微绒毛

18、的形成，这与细胞骨架的肌动蛋白纤维相关。) 细胞器的分裂和片段化有丝分裂不仅要保证新形成的子细胞得到全套的遗传物质, 同时要保证子细胞得到其他必备的细胞结构, 包括膜结合细胞器。由于线粒体和叶绿体等不能自我装配, 只能靠已有的线粒体和叶绿体的生长和分裂产生, 所以, 线粒体和叶绿体与细胞分裂同步, 使数量加倍。其他的膜结合细胞器, 如内质网、高尔基体等要伸长并断成片段, 这样增加了均等分配的机会。12.2 细胞周期调控细胞周期的研究不仅是基础细胞生物学的重要研究课题,而且对于癌症的研究也有十分重要的意义，癌实际上是破坏了细胞分裂调控能力的一种疾病。2001年诺贝尔生理学与医学奖授予了美国科学家

19、利兰哈特韦尔和英国科学家蒂莫西亨特、保罗纳西，以表彰他们发现了细胞周期的关键调节机制。美国科学家利兰哈特韦尔和英国科学家蒂莫西亨特、保罗纳西在细胞周期调控研究中各自的贡献是什么？(美国科学家利兰哈特韦尔和英国科学家蒂莫西亨特、保罗纳西分享了2001年的生理学会医学诺贝尔奖，他们各自的贡献是什么？（答案） 答: 利兰哈特韦尔发现了“START”基因；保罗纳西的贡献是发现了CDK。蒂莫西亨特的贡献是发现了调节CDK的功能物质CYCLIN。)12.2.1 细胞周期调控概述从调控的观点来看, 细胞周期的调控操作就象一部全自动的洗衣机。洗衣机的基本操作是加水、洗涤、漂洗和甩干。洗衣机的这些基本循环同细胞

20、周期中的DNA复制、有丝分裂等的基本循环是相似的。在这两种情况下, 都是通过中央控制系统(central control system)控制的。在原理上, 洗衣机细胞周期的控制操作都象是一部定时器, 但实际上, 无论是洗衣机还是细胞周期, 它们都是根据在不同过程中的信息反馈来进行自我调节。在每一个过程中, 都是通过检测器的作用, 向控制中心发回信号（图12-3）。图12-3 细胞周期控制模拟系统细胞周期中的基本事件, 如DNA复制、有丝分裂、胞质分裂都是通过中央的细胞周期控制系统控制的。中央控制系统如同一个顺时钟移动的指针, 当它到达某一位置时触发一个反应。关于细胞周期调控的方式,早期有两种观

21、点, 一种是连锁反应,另一种是协同反应(图12-4)。 图12-4 细胞周期调控的两种模式骨牌代表细胞周期的基本事件，如DNA复制、染色体凝集、纺锤体形成等。（A）一个事件的发生触发下一个事件的发生；（B）一个事件的发生并不意味着下一个事件必然发生，但可作为下一个事件发生的起因，这要通过控制系统进行调节。（B）较（A）更为合理。12.2.2 蛋白激酶在细胞周期调控中的作用实际上, 细胞周期的控制系统是一个典型的生化操作装置, 这种装置是由一套相互作用的蛋白质组成, 正是这些蛋白质间的相互作用, 使细胞的组分加倍并进行再分配。 细胞周期调节因子的发现细胞周期的控制有两个主要事件，一个是对DNA复

22、制起始的控制，发生在G1期和 S期之间。第二个事件是对染色体凝集的控制，发生在G2期和M期之间。1970年，Colorado 大学的Potu Rao 和 Robert Johnson 通过一系列的细胞融合实验打开了认识细胞周期中这两个事件的大门。 DNA复制起始的控制因子首先他们将同步培养的G1期的Hela细胞同S期的Hela细胞进行融合,发现,G1期的细胞质受到S期细胞质的激活, 开始了DNA复制, 这一实验结果表明, 正在进行复制的细胞的细胞质中含有促进G1期细胞进行DNA复制的起始因子。与此相反, 他们将S期的细胞与G2期的细胞进行融合, 发现G2期的细胞核不能再启动DNA的复制, 这表

23、明, S期的细胞质中的DNA复制起始因子对于已进行了DNA复制的G2期的细胞核没有作用。 染色体早熟凝集将处于分裂期的细胞与处于细胞周期其他阶段的细胞融合, M期的细胞质总是能够诱导非有丝分裂的细胞中的染色质凝集（图12-5）, 这种现象称为染色体早熟凝集(premature chromosome condensation,PCC)。 图12-5 早熟染色体凝集实验将同步化培养的M期Hela细胞分别与间期不同阶段同步化的细胞融合，产生形态各异的早熟染色体。（a）M+G1;(b)M+S;(c)M+G2。什么是染色体早熟凝集实验？为什么同步化的M期细胞与其他时期的细胞融合，早熟凝集的染色体形态不同

24、？(什么是染色体早熟凝集实验？为什么同步化的M期细胞与其他时期的细胞融合，早熟凝集的染色体形态不同？（答案） 将处于分裂期的细胞（M期）与处于细胞周期其他时期（G1期、S期、G2期）的细胞融合, M期的细胞质总是能够诱导非有丝分裂的细胞中的染色质凝集, 将这种现象称为染色体早熟凝集(premature chromosome condensation,PCC)。由于G1期、S期和G2期细胞中染色质的复制状态不同, PCC的结果也不相同, 如与M期细胞融合的G1期的染色体为单线状, S期为粉末状, G2期染色体为双线。致于早熟凝集的染色体形态为什么不同，主要与各期DNA复制的状态有关：S期的细胞与

25、M期的细胞融合, 早熟的染色体呈粉末状, 原因是正在复制的DNA易受损伤,是DNA断裂的结果；而M期细胞与G1期细胞融合，出现细线状，是由于染色体还没有完全去凝集，DNA复制尚未开始。由于G2期DNA已经复制完全，所以与M期细胞融合呈现双线状。这些研究结果说明处于M期的细胞中一定有一种使染色体由松散状态凝聚成染色体的物质存在。) 成熟促进因子MPF(maturation promoting factor，MPF)的发现为了进一步研究促使G1期细胞DNA复制以及诱导细胞提前进入有丝分裂的调节因子的本质, 用蛙和无脊椎动物的卵母细胞及早期的胚进行了一系列的实验。(在研究促使G1期细胞DNA复制以及

26、诱导细胞提前进入有丝分裂的调节因子的本质时, 为什么选用蛙和无脊椎动物的卵母细胞及早期的胚进行注射实验？（答案） 答: 一些动物的受精卵特别适合作为细胞周期的研究材料, 因为这些卵细胞特别大, 如蛙的卵细胞的直径可达1 mm, 并且在受精后进行快速胚胎发育, 通过细胞周期进行分裂, 产生许多小细胞。在每个细胞周期之间,G1期和G2期很短, 或没有G1期和G2期, 但是都有S期和M期。在受精卵的发育过程中, 没有新基因的转录, 因为胚胎早期发育阶段所需的mRNA和大多数蛋白质都是在卵母细胞形成时就合成好了并被包装在成熟的卵细胞中。另外在早期的细胞分裂周期中,细胞也不会生长,所有的细胞都是通过对称

27、分裂形成两个小细胞。在细胞周期的特定阶段分离蛙的卵细胞, 并从蛙卵细胞中制备提取物。为了检测蛙卵提取物的生物活性,将它注射到非洲爪蟾的卵母细胞(未受精卵的不成熟的前体),观察这些提取物对细胞周期的影响。这种卵母细胞是检测提取物活性的良好系统, 因为这种细胞已经完成了DNA复制并正好停留在第一次有丝分裂的M期之前, 如果注射物具促分裂活性的话, 即可使注射的卵母细胞进入M期。因此卵母细胞所处的细胞周期阶段等于周期细胞的G2期。) 注射实验实验中，在细胞周期的特定阶段分离蛙的卵细胞, 并从蛙卵细胞中制备提取物。为了检测蛙卵提取物的生物活性,将它注射到非洲爪蟾的卵母细胞(未受精卵的不成熟的前体),观

28、察这些提取物对细胞周期的影响。发现注射来自M期卵细胞中的提取物, 可使卵母细胞进入M期。而用来自细胞周期其他阶段的提取物注射卵母细胞则不能诱导进入M期(图12-6), 这是首次发现在M期的细胞中有促进细胞分裂的因子存在, 由于当时对这种因子的化学本质和作用机制都不清楚, 只是简单地称为M-期促进因子(M-phase promoting factor, MPF),后来称为成熟促进因子。图12-6 MPF活性测试实验(a)用非洲爪蟾M期的卵细胞细胞提取物注射非洲爪蟾的卵母细胞,注射的细胞提取物驱使卵母细胞进入M期, 使核破裂, 并形成纺锤体。(b)用细胞间期的提取物注射卵母细胞, 不能驱使卵母细胞

29、进入M期。在研究促使G1期细胞DNA复制以及诱导细胞提前进入有丝分裂的调节因子的本质时, 为什么选用蛙和无脊椎动物的卵母细胞及早期的胚进行注射实验？(在研究促使G1期细胞DNA复制以及诱导细胞提前进入有丝分裂的调节因子的本质时, 为什么选用蛙和无脊椎动物的卵母细胞及早期的胚进行注射实验？（答案） 答: 一些动物的受精卵特别适合作为细胞周期的研究材料, 因为这些卵细胞特别大, 如蛙的卵细胞的直径可达1 mm, 并且在受精后进行快速胚胎发育, 通过细胞周期进行分裂, 产生许多小细胞。在每个细胞周期之间,G1期和G2期很短, 或没有G1期和G2期, 但是都有S期和M期。在受精卵的发育过程中, 没有新

30、基因的转录, 因为胚胎早期发育阶段所需的mRNA和大多数蛋白质都是在卵母细胞形成时就合成好了并被包装在成熟的卵细胞中。另外在早期的细胞分裂周期中,细胞也不会生长,所有的细胞都是通过对称分裂形成两个小细胞。在细胞周期的特定阶段分离蛙的卵细胞, 并从蛙卵细胞中制备提取物。为了检测蛙卵提取物的生物活性,将它注射到非洲爪蟾的卵母细胞(未受精卵的不成熟的前体),观察这些提取物对细胞周期的影响。这种卵母细胞是检测提取物活性的良好系统, 因为这种细胞已经完成了DNA复制并正好停留在第一次有丝分裂的M期之前, 如果注射物具促分裂活性的话, 即可使注射的卵母细胞进入M期。因此卵母细胞所处的细胞周期阶段等于周期细

31、胞的G2期。)虽然MPF首先发现于蛙的卵细胞, 但在所实验国的所有动物细胞中都发现了MPF, 说明这种因子是普遍存在的。 MPF的结构由于MPF的纯化工作困难,所以对它的纯化工作持续了好几年, 最后用柱层析纯化了MPF, 实际上MPF是两个不同的亚基组成的异质二聚体(图12-7), 一个是催化亚基, 它能够将磷酸基团从ATP转移到特定底物的丝氨酸和苏氨酸残基上, 这种蛋白激酶后来被称为周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases, Cdks);另一个亚基称作周期蛋白(cyclin)。图12-7 周期蛋白-Cdk复合的组成 细胞周期中MPF的浓度变化通

32、过注射实验还发现, MPF的活性在细胞周期中波动很大, 在有丝分裂前急剧升高, 但在有丝分裂后急剧下降直到零。由于MPF蛋白激酶亚基不能单独起作用, 它需要与细胞周期蛋白结合才有功能。周期蛋白浓度在细胞周期中是浮动的, 呈周期性变化。同样, MPF的活性与周期蛋白一样在细胞周期中呈现周期性变化(图12-8)。图12-8 在细胞周期中周期蛋白和MPF的波动(a) 蛙胚细胞发生同步分裂时, 早期发育的周期性变化。上部是有丝分裂和分裂间期的周期变化; 中间曲线是MPF活性的周期性变化; 下部曲线是控制MPF激酶相对活性的周期蛋白的浓度的周期性变化。(b)在酵母的一次细胞周期中MPF的活性和周期蛋白浓

33、度变化的对应关系。 注射实验的推论注射实验的结果表明：当细胞周期蛋白的浓度降低时, 蛋白激酶由于缺少与之结合的底物,而失活。当周期蛋白的浓度上升时, 蛋白激酶被激活, 促使细胞进入有丝分裂。因此推测：细胞周期的进程依赖于一种酶的激活, 而这种酶的惟一活性是使其他蛋白磷酸化;酶的活性受一种亚基的控制, 它的浓度在细胞周期的不同阶段是不同的。 周期蛋白的鉴定在海胆的早期胚细胞中第一次鉴定到与MPF结合的周期蛋白。实验中将同步化的受精的海胆卵培养在有放射性氨基酸的培养液中, 然后每10分钟取样一次、分离纯化蛋白质、凝胶电泳、放射自显影进行蛋白分析。发现, 经过几轮细胞周期之后, 放射性标记的蛋白质的

34、量稳定增加, 但是, 其中有一种蛋白峰在有丝分裂的早期特别高, 到了有丝分裂后期就急剧下降。然后在下一个细胞周期又慢慢积累直到有丝分裂前达到高峰。后来将这种蛋白命名为周期蛋白B(cyclin B)，通过基因工程技术从海胆中分离了周期蛋白B的cDNA克隆, 并通过抗体技术证明了非洲爪蟾中MPF的一个亚基的确是周期蛋白B。 遍在蛋白介导的有丝分裂周期蛋白的降解促使细胞退出有丝分裂 周期蛋白的结构特点有三种周期蛋白激发非洲爪蟾卵母细胞成熟: 周期蛋白A和两个结构相似的周期蛋白B。不同来源的编码周期蛋白的cDNA序列分析表明, 所有这些蛋白的氨基酸序列中, 靠近N端都有一个称为破坏框(destruct

35、ion box)的同源区(图12-9a)。有丝分裂周期蛋白在遍在蛋白介导下降解促使细胞退出有丝分裂（图12-9b）。图12-9 有丝分裂周期蛋白聚遍在蛋白化作用 遍在蛋白介导周期蛋白的降解有丝分裂周期蛋白合成之后, 就有遍在蛋白与之结合,然后通过遍在蛋白聚合作用(polyubiquitination)将周期蛋白进行标记以便蛋白酶体迅速降解。遍在蛋白如何介导周期蛋白的降解？(遍在蛋白如何介导周期蛋白的降解？（答案） 答:遍在蛋白加到周期蛋白上需要三种不同的酶介导。首先遍在蛋白在它的羧基端通过与遍在蛋白激活酶E1的半胱氨酸残基形成硫酯键而激活。然后遍在蛋白从E1转移到E2的半胱氨酸残基, E2称作

36、遍在蛋白结合酶(ubiquitin)。E2和第三种酶, 遍在蛋白连接酶(ubiquitin ligase, E3)一起将遍在蛋白转移到底物蛋白的赖氨酸残基（共价结合）, 在那里进行遍在蛋白的聚合化,最后作为蛋白酶体的降解底物, 被快速降解。 E3通常是一种复合体,由多亚基组成。例如从非洲爪蟾卵细胞中分离的周期蛋白B的E3至少含有8个不同的亚基。触发有丝分裂周期蛋白遍在蛋白聚合化的E3又称为后期促进复合物(anaphase-promoting complex,APC)。APC激发E2-遍在蛋白复合物同有丝分裂周期蛋白破坏框结合, 然后激发遍在蛋白同破坏框C-末端的赖氨酸残基结合，此过程不断循环使

37、遍在蛋白聚合化。通过基因操作构建了不含破坏框的周期蛋白, 这些蛋白不会被降解。) APC的活性调节控制周期蛋白B的降解在有丝分裂的后期末, 必须对周期蛋白进行快速降解，才能保证细胞顺利进入G1期。通过对周期蛋白B的研究，发现后期周期蛋白B的降解是通过对后期促进复合物(anaphase-promoting complex,APC)活性的控制进行调节的。从阻断在中期的非洲爪蟾卵细胞中分离的APC对于激发周期蛋白B的遍在蛋白聚合化的活性很低。相反,从具有正常细胞周期的非洲爪蟾的卵细胞中分离的APC具有较高的激发遍在蛋白聚合化的活性。具有较高活性的APC复合物中有几个亚基是被磷酸化的。用磷酸酶除去AP

38、C中磷酸化位点的磷酸基团, 会降低APC的活性。图12-10是活性调节及其在细胞周期后期促使周期蛋白B降解的作用模型。图12-10 周期细胞中有丝分裂周期蛋白水平的调节 细胞怎样通过对APC的活性调节控制周期蛋白B的降解？(APC的活性调节及在周期蛋白B降解中的作用如何？（答案） 答: 当MPF的 活性在有丝分裂中期达到最高峰时, 它将APC磷酸化并将其激活。被激活的APC与E2结合, 最后结合到周期蛋白B的破坏框中, 促使周期蛋白B的进行遍在蛋白多聚化, 其结果导致周期蛋白B降解。由于周期蛋白B是MPF的一个必需亚基, 它的降解势必导致MPF活性降低甚至失活, 触发细胞进入有丝分裂末期。胞质

39、分裂之后, 周期蛋白B在子细胞的间期合成, APC的活性保持到G1期的后期, 被G1 Cdk失活。周期蛋白B的浓度不断升高,同时提高MPF的活性, 以便进入下一个有丝分裂期。) 真核生物细胞周期调控的一般模型在发现MPF后的一、二十年中, 细胞周期调控一直集中在对MPF样(MPF-like)酶的研究, 这类酶称为周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases, Cdks)，主要功能是控制细胞周期的活性; 研究的生物也从蛙卵母细胞和胚胎转向酵母和培养的哺乳动物细胞。图12-11是真核细胞周期调控的现代模型。 三类周期蛋白-Cdk复合物真核细胞主要通过三类

40、周期蛋白-Cdk复合物的作用，控制细胞周期, 这三种复合物分别是:G1期、S期和有丝分裂Cdk复合物。当细胞被激活进行复制时, 首先是G1 Cdk复合物进行表达。准备进入S期的细胞通过激活转录因子,引起DNA复制所需酶类以及编码S期Cdk复合物的基因表达。S期Cdk的活性开始被一种特殊抑制物所抑制, 而在G1期的后期, G1 Cdk复合物诱导S期Cdk抑制物的降解, 释放出有活性的S期Cdk复合物,这种复合物能够激发细胞进入S期。 图12-11 真核生物细胞周期调控模型 细胞周期分别被G1、S-期、有丝分裂依赖性的蛋白激酶(CdkCs)控制。这些激酶都是由周期蛋白依赖性的蛋白激酶和周期蛋白两个

41、亚基组成的复合物。在Cdc34途径和APC途径中,蛋白复合物都是通过遍在蛋白的蛋白酶体将一些特殊的底物, 包括S期抑制物、后期抑制物、以及有丝分裂周期蛋白降解进行周期调节。因此这些蛋白驱使细胞周期沿一个方向进行, 因为这些降解作用是不可逆转的。后期抑制物的蛋白酶解使得姐妹染色单体分开, 细胞进入有丝分裂的末期。 细胞周期中三个关键的过渡细胞周期中三个关键的过渡,即G1期S期、中期后期、后期末期及胞质分裂期的过渡。这些过渡都是通过触发蛋白质的降解进行的, 所以都是不可逆转的, 这样迫使细胞周期只能沿一个方向进行。三个过渡分别是通过Cdc34和APC途径的降解作用完成的。真核细胞周期调控模型的主要

42、特点和机制是什么？(真核细胞周期调控模型的主要特点和机制是什么？（答案） 答: 特点表现在三类周期蛋白-Cdk复合物和三个关键的过渡和对细胞周期的控制。细胞周期中三个关键的过渡细胞周期中三个关键的过渡,即G1期S期、中期后期、后期末期及胞质分裂期是细胞周期中三个关键过渡。这三个过渡分别被Cdc34途径和APC途径控制。三类周期蛋白-Cdk复合物真核细胞主要通过三类周期蛋白-Cdk复合物的作用，控制细胞周期, 这三种复合物分别是:G1期、S期和有丝分裂Cdk复合物。这些复合物都是由周期蛋白依赖性的蛋白激酶和周期蛋白两个亚基组成的复合物。在Cdc34途径和APC途径中,蛋白复合物都是通过遍在蛋白的

43、蛋白酶体将一些特殊的底物, 包括S期抑制物、后期抑制物、以及有丝分裂周期蛋白降解进行周期调节。细胞周期中三个关键的过渡细胞周期中三个关键的过渡,即G1期S期、中期后期、后期末期及胞质分裂期的过渡。这些过渡都是通过触发蛋白质的降解进行的, 所以都是不可逆转的, 这样迫使细胞周期只能沿一个方向进行。三个过渡分别是通过Cdc34和APC途径的降解作用完成的。Cdc34途径促使细胞从G1S期过渡：在G1期的早、中期，在DNA的复制起点就装配了复制起始复合物，并且开始了S期的CdkC组份的转录；但是，S期CdkC抑制物被G1 CdkC磷酸化而激活，激活的S期CdkC抑制物抑制了S期CdkC的活性，从而使

44、细胞停留在G1期。在G1期的后期, Cdc34诱导S期Cdk抑制物的降解, 释放出有活性的S期Cdk复合物,这种复合物能够激发细胞进入S期。一旦S期Cdk的降解作用被激活, S-期Cdk复合物将与DNA形成预复制复合物中的蛋白质的调节位点磷酸化,预复制起始复合物是G1期在DNA复制起点上装配的复合物。这些被S-期Cdk复合物磷酸化的蛋白质不仅能够激活DNA复制起始, 还能够阻止新的预复制复合物的装配。由于这种抑制作用, 每条染色体在细胞周期中只复制一次, 保证了合适的分配到子细胞中的染色体数。有丝分裂Cdk复合物是在S期和G2期合成的, 但是它们的活性一直受到抑制直到DNA合成完毕。一旦被激活

45、, 有丝分裂Cdk复合物就会诱导染色体凝聚、核膜解体、有丝分裂器的装配以及凝聚的染色体在中期赤道板上排列。在所有凝聚的染色体都与适当的纺锤体微管结合之后,有丝分裂Cdk复合物激活后期启动复合物(anaphase promoting complex, APC)。这种多蛋白的复合物指导后期抑制物通过遍在蛋白介导的蛋白酶解作用进行降解, 导致在中期将姐妹染色单体结合在一起的蛋白复合物失活。因此这些抑制物的降解作用, 允许有丝分裂进入到后期。在后期末, APC也可指导有丝分裂周期蛋白的蛋白酶体的降解。有丝分裂Cdk活性的降低, 使得分离的姐妹染色单体去凝聚、核膜重新形成、在胞质分裂中细胞质的分裂, 最

46、后形成子细胞。)12.2.3 裂殖酵母的细胞周期调控裂殖酵母是低等真核生物, 有完整的细胞周期(图12-12), 通过对裂殖酵母(S.pombe)的研究, 对细胞周期的控制有了更深的了解。图12-12 裂殖酵母的细胞周期 酵母的细胞周期基因突变裂殖酵母是研究细胞周期的极好材料, 因为酵母中与细胞周期相关基因的突变很容易被识别: 如细胞的温度敏感突变, 如果是非允许范围内的温度敏感突变, 就会影响细胞的长度。已经分离很多这种与细胞周期相关的温度敏感突变型, 可分成两类：一类是cdc突变, 这类突变在非允许的温度下培养, 会滞留在细胞周期的某个阶段, 结果会形成特别长的细胞, 因为这种突变不能进入

47、有丝分裂，滞留在间期, 所以能够继续生长。另一类称为wee突变, 这种突变长得特别小而不能分裂。 裂殖酵母cdc基因突变裂殖酵母中几个温度敏感的cdc基因的隐性突变使得裂殖酵母在周期中不能进入M期,由于生长没有停止, 所以比正常的酵母长很多(图12-13)。这些基因中的一个显性突变, 命名为cdc2,使得酵母出现wee表型。一般来说, 隐形表型是因为缺少野生型的功能蛋白所致, 而显性表型是因为增加了一些蛋白功能,导致调节失常。图12-13 裂殖酵母cdc2突变的表型cdc2+是野生型, 正常分裂; cdc2-是隐性突变, 产生特长的表型, cdcD是显性突变, 产生wee表型,即因细胞特小不能

48、分裂。对分离的突变体的研究发现, 没有Cdc2的活性,细胞不能进入有丝分裂。这表明Cdc2是裂殖酵母进入有丝分裂的一个关键调节因子。通过基因工程克隆到cdc2-基因, 序列分析表明该基因编码一个分子量为34kDa的蛋白, 与真核生物的蛋白激酶同源, 该Cdc2蛋白又称为p34cdc2 蛋白。 裂殖酵母的MPF后来从裂殖酵母中分离了另一个cdc基因, 命名为cdc13+,该基因的产物也是裂殖酵母进入有丝分裂必需的；序列分析表明该基因编码的蛋白质与非洲爪蟾和海胆的周期蛋白B同源。进一步研究发现Cdc13和Cdc2蛋白能够形成异质二聚体, 并且具有蛋白激酶的活性。另外还发现这种蛋白激酶的活性随裂殖酵

49、母的周期变化而变化, Cdc13的浓度也随Cdc2的活性波动而波动。这些结构表明, 裂殖酵母的Cdc2-Cdc13相当于非洲爪蟾的MPF。裂殖酵母的MPF的化学本质是什么？是如何发现的？(裂殖酵母的MPF的化学本质是什么？是如何发现的？（答案） 答: 裂殖酵母油MPF是一种复合物，由Cdc2和Cdc13两种蛋白组成，其中Cdc2是一种蛋白激酶，Cdc13是周期蛋白。主要是通过对裂殖酵母温度敏感突变的研究发现了编码这两种蛋白的基因。裂殖酵母中几个温度敏感的cdc基因的隐性突变使得裂殖酵母在周期中不能进入M期,由于生长没有停止, 所以比正常的酵母长很多。这些基因中的一个显性突变, 命名为cdc2,

50、使得酵母出现wee表型（小而不分裂）。一般来说, 隐形表型是因为缺少野生型的功能蛋白所致, 而显性表型是因为增加了一些蛋白功能,导致调节失常。对分离的突变体的研究发现, 没有Cdc2的活性,细胞不能进入有丝分裂。这表明Cdc2是裂殖酵母进入有丝分裂的一个关键调节因子。通过基因工程克隆到cdc2-基因, 序列分析表明该基因编码一个分子量为34kDa的蛋白, 与真核生物的蛋白激酶同源, 该蛋白又称为p34cdc2 蛋白。后来从裂殖酵母中分离了另一个cdc基因, 命名为cdc13+,该基因的产物也是裂殖酵母进入有丝分裂必需的；序列分析表明该基因编码的蛋白质与非洲爪蟾和海胆的周期蛋白B同源。进一步研究

51、发现Cdc13和Cdc2蛋白能够形成异质二聚体, 并且具有蛋白激酶的活性。另外还发现这种蛋白激酶的活性随裂殖酵母的周期变化而变化, Cdc13的浓度也随Cdc2的活性波动而波动。这些结构表明, 裂殖酵母的Cdc2-Cdc13相当于非洲爪蟾的MPF。) 裂殖酵母的MPF活性调节 cdc25和wee1基因的突变对裂殖酵母表型和MPF活性的影响通过对其他一些cdc和wee突变体的研究, 发现裂殖酵母的MPF的活性受其他一些基因编码产物的影响。如温度敏感突变体cdc25-在非允许的温度下也不能进入有丝分裂, 另一方面, Cdc25的超表达,将会缩短G2期,使未成熟的酵母提前进入有丝分裂期。另一种突变体

52、wee1- 也会造成酵母体积不够大就提前进入有丝分裂, 而Wee1蛋白的过量表达则延长G2期,形成长的酵母细胞( 图12-14)。根据这些发现, 推测Cdc25蛋白激活裂殖酵母的MPF的活性, 而Wee1蛋白抑制裂殖酵母的MPF活性。图12-14 cdc25和wee1基因的突变对裂殖酵母表型和MPF活性的影响(a) Cdc25缺少或Wee1活性的细胞产生相反的表型;(b)Cdc25和Wee1对裂殖酵母MPF活性的影响。 裂殖酵母中MPF活性的调节进一步的研究发现裂殖酵母MPF的活性调节是相当复杂的, 涉及多种蛋白激酶以及Cdc2亚基上两个位点的磷酸化与去磷酸化（图12-15）。图12-15 裂

53、殖酵母中MPF活性调节裂殖酵母中MPF活性的活性是如何调节的？(裂殖酵母中MPF活性的活性是如何调节的？（答案） 答: 裂殖酵母MPF的活性调节是相当复杂的, 涉及多种蛋白激酶以及Cdc2亚基上两个位点的磷酸化与去磷酸化。p34cdc2蛋白单亚基上有两个磷酸化的位点, 一个是激活型的磷酸化位点, 另一个是抑制型的磷酸化位点。独立存在的p34cdc2 蛋白激酶是无活性的, 同周期蛋白Cdc13结合后,仍然没有活性, 但此时的复合物成为两种蛋白激酶的底物, 一种是Weel激酶, 它使p34cdc2亚基上的抑制位点Tyr-15位残基磷酸化, 抑制MPF的活性。第二种蛋白激酶是Cdc2激活蛋白激酶(C

54、dc2-activating kinase, CAK), 可以使Cdc2亚基中激活型的位点Thr-161(T-161)残基磷酸化, 这种磷酸化最大限度地激活了MPF的活性, 但是, 只要Tyr-15(Y-15)位残基是磷酸化的,Cdc2-周期蛋白复合物就没有活性。这种无活性的MPF称为前MPF(Pre-MPF)。要使MPF具有活性，需要Cdc25蛋白的作用, 该蛋白具有蛋白磷酸酶的活性,能够将酪氨酸残基上的磷酸基团去除从而将MPF激活, 诱导细胞从G2进入M期。不过，Wee1和Cdc25是相互竞争的，如果细胞生长得不够大，Wee1的活性就强，有利于MPF的磷酸化，若细胞生长得够大，就有利于脱磷

55、酸，促进细胞进入M期。)12.2.4 芽殖酵母的细胞周期调控芽殖酵母(S.cerevisiae)是以出芽的方式进行增殖的(图12-16)。 图12-16 芽殖酵母的出芽 (a)处于细胞周期不同阶段的出芽酵母的电镜照片; (b)芽殖酵母细胞周期的主要过程。通过出芽形成的子细胞比母细胞小得多, 它必须长到足够大才能进行分裂。当芽殖酵母在G1期生长到足够大时（到达某一点）, 一些可导致进入S期的基因进行程序表达，使细胞进入S期。通常将芽殖酵母在G1期发动细胞周期的点称为起点(START)。 芽殖酵母的Cdc28蛋白(Cdc 28 protein)在芽殖酵母中有一个基因命名为CDC28, 编码Cdc2

56、8蛋白, 该基因的功能相当于裂殖酵母的CDC2。 S期促进因子(S phase-promoting factor,SPF)芽殖酵母含有S期促进因子, 它能够将DNA合成所需的蛋白质磷酸化并进行调节。与MPF相似的是, SPF也是异质二聚体, 一个是Cdc28, 另一个是在G1期起作用的周期蛋白。芽殖酵母中有三种G1周期蛋白:Cln1、Cln2和Cln3。前两个主要在突变体中起作用，是通过温度敏感突变发现的，最后一个在野生型细胞中起作用。请设计一个实验分离芽殖酵母G1周期蛋白，并说明其原理。(请设计一个实验分离芽殖酵母G1周期蛋白，并说明其原理。（答案） 播放动画 答: 为了鉴定芽殖酵母的G1期

57、周期蛋白，首先要获得芽殖酵母cdc28基因的温度敏感突变体, 这样，当该G1周期蛋白基因高水平表达时, 能够抑制某些温度敏感性cdc28突变体。这种方法的基本原理是:某些cdc28突变体可以是温度敏感的, 这样, 在非允许温度下突变的Cdc28蛋白与G1周期蛋白的亲和力就低。在这种情况下, 如果G1周期蛋白的浓度足够高, 它能够与突变的Cdc28蛋白形成足够的SPF,促使细胞在非允许温度下进入S期。科学家通过基因工程手段分离到两个G1周期蛋白基因:CLN1和CLN2, 它们能够按预测的方式抑制cdc28突变(图12-17)。后来, 科学家用又分离鉴定了一个显性的G1周期蛋白基因: CLN3,是在野生型细胞中起作用的周期蛋白基因。(a) 野生型细胞能够产生高亲和力的Cdc28蛋白, 这种蛋白在25和36下与G1周期蛋白结合形成SPF。(b) 某些cdc28ts突变体表达的Cdc28蛋白与G1周期蛋白的亲和力低, 在允许温度(25)能够形成足够的Cdc28ts-G1周期蛋白(SPF),能把生长并形成菌落; 但是在非允许温度(36),不会形成SPF,不会形成菌落。(c)用从芽殖酵母基因库的高拷贝克隆载体转化cdc28ts 细胞,