血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离电液 黎振威_第1页
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文档简介

1、 实验操作 （1）凝胶处理 l 将sephadex g-25凝胶干粉放入过量水中浸泡24h或沸 水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾 去上层细粒悬液，如此反复多次。 （2）层析柱的预备 用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程中不能使 用毛刷，以免擦伤层析柱子内壁，影响层析分离效果。固 定好层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密封 性。将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出 口的聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气 泡，待气泡排出后，使溶液在底部留至35cm高既可关闭 出水口。 柱层析示意图 3）装柱 将处理好的凝胶在烧杯内用1倍提及的洗脱液搅拌成悬浮液，

2、自柱 顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积至5cm左右时，缓缓打开 低端出口管，随之继续缓慢添加凝胶悬浮液直至凝胶体积沉积至25cm高 度为止。操作中注意防止气泡与节痕产生。 v（5）加样与洗脱。 打开平衡好的层析柱低端出口， 使柱内溶液流向与床表面相切时关闭出口。将吸有 0.5ml样品的加样滴灌在床表面上1mm处沿管内壁 轻轻转动加样，加完后，打开底端出口使样品流至 床表面，关闭出口，用少量洗脱液同样小心清洗管 内壁12次，使样品流至床表面，然后加洗脱液加 至距床表面23cm高，接上高位贮液瓶并调好流速 即开始洗脱。注意在加样和洗脱过程中应缓慢加入 液体，防止冲坏床表面，影响分辨率。 v（6）收集与测定。 收集时可使用自动部分收集器 或手工操作，每管接洗脱液3ml.直至第二个洗脱峰 降至基线附近。收集后用721E型分光光度计在 451nm波长处以洗脱液为空白，对每管收集液进行 光吸收

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