紫外可见分光光度计基本知识

1、北京普析通用仪器有限责任公司 Beijing Purkinje General Instrument Co.,Ltd. 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 基本知识基本知识 紫外-可见吸收光谱 朗伯-比耳定律 紫外-可见分光光度计 分析条件的选择 测定方法 紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS) 按所吸收光的波长区域不同，分为紫 外分光光度法和可见分光光度法，合称为 紫外-可见分光光度法。 它是利用物质的分子或离子对某一波 长范围的光的吸收作用，对物质进行定性定性 分析分析、定量分析定量分析及结构分析结构分析, 所依

2、据的光 谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的 光而产生的吸收光谱。 1 与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和仪器设备和 操作都比较简单，费用少，分析速度快操作都比较简单，费用少，分析速度快; 2 灵敏度高灵敏度高; 3 选择性好选择性好; 4 精密度和准确度较高精密度和准确度较高; 5 用途广泛用途广泛。 物质对光光的吸收是选择性选择性的，利用 被测物质对某波长的光的吸收来了解物 质的特性，这就是光谱法的基础光谱法的基础。 通过测定被测物质对不同波长的光的吸 收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光 度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范 围的吸收曲线吸收曲线。 在吸收曲线中，通常选用最大吸收波

3、长 max进行物质含量的测定。 2. 溶剂 注意如下几点： （1）尽量选用低极性溶剂； （2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶 液具有良好的化学和光化学稳定性； （3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。 3. pH值 设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透 射光强度为 It，反射光强度为Ir，则 I0= Ia+ It+ Ir 由于反射光强度很弱，其影响很小，上式 可简化为： I0= Ia+ It 一、吸光度和透光度一、吸光度和透光度 透光度：透光度：透光度为透过光的强度It与入射光 强度I0之比，用T表示： 即 T= It/I0 三、吸光系数三、吸光系数 当l以cm，c以g/L为单位，称为吸

4、光吸光 系数系数，用 a表示。 A= a cl a的单位为L/(g.cm) 当l以cm，c以mol/L为单位，称为 摩尔吸光系数摩尔吸光系数，用 表示。 的单位为的单位为L/mol.cm，它表示物质的，它表示物质的 浓度为浓度为1mol/L，液层厚度为，液层厚度为1cm时，溶时，溶 液的吸光度液的吸光度。 摩尔吸光系数 比吸光系数 比吸光系数是指百分含量为1%， l为1cm 时的吸光度值，用 表示。 %1 1cm E %1 1 1 . 0 cmr EM 四、偏离朗伯-比耳定律的因素 （1）入射光为非单色光）入射光为非单色光 （3）光程的不一致性。）光程的不一致性。 光源不是点光源，比色皿光径长

5、度不一 致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均 造成光径不一致，从而与定律偏离。 （2）溶液的不均性。）溶液的不均性。 实际样品的混浊，加入的保护胶体， 蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发 射等，均可吸光质点的吸光特性变化大。 在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源热辐射光源和气体放电光源 1 光源 热辐射光源用于可见光区，如钨灯和 卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。 单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭 缝、色散元件和准直镜等部分。 2 单色器 单色器质量的优劣，主要决定于 色散元件的质量。色散元件常用棱镜棱镜 和光栅和光栅。 吸收池又称比色皿或

6、比色杯，按材 料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前 者不能用于紫外区。 3 吸收池 吸收池的种类很多，其光径可在 0.110cm之间，其中以1cm光径吸收池 最为常用。 4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将 光信号转变为电信号。现今使用的分光 光度计大多采用光电管或光电倍增管作 为检测器。 5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计， 电位调节指零装置，以及自动记录和数 字显示装置等。 二、紫外-可见分光光度计的类型 按其光学系统可分为单波长分光光 度计和双波长分光光度计。 1.单波长单光束分光光度计 2.单波长双光束分光光度计 3.双波长分光光度计 代入朗伯-比尔定律有： c/c=

7、0.4343T/TlgT 要使测定的相对误差c/c最小最小，求导取 极小得出： lgT=-0.4343=A 即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小时，吸光度测量误差最小。 最适宜的测量范围为0.20.8之间。 2.入射光波长的选择 3.狭缝宽度的选择 为了选择合适的狭缝宽度，应以减少 狭缝宽度时试样的吸光度不再增加吸光度不再增加为准。 一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰 半宽度的十分之一。 对多种物质进行测定，常利用显色反 应将被测组分转变为在一定波长范围有吸 收的物质。常见的显色反应有配位反应、 氧化还原反应等。 这些显色反应，必须满足以下条件： 4.反应生成物的组成恒定。 3. 反应生

8、成的产物有足够的稳定性足够的稳定性，以保 证测量过程中溶液的吸光度不变； 2反应有较高的选择性较高的选择性，即被测组分生成 的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光 谱有明显的差别； 1反应的生成物必须在紫外紫外-可见光区可见光区有较较 强强的吸光能力吸光能力，即摩尔吸光系数较大； 测定试样溶液的吸光度，需先用 参比溶液调节透光度（吸光度为0）为 100%，以消除其它成分及吸光池和溶消除其它成分及吸光池和溶 剂等对光的反射和吸收带来的测定误剂等对光的反射和吸收带来的测定误 差差。 参比溶液的选择视分析体系而定，具体有： 1溶剂参比溶剂参比 试样简单、共存其它成分 对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与

9、吸消除溶剂与吸 收池收池等因素； 2试样参比试样参比 如果试样基体溶液在测 定波长有吸收，而显色剂不与试样基体 显色时，可按与显色反应相同的条件处 理试样，只是不加入显色剂。 3试剂参比试剂参比 如果显色剂或其它试剂在 测定波长有吸收，按显色反应相同的条 件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂 作为参比溶液。 4. 平行操作参比平行操作参比 用不含被测组分的试 样，在相同的条件下与被测试样同时进 行处理，由此得到平行操作参比溶液。 一、 单组分定量方法 单组分是指样品溶液中含有一种组 分，或者是在混合物溶液中待测组分的 吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。 其定量方法包括校准曲线法校准曲线法、标准

10、对 比法和吸收系数法。 1 校准曲线法 方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选 用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列 标准溶液的吸光度，作A-c曲线曲线，即标准曲 线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方回归方 程程。 在相同条件下测定未知试样的吸光度， 从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试 样的浓度。 2 标准对比法 即将待测溶液与某一标样溶液，在相 同的条件下，测定各自的吸光度，建立 朗伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度 与含量。 As=Kcs Ax=Kcx s xs x A Ac c 先用标准样品扫描谱图，在扫待测样品 的谱图。拿两者进行比较，可进行定性。但 此方法误差 比较大。 2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方 便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用 A280/A260或A230/A260的比值，鉴定其纯度。 蛋白质浓度蛋白质浓度1552A280757.3A260(ug/ml) DNA浓度浓度62.9A26036.0A280(ug/ml) 蛋白质浓度蛋白质浓度183.0A23075.8A260(ug/ml) DNA浓度浓度49.1A2603.48A230(ug/ml) 3.结构分析 紫外