WB实验步骤详细总结

1、蛋 白 提 取 （所 有 操 作 在 冰 上 进 行）1. 裂解1）配裂解液：PMSF=100 : 1 ,（裂解液和PMSF在-20C保存，提前一天 4C解冻） 取2ml裂解液，加20卩1PMSF混匀2）称取30mg组织，切碎放入标记好的 AP管中，加入600卩I上述1中液体（加入液 体与组织比例为 20： 1）,冰上静置10min2. 匀浆先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s,两次（间隔5s）,冰上静置30min3. 离心（在基础4楼416室）1）自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（，两个标记，加少量超纯

2、水，号是为了离心平衡，对称放置）2）将离心机预冷至 4 C为止，以1200 x 10r/min离心15min3）用移液枪将上层清液取出放入号管中4. 变性（上样缓冲液：样品=4: 1）将样品转移至23个0.5mlAP管中加上样缓冲液，100 C变性10mi n仪器屏幕：温度（C）5. 保存S5变性结束S5100 000： 10后，打开AP管盖放一ff下气，然后4 C保存，点样是取出即可用|WB实验步骤1. 清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干， 将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。2. 配制分离胶1）准备：1ml枪（蓝色枪头），200卩I枪（黄色枪头）10卩I （白色枪头）2）

3、10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）5.91ml超纯水4.95ml丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效3.75mlPh8.8Tris?HCL150 l10%SDS150 lAP （催化剂促凝作用）9 3 lTEMED混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡）3. 灌胶沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4. 水封5.6.1)2)3)7.1)2)3)4)5)8.9.立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，

4、等待20-30mi n浓缩胶的配制（5%）4.13ml超纯水1ml丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效750 卩 lPh6.8Tris?HCL60卩l10%SDS60 lAP （催化剂促凝作用）6卩lTEMED搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝胶30min或20min电泳（电泳液最多使用两次）安装电泳装置低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔 岀防止拔歪）点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）Mark4 g l（Proternladder）推荐9 g，实际4 g已经足够样品8 g l7-10 g l均可内参挑齐即可组数少时尽量靠

5、中间点样，边缘易跑歪连接电泳仪电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳先调电压至70mV，跑约20min。（Mark跑开，分出彩带即可）再调电压至120mV，跑约60min。（不能跑过下面的玻璃板）注：Mark的条带从红色条带往下依次为：70-55-40-35-20,待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪L段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸 泡转膜（转移液可用3-4次）剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终保持湿润）剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PV

6、DF膜），然后用甲醇活化10s以上“夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸-胶-膜-两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动）打开开关，调节电流至 100mA，转膜2h （恒流）盆中加满冰转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色封闭1）配制5%脱脂奶粉：2.5g脱脂奶粉50mlTBST小烧杯中混匀加入皿中2）将膜取出放入上述加入了 5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇 60min （转移液回收其余清理掉，转移 液可以重复利用2次）一抗1） 用TBST配，每一

7、格加5mlTBST,再分别加入抗体抗体的量：2l (Psmad2l)免抗1:10005 g l： 5ml58 （分子量）2l (Psmad2l)免抗1:50010卩l:5ml58Jnk免抗1:10005卩l:5ml双带内参（小鼠抗GAPH）单抗，中杉金桥1:50001 g l:5ml362）膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）3）4C冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床 416室）10.洗脱用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。11. 二抗1）用3%的脱脂奶粉1.5g的脱脂奶粉 50mlTBST2）每格吸入5ml3%脱脂奶粉，抗体杯中混匀加入皿中1:5000，即加入1卩l注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用 免抗3）膜分别加入小格，慢摇 1-2h （常温）12. 洗脱用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。13.显影:U盘所需物品1）2）3）涂在膜上4）A液，B液（显影液。4C保存）200卩l枪+ 枪头（黄）膜（置于皿中）开机后自动预冷，温度降到 1-20 C才可I显影液现配现用（A液：B液=1: 1）膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角） 用移液枪吧显影液