酶工程制药pa课件

1、2021-7-16酶工程制药pa1 2021-7-16酶工程制药pa2 一、酶工程简介（Enzyme Engineering） 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合，发展而形 成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究 酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原 料转化成有用物质的技术。 酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指自然 酶制剂在工业上的规模应用。 1953年，Grubhoger 和 Schleith 提出了酶固定化技 术。 1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主 要内容： 酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固 定

2、化的反应器、酶和固定化酶的应用。 第一节 概 述 2021-7-16酶工程制药pa3 现代酶工程的主要内容： a. 酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发； b. 酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、 反应监测； c. 酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究； d. 酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究； e. 有机相中酶反应的研究； f. 酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； g. 抗体酶、核酸酶的研究； h. 模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。 2021-7-16酶工程制药pa4 二、酶的来源和生产商 1、酶的来源：酶的生产目前只宜直接从生物体中提取

3、分离。 早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、 菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近10年来，研究发展了动植物 组织培养技术，但周期长、成本高。工业生产一般都以微 生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶，大多数是微 生物生产的。其特点是： A. 微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都从微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都从 微生物中得到；微生物中得到； B. 微生物繁殖快，生产周期端，培养简便，并可通过控制微生物繁殖快，生产周期端，培养简便，并可通过控制 培养条件来提高酶的产量；培养条件来提高酶的产量； C. 微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，微生物具有较强的适

4、应性，通过各种遗传变异的手段， 能培育出新的高产菌株。能培育出新的高产菌株。 2021-7-16酶工程制药pa5 二、酶的来源和生产商 2、酶的生产菌 对菌种的要求： a a、产酶量高、酶的性质符合使用要求，而且最好是、产酶量高、酶的性质符合使用要求，而且最好是 产生胞外酶的菌；产生胞外酶的菌； b b、不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不、不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不 产生毒素；产生毒素； c c、稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；、稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体； d d、能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。、能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。 2021

5、-7-16酶工程制药pa6 生产菌的来源： a a、菌种保藏机构和有关研究部门获得。、菌种保藏机构和有关研究部门获得。 b b、大量要从自然界中分离筛选；自然界是产酶菌种、大量要从自然界中分离筛选；自然界是产酶菌种 的主要来源，土壤，深海，温泉，火山，森林等的主要来源，土壤，深海，温泉，火山，森林等 都是菌种采集地。都是菌种采集地。 筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛，纯化，筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛，纯化， 复筛和生产性能检定等。复筛和生产性能检定等。 菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变，基菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变，基 因转移和基因克隆。因转移和基因

6、克隆。 2021-7-16酶工程制药pa7 目前常用的产酶微生物 A、E.coil：是应用最广泛的产霉菌。分泌胞内酶，：是应用最广泛的产霉菌。分泌胞内酶， 经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸 脱羧酶，天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、脱羧酶，天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳半乳 糖苷酶。糖苷酶。 B、枯草杆菌：主要用于生产、枯草杆菌：主要用于生产-淀粉酶、淀粉酶、 -葡萄葡萄 糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。 C、啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包、啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包 等。等。 D、曲酶（黑曲霉和黄曲霉）

7、：主要生产糖化酶、曲酶（黑曲霉和黄曲霉）：主要生产糖化酶、 蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰 化酶和脂肪酶。化酶和脂肪酶。 E、其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉、其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉 菌等。菌等。 2021-7-16酶工程制药pa8 第二节 酶和细胞的固定化 2021-7-16酶工程制药pa9 指限制或固定于特定空间位置的酶，具 体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶 变成不易随水流失即运动受到限制，而又能 发挥催化作用的酶制剂，制备固定化酶的过 程称为酶的固定化。 2021-7-16酶工程制药pa10 202

8、1-7-16酶工程制药pa11 可以在较长时间内多次使用，而且在多数情况下， 酶的稳定性提高。 2. 反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残 留 酶，易于纯化，产品质量高。 3. 反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和 自 动化控制。 4. 酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用 酶 量减少。 5. 比水溶性酶更适合于多酶反应。 优点; 2021-7-16酶工程制药pa12 缺点： 固定化时，酶活力有损失。 增加了生产成本，工厂初始投资大。 只能用于可溶性底物，而且较适合于小分子底物 ，对大分子底物不适宜。 4. 胞内酶必须经过酶的分离纯化过程。 5. 与完整菌体相比不适宜用于多酶

9、反应，特别是需 要 辅助因子的反应。 2021-7-16酶工程制药pa13 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 微囊型 胶囊型 2021-7-16酶工程制药pa14 用物理方法将酶吸附于不溶性载体的一种固定方法 此类载体很多。 无机载体：活性炭、多孔玻璃、酸性白土、 漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷 灰石、等。 天然高分子载体：淀粉、谷蛋白、纤维素等 2021-7-16酶工程制药pa15 2021-7-16酶工程制药pa16 优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载 体；固定化过程可与纯化过程同时实现；酶失活后载 体仍可再生。 缺点：吸附酶量无规律可循，对不同载体和不同酶 的吸

10、附条件不同，吸附量与酶活力不一定呈平行关系； 酶与载体之间结合力不强，酶易于脱落，导致酶活力 下降并污染产物 2021-7-16酶工程制药pa17 离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交 换的水不溶性载体上的固定化方法，此法的载体有 多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂，如 DEAE-纤维素。 2021-7-16酶工程制药pa18 优点：操作简单、处理条件温和，酶的高级结构 和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活 回收率较高的固定化酶。 缺点：载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液 种类或pH的影响，在离子强度高的强度下进行反 应时，往往会发生酶从载体上脱落的现象。 2021-7-1

11、6酶工程制药pa19 酶分子 含有离子交换基团的固相载体 第一个离子结合法固定化酶 DEAECellulose 固定化过氧化酶 第一个工业化的固定化酶 DEAESephadex A-50 固定化氨基酰化酶 2021-7-16酶工程制药pa20 共价结合法使酶以共价结合于载体上的固定化 方法。也就是使酶分子上非活性部位功能团与载体 表面活泼基团之间发生化学反应而形成共价键的连 接方法。它是研究最广泛、内容最丰富的固定化方 法。 2021-7-16酶工程制药pa21 优点： 酶与载体结合牢固，稳定性好，一般不会因底物浓 度高或存在盐类等原因而轻易脱落。 缺点： 反应条件苛刻，操作复杂，而且由于采用

12、了比较强 烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构的变化，破 坏部分活性中心，所以往往不能得到比活高的固定 化酶，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。 2021-7-16酶工程制药pa22 交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微 生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。交联法 与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不 同的是它不使用载体。 2021-7-16酶工程制药pa23 2021-7-16酶工程制药pa24 交联法的反应条件比较激烈，固定化酶的酶活 回收率一般比较低，但是尽可能降低交联剂的浓度 和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。一 般用交联法所得到的固定化酶颗粒小、结构性能差

13、、酶活性低，故常与吸附法或包埋法联合使用。 如：先用明胶包埋，在用戊二醛交联。 2021-7-16酶工程制药pa25 双功能试剂： 常用的是戊二醛 第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间 交联的固定化酶 2021-7-16酶工程制药pa26 2021-7-16酶工程制药pa27 2021-7-16酶工程制药pa28 2021-7-16酶工程制药pa29 2021-7-16酶工程制药pa30 2021-7-16酶工程制药pa31 2021-7-16酶工程制药pa32 包埋法可分为网格型和微囊型两种。将酶或细胞包 埋在高分子凝胶细微网格中的称为网络型，将酶或 细胞包埋在高分子半透膜中的称为微

14、囊型。 适于：小分子的底物和酶 2021-7-16酶工程制药pa33 2021-7-16酶工程制药pa34 首先被采用的胶格包埋法是 Enzyme+N，N-甲叉双丙稀酰胺，丙烯酰胺引发剂 -inactiation 2021-7-16酶工程制药pa35 包埋法制备固定化酶的条件温和，不改变酶的结构， 操作时保护剂及稳定剂均不影响酶的包埋率，适用 于多种酶、粗酶制剂、细胞器和细胞的固定化。 2021-7-16酶工程制药pa36 2021-7-16酶工程制药pa37 2021-7-16酶工程制药pa38 1、固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细 胞固定化技术，被限制或定位于特

15、定空间位置的细胞 称为固定化细胞，它与固定化酶同被称为固定化生物 催化剂。细胞固定化技术是酶固定化技术的发展，因 此固定化细胞也成为第二代固定化酶技术的发展，因 此固定化细胞也称为第二代固定化酶。固定化细胞主 要是利用细胞内酶和酶系，比固定化酶应用普遍。 四、固定化细胞的制备 2021-7-16酶工程制药pa39 2、固定化细胞的特点 2021-7-16酶工程制药pa40 3、固定化细胞的制备技术 载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性 载体相结合。载体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换 纤维素、聚氯乙烯。 ：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞 的生长及酶活性。 ：吸附容量小结合强度低。 包埋法制备技术：与包埋法相同。 交联法