宏基因组测序技术检测方法

1、宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基 因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群 结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新 的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新 的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建 克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境 中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对 16s dna/18sdna/its 测序和针对宏基因

2、组全序列的测序研究。下面就是对这两者 的具体介绍。一、16s dna/18s dna/its 测序16sdna 是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，通过对样品中 16sdna 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。 目前，普遍使用 roche 454 平台来对环境样品进行 16s dna 测序。因为 16s dna 序列比较相似，读长短 的话，难以进行有效的比对，而 454 平台的平均读长在 400bp 左右，可以很好 的避免此类问题。二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整 体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基 因

3、以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基 因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外， 该项测序不单可以针对 dna 水平，也可以针对全 rna 进行基因表达水平的研 究。样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。 样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品 如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。 核酸提取后用 nanodrop nd-1000 测定，260/280 = 1

4、.8-2.0 ， 260/230 = 1.8-2.0， 电泳检测 dna 应是完整的一条带。测序 sequencing1) 16s/18s 测序：sanger 测序：用于低通量的 16s/18s dna 测序，提取宏基因组后，首先通过 pcr 将 16s/18s 序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑 筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用 abi 3130 或 abi 3730 进行毛细管电泳测序。由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现通常用做二代测序结果的验 证。454 platform ：454 平台主要包括两种测序系统： 454

5、 gs flx+ system 和 454 gs junior system 。 454 gs flx+ system 测序读长可以达到 600-1000bp ，通量 450-700m，gs junior system 测序读长在 400bp 左右，通量在 35m。文库构建：用 fusion primer 扩增核糖体 rna，将已扩增的 rrna 直接做乳液 pcr，在 gs flx+ 和 gs junior 系统上进行测序。测序深度：数据分析：使用免费的软件包对微生物的种群多样性进行鉴定，并进行比较。1. megan ：一个宏基因组分析工具，可以在大量的测序数据中对测序结果进行 聚类分析。2

6、. mg-rast ：用于注释宏基因组样品的全自动软件。3. img/m：基于宏基因组序列微生物群体的功能性。4. camera ：致力于微生物生态学研究。5. carma：可以通过未拼接的序列来进行物种组成和微生物的遗传潜力的研究。 6. galaxy ：用于高等真核生物的研究，例如昆虫等。7. greengenes ：16s rrna 的数据库，可以用来做 16s rrna 的比对。8. qiime：针对 454 测序数据的宏基因组分析。9. the ribosome database project （rdp）：针对焦磷酸测序的分析方法。 miseq platform ：miseq 平台

7、读长可以是 2x250bp 或 2x300bp 。使用 miseq reagent kit v2 可以产出 7.5-8.5gb 的数据，使用 miseq reagent kit v3 可以产出 13.2-15gb 的数据。文库构建：根据感兴趣的片段设计引物，通过 pcr 扩增出片段做为模板构建文库。使 用 nextera xt sample prep kit 构建文库，按照试剂盒说明书操作。将建好的 文库归一化处理并将其混到一起。在 miseq 系统里自动进行成簇反应，进而完 成测序。文库检验：用 agilent 2100 检测文库大小片段是否与预期一致。文库片段是否集中。 测序深度：16s

8、rrna 测序深度应至少在 50,000 条 reads 以上，以保证较好的覆盖度。 数据分析：对微生物生态进行定量观察greengenes ：16s rrna 基因数据库和分析工具；宏基因组分析工具：megan核糖体数据库计划(rdp)ion torrent platform ：ion torrent 平台主要有两个测序系统： ion pgm system 和 ion proton system 。ion pgm 有两种读长， 200bp 和 400bp ，ion pgm 主要应用三种芯片，ion 314 chip ，ion 316 chip 和 ion 318 chip ，最多数据产出可以

9、达到 2gb。 ion proton 读长为 200bp ，最多数据产出可达到 10gb。文库构建：使用 ion plus fragment library kit 为 16s rrna 扩增产物加上 barcode 标签，一共有 96 个 barcode 可以选择。加上标签后使用 ion pgm template ot2 200 kit 在 ion onetouch dl system 上进行乳液 pcr，完成文库构建。测序时 根据需要不同的读长选择不同的测序试剂盒。测序深度：对于人体肠道微生物 16s rrna 测序，对于检测高丰度的样品，每个样品至 少要测 10000 条 reads，而

10、对于检测低丰度的样品，则需要 1,000,000 以上的 reads 数。2) 全宏基因组测序 whole-metagenomics sequencing roche 454 platform:文库构建：提取宏基因组 dna，总量不低于 10ug，且样品 dna 应相对完整。使用 gs flx titanium rapid library preparation kit 构建文库，按照说明书进行相应操 作。文库检验：dna reads 数与微球的比例在 8%左右，可以达到比较理想的测序结果。 测序深度：每个样品应至少保证 10,000 条以上的 reads 数。hiseq platform:h

11、iseq 平台主要有 hiseq 2000 和 hiseq 2500 两个测序系统。hiseq 2000 测序读长是 2x100bp paired-end 测序，一次运行通量可达 600gb 以上， hiseq 2500 有两种运行模式：快速运行和高通量，快速运行可以达到 2x150bp，产生 最多 180gb 的数据，高通量读长在 2x125bp，数据产出在 600gb 以上。 文库构建：将提取的宏基因组 dna 用 covaris m220 片段化后，使用 truseq dna xt/ltsample prep kit (illumina) 按照 protocol 进行文库构建，dna 起始投入量应 在 1ug 以上。文库检验：将建好的宏基因组文库使用kapa sybr fast abi prism 2x qpcrmaster mix (kapa biosystems) 试剂盒